基因治疗冠心病的研究概况
预防和治疗冠状动脉血管成形术后再狭窄
局部基因治疗的目的在于过度表达有以下作用的蛋白质：1)调节血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞周期；2)抑制VSMC的移行；3)赋予内皮细胞以其血管保护特性；4)刺激内皮的生长和血管生成。另一方面，某些措施倾向于抑制一些蛋白质的表达，而这些蛋白质被认为促进VSMC的增殖和移行。
原肿瘤基因在再狭窄的病理生理中起关键的作用。在PTCA操作造成血管壁损伤之后，生长因子附着在细胞表面的受体上，并激活原肿瘤基因，这一过程反过来刺激细胞分裂。另一方面，细胞的分裂还可受细胞周期抑制因子水平减少的刺激。抑制原肿瘤基因或增强细胞周期抑制物的作用，可防止细胞分裂，从而减少再狭窄的发生率。
可能的基因疗法
1、 细胞分裂的抑制 反义寡核苷酸，如用针对原肿瘤基因，如c-myb和c-myc增殖细胞核抗原和细胞周期调节基因的反义寡核苷酸，可起到一种诱饵的作用，并抑制细胞分裂的激活。用反义寡核苷酸的动物实验研究取得的结果各异。在人类的研究正在进行中。
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2、 抑制细胞增殖疗法 这种疗法是在不使细胞死亡的情况下抑制细胞分裂，其主要的目标是促进抑制细胞分裂周期基因，如视网膜母细胞瘤基因或生长停止同源框(growth arrest homeobox，Gax)基因的表达。Gax基因是一种只在血管平滑肌和心肌细胞中才发现的细胞周期抑制物。当在动物模型中发生动脉损伤时，Gax的表达减少。在一种颈动脉损伤模型，用腺病毒载体转染了Gax基因后，导致了新内膜增殖的减少。
3、 视网膜母细胞瘤基因(Rb) 此基因在正常情况下抑制细胞周期。有人已用腺病毒载体转移低磷酸化的Rb基因(高度磷酸化之后便释放转录因子即E2F，激活细胞周期)证实，可减少新内膜的增厚。有人用一种寡核苷酸竞争性地结合E2F，抑制其激活原肿瘤基因如c-myc、c-myb、CdC2以及增殖细胞核抗原的能力。在大鼠颈动脉模型，这种疗法导致了损伤后8周新内膜增生的减少。
4、细胞毒性治疗 这种治疗是以选择性方式来破坏正在增殖的平滑肌细胞。这一措施的原型例子是单纯疱疹病毒1型的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)。这种基因在用更昔洛韦治疗后可被转染到平滑肌细胞中去。HSV-tk基因可使更昔洛韦磷酸化，创造出一种有毒性的核苷类似物，而这种物质能破坏正在增殖的细胞，对静止的细胞则无作用。在再狭窄的动物模型，用HSV-tk基因治疗引起了新内膜增生的减少。
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5、血管生成治疗 一氧化氮(NO)合酶基因已在人体试验中鉴定，NO是内皮来源的松弛因子，其特点是使血管扩张和抑制血小板凝聚。初步试验包括：成功的体外该基因在血管平滑肌细胞中的表达，以及在造成大鼠颈动脉的磨擦伤之后向管腔内递送这种基因。其结果引起了NO合酶的增多、改善了血管运动，并且减少了新内膜的增殖。
动物实验研究
球囊血管成形术等治疗措施不可避免地损伤冠状动脉内膜，甚至中层。术后大多发生再狭窄。PTCA后再狭窄形成的原因是：由于平滑肌细胞增殖和由于细胞外基质的合成而致的新内膜的增生造成。到目前为止，临床上已经证实有效的预防再狭窄的措施只有血管内放射治疗。但放射治疗尚有损伤周围组织、出现新的狭窄(特别是在放射治疗的血管段的两端，因放射剂量可能不足以抑制细胞增生而导致狭窄,——根据King教授的大会报告， 参看《中国医学论坛报》，2000年1月6日)等问题。因此，有人采用不同的抑制增生物质的基因，试图阻止再狭窄。这类物质有以下几种。
