丹参与Sod对缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉内皮过氧化物产生的预防和清除作用
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缺血再灌注引起的微循环障碍是个复杂的损伤过程。它包括了血管内皮细胞损伤、过氧化物产生、白细胞与血管内皮粘附、肥大细胞脱颗粒、白蛋白外漏、血流速度降低等。其中，血管内皮细胞产生的过氧化物是引起微循环障碍的重要环节之一。
我们已经报告了丹参预给药有抑制缺血再灌注引起的血管内皮细胞过氧化物产生的作用。但是，在缺血再灌注之后，丹参后投入能否清除过氧化物等尚未见报道。我们还报告了超氧化物歧化酶SOD预给药可以抑制缺血再灌注引起血管内皮细胞过氧化物的产生。但是，在缺血再灌注之后，SOD后投入能否清除过氧化物等也尚未见报道。
为了比较丹参与SOD抑制和清除过氧化物的作用，我们在缺血再灌注前(观察预防作用)，及缺血再灌注10分钟后(观察清除作用)连续投入丹参或SOD，以探讨两者对缺血再灌注后大鼠肠系膜静脉过氧化物产生动态的影响。
材料和方法
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取庆应义塾大学医学部实验动物中心饲养的Wistar雄性大鼠(体重200～250g,Charles River实验动物，东京)，按30 mg/kg的剂量腹腔注射sodium pentobarbital进行麻醉。从右侧颈静脉插入并置3G聚乙烯管。沿腹正中线作2～3cm切口，轻柔地把近回盲部的回肠移至腹腔外，将肠系膜在附有薄玻片的台板上展开。为维持温度和湿度，在展开的肠系膜的表面持续滴加37℃的Krebs-Ringer缓冲液。肠系膜微循环的动态，用置于37℃恒温槽内的倒置生物显微镜(Diaphot TMD-2S,Nikon,东京)观察，并用高感度摄像机摄像，S-VHS录像机录像。
选直径在25～40 μm之间的细静脉非分支部(长200 μm以上)为观察部位。经10分钟基础观察之后，用4G聚乙烯管将观察部的肠系膜动静脉血管同时结扎10分钟(缺血)，解除结扎(再灌注)，将时间记录仪调至0处。在同一视野连续观察30分钟。
正常对照组不进行缺血再灌注处理。
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SOD预给药组：在缺血再灌注10分钟前，用连续推注器按每小时12000U/kg的给药量，经颈静脉连续注入SOD至观察结束。
丹参预给药组：在缺血再灌注10分钟前，经颈静脉缓慢推注丹参注射液1ml(1g丹参提取物/ml)，再用连续推注器按每小时1.2 g/kg的给药量，经颈静脉连续注入丹参注射剂至观察结束。
SOD后给药组：在缺血再灌注后10分钟时，用连续推注器，按每小时12000U/kg的给药量，经颈静脉连续注入SOD至观察结束。
丹参后给药组：在缺血再灌注后10分钟时，用连续推注器按每小时1.2 g/kg的给药量，经颈静脉连续注入丹参注射剂至观察结束。
细静脉壁过氧化物产生动态的观察：在缺血再灌注前，将10μmol浓度的过氧化物感受性发光物质dihydorhodamine 123液(DHR,Molecular probes,USA)持续地滴加在观察部位的肠系膜表面，用荧光显微摄像系统(C-2400-08，浜松)，在波长为420～490nm，发光波长为520nm的条件下激发荧光发光，观察并记录DHR的荧光强度。用影像数字化处理系统(NIH Image 1.35)，经时地测定细静脉壁及肠系膜组织的DHR荧光强度。以缺血再灌注前细静脉壁的DHR荧光强度减去肠系膜组织的DHR荧光强度所得的值为基础值，用再灌注后各时限所测得的值与基础值的比表示DHR荧光强度的变化，以此判定细静脉壁过氧化物的产生动态。
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每组6只大鼠的各测定值用one-way analysis of variance(ANOVA)处理，Fisher's post hoc test检验。各组数值用平均数±标准误表示，设P< 0.05为有显著意义。
结 果
