丹参预给药对缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉内皮和过氧化物产生动态的影响
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为了探讨丹参预给药改善缺血再灌注后微循环障碍的原理，我们研究了缺血再灌注后细静脉内皮细胞和过氧化物产生动态的变化及丹参预给药的影响。
材料和方法
动物及缺血再灌注微循环障碍的模型建立 取庆应义塾大学医学部实验动物中心饲养的Wistar雄性大鼠，按30 mg/kg的剂量腹腔注射sodium pentobarbital进行麻醉。从右侧颈静脉插入并留置3G聚乙烯管。沿腹正中线作2～3 cm长的切口，轻柔地把近回盲部的回肠移至腹腔外，将肠系膜在附有薄玻片的台板上展开。为维持温度和湿度，在展开的肠系膜的表面连续滴加37℃的Krebs-Ringer缓冲液。肠系膜微循环的动态，用置于37℃恒温槽内的倒置生物显微镜(Diaphot TMD-2S,Nikon，东京)观察，S-VHS录像机录像。
选直径在30～40 μm之间的细静脉(长200 μm以上)，经10分钟基础观察之后，用4G聚乙烯管将还流于观察部的肠系膜动静脉血管，同时结扎10分钟(缺血)，解除结扎(再灌注)，将时间记录仪调至0处，在同一视野连续观察30分钟。正常对照组不进行缺血再灌注处理。丹参预给药组，给药方法和给药量同本报3月7日第9版介绍。
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细静脉内皮损伤的动态观察：在缺血再灌注处理之前，经颈静脉，按30 mg/kg的用量，缓慢静注monastral biue B(MBB,Sigma,USA)。MBB是大分子蓝色染料。因MBB不能透过血管基底膜，可以堆积在损伤的血管内皮和基底膜之间，所以，在显微镜下呈MBB蓝染的部位可视为血管内皮细胞损伤部位。用连接于倒置生物显微镜的高感度CCD摄像系统(CC-090,Flovel，东京)，在监视器显示屏上观察缺血再灌注10分前、再灌注0分、10分、20分、30分等时相的细静脉MBB蓝染部位，计算200μm细静脉上MBB蓝染的长度，以动态地表示细静脉损伤状况。
细静脉壁过氧化物产生动态的观察：在缺血再灌注前，将10 μmol浓度的过氧化物感受性发光物质dihydorhodamine 123液(DHR，Molecular probes,USA)持续地滴加在观察部位的肠系膜表面，DHR可以渗透到各细胞内，结合在线粒体膜上。当过氧化物与DHR相遇时，可将DHR还原成dorhodamine 123，用荧光显微摄像系统(C-2400-08，浜松フオトニクス，浜松)在波长为420～490nm,emmission 520nm的条件下激发荧光发光，观察并记录DHR的荧光强度。用影像数字化处理系统(NIH lmage 1.35)经时地测定细静脉壁及肠系膜组织的DHR荧光强度，以缺血再灌注前细静脉壁的DHR荧光强度减去肠系膜组织的DHR荧光强度所得的值为基础值；用再灌注后各时相所测得的值与基础值的比，表示DHR荧光强度的变化，以此判定细静脉壁过氧化物的产生动态。
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每组6只大鼠的各测定值用one-way analysis of variance(ANOVA)处理，Fisher's post hoc test检验。各组数值用x±sx表示，设P < 0.05为有显著意义。
结 果
图1 丹参预给药组在各时相对细静脉MBB蓝染的抑制作用
图2
荧光摄影显示缺血再灌注前的透光像
图3 荧光摄影显示缺血再灌注开始时的荧光像
