维生素D测定法
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| 标题 | 维生素D测定法 |
| 附录序号 | 附录Ⅶ |
| 内容全文 | K. 维生素D测定法 本法系用高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定维生素D(包括维生素D<[2]>和D<[3]>,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025μg。 测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测 定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。 第一法 对照品贮备溶液的制备 根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D<[2]>或D<[3]>对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存。 测定维生素D<[2]>时，应另取维生素D<[3]>对照品25mg，同法制成维生素D<[3]>对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。 内标溶液的制备 称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。 色谱条件与系统适用性试验 用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇(997∶3)为流动相，检测波长为254nm。量取维生素D<[3]>对照品贮备溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml， 摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254和365nm的紫外光灯下， 将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D<[3]>、反式维生素D<[3]>、维生素D<[3]>和速甾醇D<[3]>；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D<[3]>的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0%；前维生素D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为0.5)与反式维生素D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为 0.6)以及维生素D<[3]>与速甾醇D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。 校正因子测定 精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f<[1]>。 另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1.5小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f<[2]>。 f<[2]>＝(A<[s]>·m<[r]>-f<[1]>m<[s]>A<[r1]>)/A<[r2]>·m<[s]> 式中 A<[s]>为内标的峰值； m<[r]>为加入对照品的量； f<[1]>为维生素D的校正因子； m<[s]>为加入内标物质的量； A<[r1]>为维生素D的峰值； A<[r2]>为前维生素D的峰值。 含量测定 取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量。 mi＝(f<[1]>·A<[i1]>+f<[2]>A<[i2]>)·m<[s]>/A<[s]> 式中 A<[i1]>为维生素D的峰值； A<[i2]>为前维生素D的峰值； m<[s]>为加入内标物质的量； A<[s]>为内标的峰值。 第二法 精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上，重量不超过2.0g)，置皂化瓶中，加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50%(g/g)氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g，则加50%(g/g)氢氧化钾溶液4ml]，置水浴上加热回流30分钟，冷却后，自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁，将皂化液移至分液漏斗中，皂化瓶用水60～100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中，用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次，第一次60ml,以后每次40ml，合并乙醚液，用水洗涤数次，每次约100ml，洗涤时应缓缓旋动，避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色，静置，分取乙醚提取液，加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分，分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤，洗液与提取液合并，置具塞圆底烧瓶中，在水浴上低温蒸发至约5ml，再用氮气流吹干，迅速精密加入甲醇3ml，密塞，超声处理助溶后，移入离心管中，离心，取上清液作为供试品溶液A。 净化用色谱柱系统分离收集维生素D 精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，以甲醇-乙腈-水(50∶50∶2) 为流动相进行分离，检测波长为254nm，从计录仪上观察色谱图，要求维生素D与前维生素D为叠 峰，并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开；准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液，置具塞圆底烧瓶中，用氮气流迅速吹干,精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml，并使每1ml中含维生素D为50～140单位,内标物质与维生素D的重量比约为4∶1)，密塞，超声处理助溶，即为供试品溶液B。 取供试品溶液B，按第一法进行含量测定，进样量为100～200μl。 第三法 供试品溶液的制备 取各该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱柱系统分离维生素D项下的方法处理,至“用氮气流迅速吹干”后, 加入异辛烷2ml溶解,通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中，加热1.5小时后，立即通氮在2分钟内吹干，迅速精密加入正己烷2ml，溶解后，即为供试品溶液C。 对照品溶液的制备 精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位，精密量取2ml置具塞圆底烧瓶中，照供试品溶液制备项下的方法,自“通氮排除空气后”起，依法操作，得对照品溶液。 含量测定 在上述第一法的色谱条件下，取对照品溶液与供试品溶液C,交替精密进样200μl，量取维生素D的峰值，按外标法计算含量。 |