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1) 动脉内膜的损伤(如PTCA等)可造成再狭窄, 而杀菌肽(cecropin)这类物质有抗微生物及抑制增生作用。这种物质是某些昆虫(包括蚕)的体内及猪的小肠中存在的具有抗菌及抑制增生作用的肽，是体液免疫的一部分。这些肽及其未成熟型物质如前原杀菌肽(pre-pro-cecropins),对哺乳动物细胞有抑制细胞分裂周期的作用。用其基因可减少细胞增殖。
前原杀菌肽抑制细胞周期已得到充分证实(如在白血病、淋巴瘤、膀胱癌细胞等)。其作用机制可能是使线粒体的呼吸(链)中断、抑制蛋白质向线粒体的转运、从而减少能量产生、最终抑制细胞分裂。成熟的杀菌肽的作用方式与前原杀菌肽的不同，前者被带负电荷的细胞膜吸附，导致碱性N端区的α螺旋构型，聚集并通过造成膜孔形成，发挥细胞毒性作用。而未成熟型物质则无细胞毒性作用，只有抑制细胞周期的作用。
Nikol等对猪造成实验性动脉内膜损伤后，用一种带注射针头的导管将含有前原杀菌肽 A基因的质粒(与脂质体相混合)注射到病变血管周围, 21天后显著地减少了新内膜的形成(P< 0.05)。基因只在动脉壁有表达(只测定出其mRNA,未测蛋白质，因尚无抗体)。
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2)在新内膜形成过程中,有动脉中层平滑肌细胞的增生, 而Gax转录因子(transcription factor)的过度表达可抑制其增生。以重组Gax基因的腺病毒载体呈递该基因到大鼠颈动脉后3、7、14天，可见中层平滑肌细胞数显著减少, 增殖细胞核抗原(PCNA)的表达被完全阻止；而TUNEL阳性中层血管平滑肌细胞增多。这表明细胞增殖停止，并且有大量细胞发生凋亡。
3)用视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)抑制平滑肌的增殖。
4)用HSV-tk基因使正在增殖的细胞对细胞毒性物质变得敏感， 从而允许使用选择性化疗。
5)用VEGF基因促进内皮再形成。
6)针对血管损伤后平滑肌增生，有人用细胞周期特异性蛋白质P21, delta Rb和HSV-tk进行基因治疗的实验。这类研究的结果表明，在数个种属动物正在繁殖的平滑肌细胞和巨噬细胞在体内均受抑制。
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有研究者将针对细胞周期蛋白(cyclin)B1的磷酸氰氢酸(phosphorothionate)反义寡核苷酸和为CDC2-激酶编码的基因转移至用球囊损伤了的大鼠颈动脉内，作为实验性再狭窄的一种潜在的疗法。转染后2周，针对CDC2激酶或细胞周期蛋白B1的这种反义寡核苷酸治疗引起了部分的但是显著的对新内膜形成的抑制。相反，无论是顺义寡核苷酸或是混合的对照寡核苷酸都无效。有趣的是，与其中任何一种基因靶单独阻滞相比，将针对CDC2激酶和细胞周期蛋白B的反义寡核苷酸协同转染，引起了新内膜形成的进一步的抑制。这些结果证实：HVJ-脂质体介导的针对CDC2激酶和细胞周期蛋白B1的反义寡核苷酸的使用，引起对球囊损伤后新内膜形成的持久的抑制。
7)直接将NO合酶转移到血管壁使NO产生增多，可能代表对血管增生性疾病的一种强有力的疗法。此研究使猪的冠状动脉段在37℃暴露于编码牛内皮细胞NO合酶的复制缺陷型腺病毒或对照1小时。然后用针对NO合酶的单抗以免疫组化方法测定动脉组织中该酶(内皮和外层中显著增多)、测定局部产生的NO量(显著增多)、以及测定经前列腺素F2α处理后血管张力的变化(显著减低，P=0.05)。预先将血管在NG-单甲基-L-精氨酸孵育，可消除这一效果。结论是，用该方法可成功地转移NO合酶，得到了免疫组化和其他测定的证实。
