Gfp-Fret
a.GFP(green fluorescent protein)是从维多利亚水母(Aequorea
victoria)中分离出来的，受紫外线激发而发出绿色荧光，由此得名。figure
1 green mapb. GFP的发光基团是环状三肽，发光时无需辅助因子，无需作用底物。又据报道与GFP融合表达的蛋白质在细胞内仍能行使正常的功能，所以综合以上优点，GFP就成了一个极好的，体内的，原位的，可检测分子行为的报告分子。
2.GFP-FRET概论
关于GFP的应用之广泛毋庸多谈，分院里的研究组用GFP作研究的就有N多，这要谈的是GFP的一个新应用，FRET－fluorescence resonance energy transfer,荧光共振能量转移，指两个荧光发色基团在足够靠近(<100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能。
, 百拇医药
clontech 公司提供的GFP系列荧光蛋白最大激发及发射波长
excitation maxima
emission maxima
eBFP 380nm 440nm
eGF 488nm 509nm
eYFP 513nm 527nmeCFP 433/453nm 475/501nm
eGFP(enhanced green
fluorescent protein)
指经过改造的荧光蛋白，发出较野生型更强的荧光。
, 百拇医药
3.GFP-FRET基本原理
例如BFP、eGFP两种荧光蛋白，它们的发射光谱相距较远，观察时易于区分。BFP的发射光谱与eGFP的激发光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用BFP的激发波长刺激，BFP的发色基团将会把能量转移至eGFP的发色基团上，所以主要发射的将是eGFP
的荧光。总结一下，应用GFP产生FRET需满足几个条件：
a.两种荧光蛋白的激发光谱需分开，易于选择性激发
b.供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的激发光谱有重叠
c.两种荧光蛋白的发射光谱需分开，易于区分鉴定
d.两个荧光发色基团之间的距离要小于100埃
, http://www.100md.com
条件是很多，但是能完全符合以上条件的几乎找不到，现在常用于FRET的荧光蛋白对有两个BFP-eGFP,YFP-CFP它们各有长处。
4.具体应用
a.分子内的变化
example 1:这是GFP在FRET最早的应用，Heim&Tsien利用BFP－eGFP荧光蛋白对，之间用一24个氨基酸的小肽连接，当用胰蛋白酶作用时，中间的小肽被切开，两个荧光蛋白原有的FRET被破坏。
example 2:Nagai etal.用YFP-CFP荧光蛋白对，之间用CREB的激酶敏感结构域连接。这样如有cAMP诱导的激酶发生作用在此蛋白上时，由于中间位点被磷酸化，连接肽发生构象变化,干扰了两端荧光蛋白的相互作用，原有的FRET被破坏。
b.分子间相互作用
, http://www.100md.com
example 1:Day etal.应用BFP-eGFP荧光蛋白对，与转录因子Pit-1融合表达，研究了此转录因子的同体二聚化。
example 2:Miyawaki etal.将CFP与calmodulin的N端融合表达，YFP与MLCK的calmodulin结合肽M13的C端融合表达，Ca2+作用于calmodulin，再与M13结合，就可引发FRET，这就构建了一个细胞内检测Ca2+浓度的元件。
example 3:Mahajan etal.构建了eGFP-Bax、BFP-Bcl2融合蛋白，在凋亡过程中，当Bax与Bcl2相互发生作用时，也引发了FRET。
看到这里，大家不妨想一想，哇，这真是一个好东东，既能研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，又能研究分子间的相互作用，荧光蛋白对都是现成的，要考虑的就是能否满足发色基团距离小于100埃的要求，不过不做做怎么知道不行，谁又看不见分子间距离到底有多大。正在研究蛋白功能的同志可以注意了。
, 百拇医药
这种方法的最大特点就是能直观的观察的分子的构象变化及相互作用!真是不错。
GFP经典文献及本文引用的文献
primary structure of the
Aequorea victoria green fluorescent proteion .Gene
1992.111:229-233
green fluorescent protein as a marker for gene
expression.Science.1994.263:802-805
expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant
, http://www.100md.com
protein.FEBS letter.341:277-280
Double labelling of the subcellular structures with organelle-targeted GFP
mutants invivo.Curr.Biol.6:183-188
Using GFP in FRET-based applictions.TiCB.1999.9:57-60
新思路
新技术—其他文章, http://www.100md.com
victoria)中分离出来的，受紫外线激发而发出绿色荧光，由此得名。figure
1 green mapb. GFP的发光基团是环状三肽，发光时无需辅助因子，无需作用底物。又据报道与GFP融合表达的蛋白质在细胞内仍能行使正常的功能，所以综合以上优点，GFP就成了一个极好的，体内的，原位的，可检测分子行为的报告分子。