与正常对照组相比*P< 0.05;
与缺血再灌组相比P< 0.05；
与SOD预给药组相比P< 0.05
图1 丹参和SOD预给药对缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉壁DHR荧光强度的影响
与正常对照组相比*P< 0.05;
与缺血再灌组相比P< 0.05；
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与SOD预给药组相比P< 0.05
图2 丹参和SOD后给药对缺血再灌注大鼠肠系膜静脉壁DHR荧光强度的影响
图1显示丹参或SOD预给药对大鼠肠系膜细静脉壁的DHR荧光强度的影响。缺血再灌注组的细静脉壁DHR荧光强度，在再灌注10、20、30分钟均显著高于正常对照组。SOD预给药组的细静脉壁DHR荧光强度，在再灌注10分钟时显著低于缺血再灌注组，与正常对照组相比无显著差异。但在再灌注20分钟时显著高于正常对照组，与缺血再灌注组相比无显著差异。在再灌注30分钟时显著低于缺血再灌注组，仍显著高于正常对照组。丹参预给组的细静脉壁DHR荧光强度，在再灌注10、20、30分钟均显著低于缺血再灌注组。
图2显示丹参或SOD后给药对缺血再灌注后大鼠肠系膜细静脉壁DHR荧光强度的影响。在丹参或SOD给药之前的再灌注10分钟内，缺血再灌注组、丹参后给组，SOD后给药组的细静脉壁DHR荧光强度均显著高于正常对照组。而且，3组之间无显著差异。SOD后给药组在给药后20分钟(再灌注30分钟)时，细静脉壁DHR荧光强度显著低于缺血再灌注组，但仍显著高于正常对照组。丹参后给组在给药后20分钟(再灌注30分钟)时，细静脉壁DHR荧光强度既显著低于缺血再灌注组，又显著低于SOD后给药组。
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讨 论
本研究，通过观察丹参和SOD在缺血再灌注预给药和再灌注10分钟后给药时，大鼠肠系膜细静脉壁过氧化物产生动态的变化，发现丹参在缺血再灌注预给药有抑制细静脉壁过氧化物产生的作用，其作用效果与SOD等同。丹参在再灌注10分钟后给药有清除细静脉壁过氧化物的作用。而SOD没有表现出这一作用。
缺血时，黄嘌呤脱氢酶被水解转化成黄嘌呤氧化酶，同时三磷酸腺苷ATP分解为次黄嘌呤。在再灌注开始之后，突然大量的提供氧 ，使黄嘌呤氧化酶活性剧增，次黄嘌呤被迅速氧化，氧气被还原成超氧阴离子自由基。超氧化物歧化酶SOD的底物是超氧阴离子自由基。SOD可以将超氧阴离子歧化成过氧化氢。SOD预给药组在再灌注10分和30分钟时的细静脉壁DHR荧光强度显著低于缺血再灌注组。但因SOD对过氧化氢等过氧化物无作用，而过氧化物可使结合与细胞线粒体膜上的dihydorhodamine 123转化为荧光发光物质。本研究表明，在再灌注20分钟之后，SOD预给药组的细静脉壁DHR荧光强度显著高于正常对照组。说明SOD抑制过氧化物的作用是有限的。特别是在细静脉壁的DHR荧光强度已明显增强(即已经产生过氧化氢等过氧化物时)的缺血再灌注10分后投入SOD时，SOD虽然抑制了细静脉壁的DHR荧光强度的进一步增强，但没有使细静脉壁的DHR荧光强度减弱，即在已经有大量过氧化氢产生之后，SOD的后给药在本观察期间内没有发挥清除过氧化物的作用。可见，其仅具有将超氧阴离子自由基歧化成过氧化氢，即SOD抑制过氧化物作用是有限的。其作用的有限性与其作用靶点的单一性有关。
丹参不仅在预给药时能显著地抑制缺血再灌注后静脉壁DHR荧光强度的增强。即使在细静脉壁的DHR荧光强度已明显增强(即已经产生过氧化氢等过氧化物)的缺血再灌注10分钟后投入时，仍然可以显著地降低细静脉壁DHR荧光强度。其效果显著地优于SOD的后投入。即丹参清除过氧化物的环节可能是多途径的，既有类似于SOD样的作用，又有SOD所不具备的清除过氧化物的作用。丹参通过多环节综合作用的结果，使其不但能预防，而且能清除(治疗)缺血再灌注引起的大鼠肠系膜细静脉血管内皮产生的过氧化物。
虽然，本研究尚不能回答丹参是通过哪些环节发挥清除过氧化物作用的，但至少可以说，丹参清除过氧化物的环节比SOD多。丹参比SOD更有临床应用意义和治疗价值。, http://www.100md.com(韩晶岩 铃木秀和)