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8)原肿瘤基因(proto-oncogene)在冠状动脉再狭窄中可能起重要的作用。用反义寡核苷酸抑制原肿瘤基因的表达，有可能防止再狭窄。另外，用分子诱饵(decoy)或药理治疗阻断细胞周期进展所需要的特异步骤，以及转移肿瘤抑制基因，也有可能防止再狭窄。在动物模型中已经显示了这类策略的明显成功。这些分子疗法在预防球囊血管成形术和血管支架置入后的内膜增殖和再狭窄中的作用是有价值的。
9)已有人用腺病毒及其他载体证实，编码细胞溶解性(胸腺嘧啶激酶)或细胞抑制(低磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白、内皮NO合酶、Gax等)产物的治疗性基因，成功地抑制了平滑肌细胞的增殖和相关的内膜增生。
有人试图改变动脉壁细胞基因的表达，以抑制血栓形成和平滑肌的激活。Flugelman等用了遗传上修饰了的内皮细胞以播种血管内假体(prosthesis),并在体外和体内测试了细胞对假体的黏附。他们试图在动物实验中证实：1离体基因转移(在体外对血管平滑肌细胞进行逆转录病毒转染，然后将这些细胞“种植”于支架表面)；2体内血管内病毒载体直接转移(用前后式双球囊封闭一段血管腔，然后高压转移30分钟)的效果。
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结果表明，支架表面种植的细胞在支架展开并经2小时的液流实验后，支架表面仍有80%的细胞，且有增殖能力及典型形态，并且在59%±39%的表面积上可测定出转染基因(所用的基因是表达人tPA的基因和新霉素磷酸转移酶基因)。
体内试验结果表明，双球囊高压转移，无论在完好的动脉或在球囊损伤动脉，双囊之间69%～98%的动脉段内膜上有转移物质(以荧光素及墨汁染色颗粒为指标)，外膜的19%～55%段亦有颗粒。中层则很少(0～5%)。(所研究的是来自18根动脉的227张切片。)腺病毒溶液经双囊注入后，在高压(5个大气压)转移后，中层有受转染细胞，但有多处细胞坏死及内皮细胞完全丧失。这证明了如果不使内皮细胞裸露, 并作高压注射的话，病毒颗粒不能穿透内皮层。不稳定型心绞痛病人冠脉平滑肌细胞中证实有酸性和碱性FGF表达。
(未完待续)
(映月) , http://www.100md.com
局部基因治疗的目的在于过度表达有以下作用的蛋白质：1)调节血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞周期；2)抑制VSMC的移行；3)赋予内皮细胞以其血管保护特性；4)刺激内皮的生长和血管生成。另一方面，某些措施倾向于抑制一些蛋白质的表达，而这些蛋白质被认为促进VSMC的增殖和移行。
原肿瘤基因在再狭窄的病理生理中起关键的作用。在PTCA操作造成血管壁损伤之后，生长因子附着在细胞表面的受体上，并激活原肿瘤基因，这一过程反过来刺激细胞分裂。另一方面，细胞的分裂还可受细胞周期抑制因子水平减少的刺激。抑制原肿瘤基因或增强细胞周期抑制物的作用，可防止细胞分裂，从而减少再狭窄的发生率。
可能的基因疗法
1、 细胞分裂的抑制 反义寡核苷酸，如用针对原肿瘤基因，如c-myb和c-myc增殖细胞核抗原和细胞周期调节基因的反义寡核苷酸，可起到一种诱饵的作用，并抑制细胞分裂的激活。用反义寡核苷酸的动物实验研究取得的结果各异。在人类的研究正在进行中。
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2、 抑制细胞增殖疗法 这种疗法是在不使细胞死亡的情况下抑制细胞分裂，其主要的目标是促进抑制细胞分裂周期基因，如视网膜母细胞瘤基因或生长停止同源框(growth arrest homeobox，Gax)基因的表达。Gax基因是一种只在血管平滑肌和心肌细胞中才发现的细胞周期抑制物。当在动物模型中发生动脉损伤时，Gax的表达减少。在一种颈动脉损伤模型，用腺病毒载体转染了Gax基因后，导致了新内膜增殖的减少。
