Pcr技术在临床实验室应用价值的评估
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2001年10月4日
今年十月,中华医学会北京分会检验专业委员会在北京举行了全国临床检验学术研讨会,下面选登部分论文。/font>
PCR技术在临床实验室应用价值的评估
北京医科大学第三医学院检验科 张捷
随着分子生物学技术的发展，PCR(polymeras chain reaction 多聚酶链反应)技术已广泛应用于遗传性疾病、肿瘤疾病及感染性疾病的诊断。如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、染色体易位的白血病及淋巴癌治疗后的残留病变、人类白细胞抗原(HLA)配型、法医学方面的鉴定工作等。本文就以下问题进行讨论：
一、是否所有的临床实验室都需要开展PCR技术或具备开展PCR的条件?是否所有的感染性疾病都需采用PCR技术检测?
二、几种定量PCR方法学的研究。
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三、PCR技术检测病原微生物的临床意义及国外临床实验室应用此技术的情况。
1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的一些问题。
PCR技术在国内临床实验室应用较为广泛，其所产生的问题也有待于解决。如对PCR仪器及操作人员的要求较高，许多实验室存在如下一些问题：
1)仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔间差。
2)自动化程度较低，人工操作的误差较大。
3)实验室布局要合理，防止空气污染。常规实验室必须在三个分开的房间进行分阶段操作，第一间实验室作为混合试剂和质控；第二间实验室用于标本提取和试剂混合；第三间实验室用于PCR扩增及产物检测，工作人员应从第一间依次到第三间实验室，不能返回工作。室内空气流向从第一间依次到第三间实验室，不能逆流。
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4)加样器及试剂等容易污染导致假阳性结果。最好用一次性有塞子的枪尖及试管，试剂应分为小包装，较快用完。
5)标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。(例检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不能是唾液)。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，使RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。
6)合理设计寡核昔酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
7)琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。例如，模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多，结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb、高浓度尿素)可出现假阴性。
目前美国病理学会(CAP)及CLIA组织要求正规检测方法是先PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室例如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们通过多年的实践，总结出来在他们的实验室里用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的两种判断结果是一致的。因为他们的PCR实验室条件要求的是非常严格的，而且他们实验室每年都要通过美国CAP的检查。2.半定量及定量PCR检测核酸的常用和研究方法
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现在定性PCR方法己不能满足许多实验的要求和临床需求，半定量及定量PCR检测DNA或RNA的方法逐渐走进实验室。例HCV一RNA、HIV一RNA的定量检测对临床治疗均有一定的帮助。
1)内对照法:将已知的目的DNA及内对照DNA混合加入两对引物同时进性PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较而确定；
2) PCR一Hyb法；
3) b一DNA法；
4) PCR定量的荧光检测。
3. PCR技术检测病原微生物的临床意义
目前对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，我们认为首选为这些技术，则不必一律采用PCR技术。在目前没有其它诊断技术可以检测的疾病例如基因缺失、易位、突变及需要培养时间较长或培养难度大的病原体，而影响临床的诊治工作时则可考虑应用PCR方法。 例如人类兔疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养或需要培养时间较长。在对人类兔疫缺陷病毒抗原(H1V一Ag)和抗体(HIV一Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品不仅检测HIV-Ab而且也检测HIV-P 24Ag。据国外学者报道，感染HIV的患者血清P24Ag出现早于HIV-Ab约10天左右。发现HIV-P24Ag阳性者，均HIV PCR阳性；但HIV PCR阳性者，HIV-p24Ag可呈现阴性，此时患者已具有传染性。除做早期诊断爱滋病以外，定量PCR对已患有HIV感染病人的治疗也是一个有效的监测手段。
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用PCR和杂交方法对HCV的基因分型、早期诊断和治疗监测也有较大的临床意义，这已被国外医学界的同仁们公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30一50天，培养出来的分枝杆菌还要进行鉴定是人型、牛型、鸟型，涂片检查所需的抗酸杆菌也需要一定的浓度，因此可以采用PCR方法检测。即便如此,PCR扩增法仍不能完全代替结核杆菌培养及难以判断的药敏结果。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。PCR检测有一定的临床意义。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体PCR检测试剂盒的应用。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16SDNA的584bp,最后带有杂交检测。
沙眼衣原体的PCR试剂盒是1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后检测用免疫化学法。但在美国通过CAP认可的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。
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但某些病毒(例CMV、EBV等)、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，复制数量要达到一定程度才考虑有临床意义。据国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本进行细菌培养结果和DNA结果不一致目前难以解释。但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内的细菌在致病。肿瘤基因的检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及愈后的评估均有效果。
近十余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。基因诊断的技术在不断改进。我们也紧跟国际发展的步伐。但此技术本身仍处于继续发展过程中，它的发展潜力是巨大的，它具有科学性、先进性，前景是好的。但问题的关键是我们如何掌握，灵活运用，合理分析解释结果,PCR实验室的认可及临床PCR试剂、实验项目的规范化。杜绝该技术被不正当的商业性质而利用。这是我们临床实验室面临解决的重要课题。对该技术的临床应用一概否定或无质量保证的开展均是不可取。
分子生物学的另一项发展，DNA芯片是近几年在极少数发达的国家出现的。生物芯片是生命科学领域中一次革命。每个芯片能够集成40万种不同的DNA片断， 100万个DNA芯片的产品也将在近期推出。它的原理是将不同序列的小片段寡核苷酸有序地固定并集成在一块玻璃或硅等固体芯片上，作为生物信息的载体进行平行处理。
DNA芯片有可能在癌症早期诊断有巨大的意义。不同病人对不同的药物敏感性不一样，主要原因是遗传敏感性有差异，如果今后病人用药前都进行DNA芯片检测，滥用药的情况则可杜绝。, http://www.100md.com
PCR技术在临床实验室应用价值的评估
北京医科大学第三医学院检验科 张捷
随着分子生物学技术的发展，PCR(polymeras chain reaction 多聚酶链反应)技术已广泛应用于遗传性疾病、肿瘤疾病及感染性疾病的诊断。如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、染色体易位的白血病及淋巴癌治疗后的残留病变、人类白细胞抗原(HLA)配型、法医学方面的鉴定工作等。本文就以下问题进行讨论：
一、是否所有的临床实验室都需要开展PCR技术或具备开展PCR的条件?是否所有的感染性疾病都需采用PCR技术检测?