2.GFP-FRET概论
关于GFP的应用之广泛毋庸多谈，分院里的研究组用GFP作研究的就有N多，这要谈的是GFP的一个新应用，FRET－fluorescence resonance energy transfer,荧光共振能量转移，指两个荧光发色基团在足够靠近(<100埃)时，它们之间可发生能量转移的现象。GFP近年来发展出了多种突变体，通过引入各种点突变使发光基团的激发光谱和发射光谱均发生变化而发出不同颜色的荧光，有BFP，YFP，CFP等。这些突变体使GFP应用于FRET成为可能。
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clontech 公司提供的GFP系列荧光蛋白最大激发及发射波长
excitation maxima
emission maxima
eBFP 380nm 440nm
eGF 488nm 509nm
eYFP 513nm 527nmeCFP 433/453nm 475/501nm
eGFP(enhanced green
fluorescent protein)
指经过改造的荧光蛋白，发出较野生型更强的荧光。
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3.GFP-FRET基本原理
例如BFP、eGFP两种荧光蛋白，它们的发射光谱相距较远，观察时易于区分。BFP的发射光谱与eGFP的激发光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用BFP的激发波长刺激，BFP的发色基团将会把能量转移至eGFP的发色基团上，所以主要发射的将是eGFP
的荧光。总结一下，应用GFP产生FRET需满足几个条件：
a.两种荧光蛋白的激发光谱需分开，易于选择性激发
b.供体荧光蛋白的发射光谱与受体荧光蛋白的激发光谱有重叠
c.两种荧光蛋白的发射光谱需分开，易于区分鉴定
d.两个荧光发色基团之间的距离要小于100埃
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条件是很多，但是能完全符合以上条件的几乎找不到，现在常用于FRET的荧光蛋白对有两个BFP-eGFP,YFP-CFP它们各有长处。
4.具体应用
a.分子内的变化
example 1:这是GFP在FRET最早的应用，Heim&Tsien利用BFP－eGFP荧光蛋白对，之间用一24个氨基酸的小肽连接，当用胰蛋白酶作用时，中间的小肽被切开，两个荧光蛋白原有的FRET被破坏。
example 2:Nagai etal.用YFP-CFP荧光蛋白对，之间用CREB的激酶敏感结构域连接。这样如有cAMP诱导的激酶发生作用在此蛋白上时，由于中间位点被磷酸化，连接肽发生构象变化,干扰了两端荧光蛋白的相互作用，原有的FRET被破坏。
b.分子间相互作用
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example 1:Day etal.应用BFP-eGFP荧光蛋白对，与转录因子Pit-1融合表达，研究了此转录因子的同体二聚化。
example 2:Miyawaki etal.将CFP与calmodulin的N端融合表达，YFP与MLCK的calmodulin结合肽M13的C端融合表达，Ca2+作用于calmodulin，再与M13结合，就可引发FRET，这就构建了一个细胞内检测Ca2+浓度的元件。
example 3:Mahajan etal.构建了eGFP-Bax、BFP-Bcl2融合蛋白，在凋亡过程中，当Bax与Bcl2相互发生作用时，也引发了FRET。
看到这里，大家不妨想一想，哇，这真是一个好东东，既能研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，又能研究分子间的相互作用，荧光蛋白对都是现成的，要考虑的就是能否满足发色基团距离小于100埃的要求，不过不做做怎么知道不行，谁又看不见分子间距离到底有多大。正在研究蛋白功能的同志可以注意了。
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这种方法的最大特点就是能直观的观察的分子的构象变化及相互作用!真是不错。
GFP经典文献及本文引用的文献
primary structure of the
Aequorea victoria green fluorescent proteion .Gene
1992.111:229-233
green fluorescent protein as a marker for gene
expression.Science.1994.263:802-805
expression of the gene and fluorescence characteristics of the recombinant
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protein.FEBS letter.341:277-280
Double labelling of the subcellular structures with organelle-targeted GFP
mutants invivo.Curr.Biol.6:183-188
Using GFP in FRET-based applictions.TiCB.1999.9:57-60
新思路
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