3、 视网膜母细胞瘤基因(Rb) 此基因在正常情况下抑制细胞周期。有人已用腺病毒载体转移低磷酸化的Rb基因(高度磷酸化之后便释放转录因子即E2F，激活细胞周期)证实，可减少新内膜的增厚。有人用一种寡核苷酸竞争性地结合E2F，抑制其激活原肿瘤基因如c-myc、c-myb、CdC2以及增殖细胞核抗原的能力。在大鼠颈动脉模型，这种疗法导致了损伤后8周新内膜增生的减少。
4、细胞毒性治疗 这种治疗是以选择性方式来破坏正在增殖的平滑肌细胞。这一措施的原型例子是单纯疱疹病毒1型的胸腺嘧啶激酶基因(HSV-tk)。这种基因在用更昔洛韦治疗后可被转染到平滑肌细胞中去。HSV-tk基因可使更昔洛韦磷酸化，创造出一种有毒性的核苷类似物，而这种物质能破坏正在增殖的细胞，对静止的细胞则无作用。在再狭窄的动物模型，用HSV-tk基因治疗引起了新内膜增生的减少。
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5、血管生成治疗 一氧化氮(NO)合酶基因已在人体试验中鉴定，NO是内皮来源的松弛因子，其特点是使血管扩张和抑制血小板凝聚。初步试验包括：成功的体外该基因在血管平滑肌细胞中的表达，以及在造成大鼠颈动脉的磨擦伤之后向管腔内递送这种基因。其结果引起了NO合酶的增多、改善了血管运动，并且减少了新内膜的增殖。
动物实验研究
球囊血管成形术等治疗措施不可避免地损伤冠状动脉内膜，甚至中层。术后大多发生再狭窄。PTCA后再狭窄形成的原因是：由于平滑肌细胞增殖和由于细胞外基质的合成而致的新内膜的增生造成。到目前为止，临床上已经证实有效的预防再狭窄的措施只有血管内放射治疗。但放射治疗尚有损伤周围组织、出现新的狭窄(特别是在放射治疗的血管段的两端，因放射剂量可能不足以抑制细胞增生而导致狭窄,——根据King教授的大会报告， 参看《中国医学论坛报》，2000年1月6日)等问题。因此，有人采用不同的抑制增生物质的基因，试图阻止再狭窄。这类物质有以下几种。
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1) 动脉内膜的损伤(如PTCA等)可造成再狭窄, 而杀菌肽(cecropin)这类物质有抗微生物及抑制增生作用。这种物质是某些昆虫(包括蚕)的体内及猪的小肠中存在的具有抗菌及抑制增生作用的肽，是体液免疫的一部分。这些肽及其未成熟型物质如前原杀菌肽(pre-pro-cecropins),对哺乳动物细胞有抑制细胞分裂周期的作用。用其基因可减少细胞增殖。
前原杀菌肽抑制细胞周期已得到充分证实(如在白血病、淋巴瘤、膀胱癌细胞等)。其作用机制可能是使线粒体的呼吸(链)中断、抑制蛋白质向线粒体的转运、从而减少能量产生、最终抑制细胞分裂。成熟的杀菌肽的作用方式与前原杀菌肽的不同，前者被带负电荷的细胞膜吸附，导致碱性N端区的α螺旋构型，聚集并通过造成膜孔形成，发挥细胞毒性作用。而未成熟型物质则无细胞毒性作用，只有抑制细胞周期的作用。
Nikol等对猪造成实验性动脉内膜损伤后，用一种带注射针头的导管将含有前原杀菌肽 A基因的质粒(与脂质体相混合)注射到病变血管周围, 21天后显著地减少了新内膜的形成(P< 0.05)。基因只在动脉壁有表达(只测定出其mRNA,未测蛋白质，因尚无抗体)。
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3)用视网膜母细胞瘤基因(Rb基因)抑制平滑肌的增殖。
4)用HSV-tk基因使正在增殖的细胞对细胞毒性物质变得敏感， 从而允许使用选择性化疗。
5)用VEGF基因促进内皮再形成。
6)针对血管损伤后平滑肌增生，有人用细胞周期特异性蛋白质P21, delta Rb和HSV-tk进行基因治疗的实验。这类研究的结果表明，在数个种属动物正在繁殖的平滑肌细胞和巨噬细胞在体内均受抑制。