图4 荧光摄影显示缺血再灌注10分钟的荧光像
图5 3组各时相对细静脉血管壁的DHR荧光强度的变化
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细静脉内皮损伤的变化：缺血再灌注之前，正常对照组、缺血再灌注组、丹参预给药组均没有观察到细静脉的MBB蓝染。正常对照组在本观察期间内没有观察到细静脉的MBB蓝染。缺血再灌注组在再灌注开始时，细静脉的MBB蓝染部位已显著地增加，即细静脉内皮细胞再灌注开始时，已出现损伤；随着再灌注时间的延长，内皮细胞损伤也随之加重。而丹参预给药，在缺血再灌注开始、及再灌注10分、20分、30分钟后，均显著地抑制了细静脉的MBB蓝染(图1)。提示丹参预给药既可显著地抑制缺血期的细静脉损伤，又可抑制再灌注后的细静脉损伤，有保护细静脉内皮细胞的作用。
细静脉壁过氧化物产生动态的变化：图2是用透射光摄得的缺血再灌注之前肠系膜细动脉(图下方较细的血管)和细静脉(图上方较粗的血管)。图3是荧光摄影系统摄得的再灌注开始时的图像，没有观察到DHR荧光的明显发光部位。图4是荧光摄影系统摄得的再灌注后9分39秒时摄取的DHR荧光发光图像，可以观察到沿静脉血管壁的DHR荧光发光部位。
统计各组各时相沿细静脉血管壁的DHR荧光强度的变化，如图5所示。缺血再灌注之前，正常对照组、缺血再灌注组、丹参预给药组均没有观察到DHR荧光的明显发光。正常对照组在本观察的期间内没有观察细静脉壁的DHR荧光强度的明显变化。缺血再灌注组在再灌注开始时，没有观察到细静脉壁的DHR荧光强度的明显变化；再灌注10分钟时，细静脉壁的DHR荧光强度明显增加，并随着再灌注时间的延长，DHR荧光强度持续增加，即缺血再灌注引起了细静脉内皮过氧化物产生量的增加。丹参预给药组，在再灌注10分、20分、30分钟各时相的细静脉壁的DHR荧光强度均显著地低于缺血再灌注组。即丹参预给药可以抑制由缺血再灌注引起的细静脉内皮过氧化物的产生。
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讨 论
本报3月7日第9版报道了丹参可以改善缺血再灌注后的细静脉红细胞流速。
本研究我们用MBB活体染色法，连续地观察了缺血再灌注后肠系膜细静脉内皮细胞的状态。发现缺血可以引起肠系膜细静脉内皮的损伤，而且，再灌注可以加重细静脉内皮的损伤。同时，我们用可视的DHR荧光发光法，连续地观察了缺血再灌注后 肠系膜细静脉管壁(主要是内皮细胞)的过氧化物产生动态。结果表明，细静脉管壁的过氧化物在再灌注后10分钟后显著增加。
本研究在缺血期结束再灌流开始时，没有测到DHR荧光发光强度的变化，而此时细静脉内皮细胞已发生了损伤。这一结果提示，缺血可以引起细静脉内皮细胞的损伤，这一时期的细静脉内皮细胞损伤与过氧化物的过度产生没有关系。
再灌注期间，随着灌注时间的增加，细静脉内皮细胞过氧化物产生增加，细静脉内皮细胞的损伤程度也明显加重，即再灌注期间的细静脉内皮细胞损伤与过氧化物产生相关。
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本研究表明，缺血再灌注引起血管内皮细胞损伤，包括缺血期损伤和再灌注期损伤。缺血期损伤与过氧化物的过度产生不相关，再灌注期损伤与过氧化物的过度产生相关。
丹参预给药可抑制细静脉内皮细胞过氧化 物的产生，因而，可以减轻脂质过氧化导致血管内皮等细胞损伤。同时，丹参预给药对缺血期间的血管内皮细胞损伤也有保护作用。即丹参既有保护血管内皮细胞作用，又有抑制细静脉内皮细胞过氧化物产生的作用。丹参预给药改善缺血再灌注后微循环障碍的作用与其保护血管内皮细胞和抑制内皮细胞过氧化物产生有关。
