精子载体介导的人FⅧ基因可在转基因小鼠体内表达
目的 制备携带人凝血因子Ⅷ基因(FⅧ)的转基因小鼠，观察人FⅧ基因在子代转基因小鼠体内的表达情况。
方法 将B结构域缺失(Δ760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(BDD-hFⅧcDNA)亚克隆至带有Rous肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)启动子的质粒载体pRC/RSV，构建重组载体pRC/RSV-BDD-hFVⅧcDNA。用SuperFect 转染剂转染正常Bakb/C小鼠的精子。同样方法将pRC/RSV转染3只雄性小鼠的精子作为对照。利用精子载体，通过人工授精技术使母鼠受孕，观察人FⅧ在子代转基因小鼠体内的表达情况。新生小鼠出生后第4周，取约0.5～1.0 cm长的尾巴，抽提组织DNA，应用PCR和Southern bkot筛查F1代BDD-hFⅧ cDNA转基因幼鼠。在第6周，使F1代BDD-hFⅧ cDNA转基因雄鼠与正常雌鼠交配，在F2代幼鼠出生后2周，同样取约0.5～1.0 cm长的尾巴，用Southern bkot筛查F2代BDD-hFⅧ cDNA转基因鼠。分别用Northern bkot和Western bkot检测F1代和F2代幼鼠组织中BDD-hFⅧ cDNA的转录和表达。采用ELISA方法检测两代小鼠血浆中hFⅧ抗原的含量，BIA方法检测血浆中的抗-hFⅧ抑制物。同样方法检测两只正常小鼠作为对照。
结果 经人工授精后，20只子宫内注射转染过pRC/RSV BDD hFⅧcDNA精子悬液的受体母鼠中，7只受孕，受孕率为35%(7/20)。母鼠经21天怀胎，共产下11只F1代仔鼠，2只在产下后死亡，仔鼠存活率为82%(雌鼠4只，雄鼠5只)，筛检出3只转有BDD- hFⅧ cDNA的F1代幼鼠。对照组的2只母鼠共产下2只F1代小鼠，均为雌性。F2代幼鼠共8只(雌鼠5只，雄鼠3只)，筛检出2只BDD-hFⅧ cDNA转基因鼠。
3只F1代转基因鼠的脾、肝、肺和肾组织中均有BDD-hFⅧcDNA的转录和表达。3只F1代转基因鼠血浆中的人FⅧ抗原分别为8.65 ng/mk、7.84 ng/mk和8.44 ng/mk，2只F2代鼠的人FⅧ抗原分别为4.58 ng/mk和4.16 ng/mk。两代转基因鼠血浆中的抗-hFⅧ抑制物均为阴性。
结论 以精子作为载体，携带pRC/RSV-BDD-hFⅧ cDNA，可以通过人工授精技术生产转有人FⅧ基因的子代小鼠，并且能够传至第二代，在两代转基因小鼠体内表达人FⅧ。所表达的B结构域缺失(Δ760 aa～1639 aa)的人FⅧ蛋白(FⅧΔ760 aa～1639
aa)也是以重-轻链异二聚体的形式存在，并且证实小鼠在受精卵或胚胎期接触了人FⅧ基因，出生后体内没有抗-hFⅧ抑制物出现。, http://www.100md.com(上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所 尹俊 王鸿利 王学)
方法 将B结构域缺失(Δ760aa～1639aa)的人FⅧ cDNA(BDD-hFⅧcDNA)亚克隆至带有Rous肉瘤病毒长末端重复序列(RSV LTR)启动子的质粒载体pRC/RSV，构建重组载体pRC/RSV-BDD-hFVⅧcDNA。用SuperFect 转染剂转染正常Bakb/C小鼠的精子。同样方法将pRC/RSV转染3只雄性小鼠的精子作为对照。利用精子载体，通过人工授精技术使母鼠受孕，观察人FⅧ在子代转基因小鼠体内的表达情况。新生小鼠出生后第4周，取约0.5～1.0 cm长的尾巴，抽提组织DNA，应用PCR和Southern bkot筛查F1代BDD-hFⅧ cDNA转基因幼鼠。在第6周，使F1代BDD-hFⅧ cDNA转基因雄鼠与正常雌鼠交配，在F2代幼鼠出生后2周，同样取约0.5～1.0 cm长的尾巴，用Southern bkot筛查F2代BDD-hFⅧ cDNA转基因鼠。分别用Northern bkot和Western bkot检测F1代和F2代幼鼠组织中BDD-hFⅧ cDNA的转录和表达。采用ELISA方法检测两代小鼠血浆中hFⅧ抗原的含量，BIA方法检测血浆中的抗-hFⅧ抑制物。同样方法检测两只正常小鼠作为对照。
结果 经人工授精后，20只子宫内注射转染过pRC/RSV BDD hFⅧcDNA精子悬液的受体母鼠中，7只受孕，受孕率为35%(7/20)。母鼠经21天怀胎，共产下11只F1代仔鼠，2只在产下后死亡，仔鼠存活率为82%(雌鼠4只，雄鼠5只)，筛检出3只转有BDD- hFⅧ cDNA的F1代幼鼠。对照组的2只母鼠共产下2只F1代小鼠，均为雌性。F2代幼鼠共8只(雌鼠5只，雄鼠3只)，筛检出2只BDD-hFⅧ cDNA转基因鼠。
3只F1代转基因鼠的脾、肝、肺和肾组织中均有BDD-hFⅧcDNA的转录和表达。3只F1代转基因鼠血浆中的人FⅧ抗原分别为8.65 ng/mk、7.84 ng/mk和8.44 ng/mk，2只F2代鼠的人FⅧ抗原分别为4.58 ng/mk和4.16 ng/mk。两代转基因鼠血浆中的抗-hFⅧ抑制物均为阴性。
结论 以精子作为载体，携带pRC/RSV-BDD-hFⅧ cDNA，可以通过人工授精技术生产转有人FⅧ基因的子代小鼠，并且能够传至第二代，在两代转基因小鼠体内表达人FⅧ。所表达的B结构域缺失(Δ760 aa～1639 aa)的人FⅧ蛋白(FⅧΔ760 aa～1639
aa)也是以重-轻链异二聚体的形式存在，并且证实小鼠在受精卵或胚胎期接触了人FⅧ基因，出生后体内没有抗-hFⅧ抑制物出现。, http://www.100md.com(上海第二医科大学附属瑞金医院 上海血液学研究所 尹俊 王鸿利 王学)