二、几种定量PCR方法学的研究。
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三、PCR技术检测病原微生物的临床意义及国外临床实验室应用此技术的情况。
1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的一些问题。
PCR技术在国内临床实验室应用较为广泛，其所产生的问题也有待于解决。如对PCR仪器及操作人员的要求较高，许多实验室存在如下一些问题：
1)仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔间差。
2)自动化程度较低，人工操作的误差较大。
3)实验室布局要合理，防止空气污染。常规实验室必须在三个分开的房间进行分阶段操作，第一间实验室作为混合试剂和质控；第二间实验室用于标本提取和试剂混合；第三间实验室用于PCR扩增及产物检测，工作人员应从第一间依次到第三间实验室，不能返回工作。室内空气流向从第一间依次到第三间实验室，不能逆流。
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4)加样器及试剂等容易污染导致假阳性结果。最好用一次性有塞子的枪尖及试管，试剂应分为小包装，较快用完。
5)标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。(例检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不能是唾液)。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，使RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。
6)合理设计寡核昔酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
7)琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。例如，模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多，结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb、高浓度尿素)可出现假阴性。
目前美国病理学会(CAP)及CLIA组织要求正规检测方法是先PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室例如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们通过多年的实践，总结出来在他们的实验室里用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的两种判断结果是一致的。因为他们的PCR实验室条件要求的是非常严格的，而且他们实验室每年都要通过美国CAP的检查。2.半定量及定量PCR检测核酸的常用和研究方法
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现在定性PCR方法己不能满足许多实验的要求和临床需求，半定量及定量PCR检测DNA或RNA的方法逐渐走进实验室。例HCV一RNA、HIV一RNA的定量检测对临床治疗均有一定的帮助。
1)内对照法:将已知的目的DNA及内对照DNA混合加入两对引物同时进性PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较而确定；
2) PCR一Hyb法；
3) b一DNA法；
4) PCR定量的荧光检测。
3. PCR技术检测病原微生物的临床意义
目前对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，我们认为首选为这些技术，则不必一律采用PCR技术。在目前没有其它诊断技术可以检测的疾病例如基因缺失、易位、突变及需要培养时间较长或培养难度大的病原体，而影响临床的诊治工作时则可考虑应用PCR方法。 例如人类兔疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养或需要培养时间较长。在对人类兔疫缺陷病毒抗原(H1V一Ag)和抗体(HIV一Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品不仅检测HIV-Ab而且也检测HIV-P 24Ag。据国外学者报道，感染HIV的患者血清P24Ag出现早于HIV-Ab约10天左右。发现HIV-P24Ag阳性者，均HIV PCR阳性；但HIV PCR阳性者，HIV-p24Ag可呈现阴性，此时患者已具有传染性。除做早期诊断爱滋病以外，定量PCR对已患有HIV感染病人的治疗也是一个有效的监测手段。
, 百拇医药
用PCR和杂交方法对HCV的基因分型、早期诊断和治疗监测也有较大的临床意义，这已被国外医学界的同仁们公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30一50天，培养出来的分枝杆菌还要进行鉴定是人型、牛型、鸟型，涂片检查所需的抗酸杆菌也需要一定的浓度，因此可以采用PCR方法检测。即便如此,PCR扩增法仍不能完全代替结核杆菌培养及难以判断的药敏结果。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。PCR检测有一定的临床意义。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体PCR检测试剂盒的应用。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16SDNA的584bp,最后带有杂交检测。
沙眼衣原体的PCR试剂盒是1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后检测用免疫化学法。但在美国通过CAP认可的某些教学医院实验室也可适量检测其它项目。
, 百拇医药
但某些病毒(例CMV、EBV等)、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，复制数量要达到一定程度才考虑有临床意义。据国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本进行细菌培养结果和DNA结果不一致目前难以解释。但对有临床症状病人的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内的细菌在致病。肿瘤基因的检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及愈后的评估均有效果。
近十余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。基因诊断的技术在不断改进。我们也紧跟国际发展的步伐。但此技术本身仍处于继续发展过程中，它的发展潜力是巨大的，它具有科学性、先进性，前景是好的。但问题的关键是我们如何掌握，灵活运用，合理分析解释结果,PCR实验室的认可及临床PCR试剂、实验项目的规范化。杜绝该技术被不正当的商业性质而利用。这是我们临床实验室面临解决的重要课题。对该技术的临床应用一概否定或无质量保证的开展均是不可取。
分子生物学的另一项发展，DNA芯片是近几年在极少数发达的国家出现的。生物芯片是生命科学领域中一次革命。每个芯片能够集成40万种不同的DNA片断， 100万个DNA芯片的产品也将在近期推出。它的原理是将不同序列的小片段寡核苷酸有序地固定并集成在一块玻璃或硅等固体芯片上，作为生物信息的载体进行平行处理。
DNA芯片有可能在癌症早期诊断有巨大的意义。不同病人对不同的药物敏感性不一样，主要原因是遗传敏感性有差异，如果今后病人用药前都进行DNA芯片检测，滥用药的情况则可杜绝。, http://www.100md.com