缺血再灌注产生的过氧化物，一部分原于血管内皮细胞的xanthine oxidase，而另一部分则原于活化的白细胞。所以，我们进一步观察了丹参预给药对缺血再灌注后白细胞与细静脉内皮粘附，及对血管通透性的影响。, http://www.100md.com
材料和方法
动物及缺血再灌注微循环障碍的模型建立 取庆应义塾大学医学部实验动物中心饲养的Wistar雄性大鼠，按30 mg/kg的剂量腹腔注射sodium pentobarbital进行麻醉。从右侧颈静脉插入并留置3G聚乙烯管。沿腹正中线作2～3 cm长的切口，轻柔地把近回盲部的回肠移至腹腔外，将肠系膜在附有薄玻片的台板上展开。为维持温度和湿度，在展开的肠系膜的表面连续滴加37℃的Krebs-Ringer缓冲液。肠系膜微循环的动态，用置于37℃恒温槽内的倒置生物显微镜(Diaphot TMD-2S,Nikon，东京)观察，S-VHS录像机录像。
选直径在30～40 μm之间的细静脉(长200 μm以上)，经10分钟基础观察之后，用4G聚乙烯管将还流于观察部的肠系膜动静脉血管，同时结扎10分钟(缺血)，解除结扎(再灌注)，将时间记录仪调至0处，在同一视野连续观察30分钟。正常对照组不进行缺血再灌注处理。丹参预给药组，给药方法和给药量同本报3月7日第9版介绍。
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细静脉内皮损伤的动态观察：在缺血再灌注处理之前，经颈静脉，按30 mg/kg的用量，缓慢静注monastral biue B(MBB,Sigma,USA)。MBB是大分子蓝色染料。因MBB不能透过血管基底膜，可以堆积在损伤的血管内皮和基底膜之间，所以，在显微镜下呈MBB蓝染的部位可视为血管内皮细胞损伤部位。用连接于倒置生物显微镜的高感度CCD摄像系统(CC-090,Flovel，东京)，在监视器显示屏上观察缺血再灌注10分前、再灌注0分、10分、20分、30分等时相的细静脉MBB蓝染部位，计算200μm细静脉上MBB蓝染的长度，以动态地表示细静脉损伤状况。
细静脉壁过氧化物产生动态的观察：在缺血再灌注前，将10 μmol浓度的过氧化物感受性发光物质dihydorhodamine 123液(DHR，Molecular probes,USA)持续地滴加在观察部位的肠系膜表面，DHR可以渗透到各细胞内，结合在线粒体膜上。当过氧化物与DHR相遇时，可将DHR还原成dorhodamine 123，用荧光显微摄像系统(C-2400-08，浜松フオトニクス，浜松)在波长为420～490nm,emmission 520nm的条件下激发荧光发光，观察并记录DHR的荧光强度。用影像数字化处理系统(NIH lmage 1.35)经时地测定细静脉壁及肠系膜组织的DHR荧光强度，以缺血再灌注前细静脉壁的DHR荧光强度减去肠系膜组织的DHR荧光强度所得的值为基础值；用再灌注后各时相所测得的值与基础值的比，表示DHR荧光强度的变化，以此判定细静脉壁过氧化物的产生动态。
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每组6只大鼠的各测定值用one-way analysis of variance(ANOVA)处理，Fisher's post hoc test检验。各组数值用x±sx表示，设P < 0.05为有显著意义。
结 果
图1 丹参预给药组在各时相对细静脉MBB蓝染的抑制作用
图2
荧光摄影显示缺血再灌注前的透光像
图3 荧光摄影显示缺血再灌注开始时的荧光像
图4 荧光摄影显示缺血再灌注10分钟的荧光像
图5 3组各时相对细静脉血管壁的DHR荧光强度的变化