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有研究者将针对细胞周期蛋白(cyclin)B1的磷酸氰氢酸(phosphorothionate)反义寡核苷酸和为CDC2-激酶编码的基因转移至用球囊损伤了的大鼠颈动脉内，作为实验性再狭窄的一种潜在的疗法。转染后2周，针对CDC2激酶或细胞周期蛋白B1的这种反义寡核苷酸治疗引起了部分的但是显著的对新内膜形成的抑制。相反，无论是顺义寡核苷酸或是混合的对照寡核苷酸都无效。有趣的是，与其中任何一种基因靶单独阻滞相比，将针对CDC2激酶和细胞周期蛋白B的反义寡核苷酸协同转染，引起了新内膜形成的进一步的抑制。这些结果证实：HVJ-脂质体介导的针对CDC2激酶和细胞周期蛋白B1的反义寡核苷酸的使用，引起对球囊损伤后新内膜形成的持久的抑制。
7)直接将NO合酶转移到血管壁使NO产生增多，可能代表对血管增生性疾病的一种强有力的疗法。此研究使猪的冠状动脉段在37℃暴露于编码牛内皮细胞NO合酶的复制缺陷型腺病毒或对照1小时。然后用针对NO合酶的单抗以免疫组化方法测定动脉组织中该酶(内皮和外层中显著增多)、测定局部产生的NO量(显著增多)、以及测定经前列腺素F2α处理后血管张力的变化(显著减低，P=0.05)。预先将血管在NG-单甲基-L-精氨酸孵育，可消除这一效果。结论是，用该方法可成功地转移NO合酶，得到了免疫组化和其他测定的证实。
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8)原肿瘤基因(proto-oncogene)在冠状动脉再狭窄中可能起重要的作用。用反义寡核苷酸抑制原肿瘤基因的表达，有可能防止再狭窄。另外，用分子诱饵(decoy)或药理治疗阻断细胞周期进展所需要的特异步骤，以及转移肿瘤抑制基因，也有可能防止再狭窄。在动物模型中已经显示了这类策略的明显成功。这些分子疗法在预防球囊血管成形术和血管支架置入后的内膜增殖和再狭窄中的作用是有价值的。
9)已有人用腺病毒及其他载体证实，编码细胞溶解性(胸腺嘧啶激酶)或细胞抑制(低磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白、内皮NO合酶、Gax等)产物的治疗性基因，成功地抑制了平滑肌细胞的增殖和相关的内膜增生。
有人试图改变动脉壁细胞基因的表达，以抑制血栓形成和平滑肌的激活。Flugelman等用了遗传上修饰了的内皮细胞以播种血管内假体(prosthesis),并在体外和体内测试了细胞对假体的黏附。他们试图在动物实验中证实：1离体基因转移(在体外对血管平滑肌细胞进行逆转录病毒转染，然后将这些细胞“种植”于支架表面)；2体内血管内病毒载体直接转移(用前后式双球囊封闭一段血管腔，然后高压转移30分钟)的效果。
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结果表明，支架表面种植的细胞在支架展开并经2小时的液流实验后，支架表面仍有80%的细胞，且有增殖能力及典型形态，并且在59%±39%的表面积上可测定出转染基因(所用的基因是表达人tPA的基因和新霉素磷酸转移酶基因)。
体内试验结果表明，双球囊高压转移，无论在完好的动脉或在球囊损伤动脉，双囊之间69%～98%的动脉段内膜上有转移物质(以荧光素及墨汁染色颗粒为指标)，外膜的19%～55%段亦有颗粒。中层则很少(0～5%)。(所研究的是来自18根动脉的227张切片。)腺病毒溶液经双囊注入后，在高压(5个大气压)转移后，中层有受转染细胞，但有多处细胞坏死及内皮细胞完全丧失。这证明了如果不使内皮细胞裸露, 并作高压注射的话，病毒颗粒不能穿透内皮层。不稳定型心绞痛病人冠脉平滑肌细胞中证实有酸性和碱性FGF表达。
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