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细静脉内皮损伤的变化：缺血再灌注之前，正常对照组、缺血再灌注组、丹参预给药组均没有观察到细静脉的MBB蓝染。正常对照组在本观察期间内没有观察到细静脉的MBB蓝染。缺血再灌注组在再灌注开始时，细静脉的MBB蓝染部位已显著地增加，即细静脉内皮细胞再灌注开始时，已出现损伤；随着再灌注时间的延长，内皮细胞损伤也随之加重。而丹参预给药，在缺血再灌注开始、及再灌注10分、20分、30分钟后，均显著地抑制了细静脉的MBB蓝染(图1)。提示丹参预给药既可显著地抑制缺血期的细静脉损伤，又可抑制再灌注后的细静脉损伤，有保护细静脉内皮细胞的作用。
细静脉壁过氧化物产生动态的变化：图2是用透射光摄得的缺血再灌注之前肠系膜细动脉(图下方较细的血管)和细静脉(图上方较粗的血管)。图3是荧光摄影系统摄得的再灌注开始时的图像，没有观察到DHR荧光的明显发光部位。图4是荧光摄影系统摄得的再灌注后9分39秒时摄取的DHR荧光发光图像，可以观察到沿静脉血管壁的DHR荧光发光部位。
统计各组各时相沿细静脉血管壁的DHR荧光强度的变化，如图5所示。缺血再灌注之前，正常对照组、缺血再灌注组、丹参预给药组均没有观察到DHR荧光的明显发光。正常对照组在本观察的期间内没有观察细静脉壁的DHR荧光强度的明显变化。缺血再灌注组在再灌注开始时，没有观察到细静脉壁的DHR荧光强度的明显变化；再灌注10分钟时，细静脉壁的DHR荧光强度明显增加，并随着再灌注时间的延长，DHR荧光强度持续增加，即缺血再灌注引起了细静脉内皮过氧化物产生量的增加。丹参预给药组，在再灌注10分、20分、30分钟各时相的细静脉壁的DHR荧光强度均显著地低于缺血再灌注组。即丹参预给药可以抑制由缺血再灌注引起的细静脉内皮过氧化物的产生。
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讨 论
本报3月7日第9版报道了丹参可以改善缺血再灌注后的细静脉红细胞流速。
本研究我们用MBB活体染色法，连续地观察了缺血再灌注后肠系膜细静脉内皮细胞的状态。发现缺血可以引起肠系膜细静脉内皮的损伤，而且，再灌注可以加重细静脉内皮的损伤。同时，我们用可视的DHR荧光发光法，连续地观察了缺血再灌注后 肠系膜细静脉管壁(主要是内皮细胞)的过氧化物产生动态。结果表明，细静脉管壁的过氧化物在再灌注后10分钟后显著增加。
本研究在缺血期结束再灌流开始时，没有测到DHR荧光发光强度的变化，而此时细静脉内皮细胞已发生了损伤。这一结果提示，缺血可以引起细静脉内皮细胞的损伤，这一时期的细静脉内皮细胞损伤与过氧化物的过度产生没有关系。
再灌注期间，随着灌注时间的增加，细静脉内皮细胞过氧化物产生增加，细静脉内皮细胞的损伤程度也明显加重，即再灌注期间的细静脉内皮细胞损伤与过氧化物产生相关。
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本研究表明，缺血再灌注引起血管内皮细胞损伤，包括缺血期损伤和再灌注期损伤。缺血期损伤与过氧化物的过度产生不相关，再灌注期损伤与过氧化物的过度产生相关。
丹参预给药可抑制细静脉内皮细胞过氧化 物的产生，因而，可以减轻脂质过氧化导致血管内皮等细胞损伤。同时，丹参预给药对缺血期间的血管内皮细胞损伤也有保护作用。即丹参既有保护血管内皮细胞作用，又有抑制细静脉内皮细胞过氧化物产生的作用。丹参预给药改善缺血再灌注后微循环障碍的作用与其保护血管内皮细胞和抑制内皮细胞过氧化物产生有关。
缺血再灌注产生的过氧化物，一部分原于血管内皮细胞的xanthine oxidase，而另一部分则原于活化的白细胞。所以，我们进一步观察了丹参预给药对缺血再灌注后白细胞与细静脉内皮粘附，及对血管通透性的影响。, http://www.100md.com