理化鉴定
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《中药鉴定学》
生药的理化鉴定是利用物理的或化学的方法，对生药及其制剂中所含主要化学成分或有效成分进行定性和定量分析，来鉴定生药品质优良度的一种方法。一般应用于含不同化学成分生药的鉴定，及生药同名异物，或性状相似又无明显显微特征的生药鉴别。同时，用理化鉴定方法检查样品含化学成分的性质和类型，也有助于发现新药源或寻找代用品。
理化鉴定分为定性分析和定量分析两类：定性分析确定生药的真实性；定量分析说明生药有效成分的含量，确定生药的品质优良度。理化鉴定的实验方法一般用少量干粉，切片或生药经初步提取分离后，选择理化反应速度快、灵敏度高的方法进行。当前，随着生药有效成分研究的深入和现代仪器分析技术的提高，生药的鉴定从宏观和微观的形态学鉴定向有效成分和药效鉴定方向发展，理化鉴定的方法和手段也正在不断的更新和发展。现将常用的理化鉴定方法介绍如下：
一、显微化学反应
显微化化学反应是将生药的干粉、手切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试剂使产生沉淀或结晶，在显微镜下观察反应结果；或产生特殊的颜色，从而进行鉴定。
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1.
将生药切片或粉末置载玻片上，滴加各种试液，加盖玻片，稍放置，在显微镜下观察产生的结晶、沉淀或颜色。例如：
黄连粉末滴加稀盐酸，可见针簇状小檗碱盐酸结晶析出；或滴加30%硝酸，可见针状小檗碱硝酸盐结晶析出。
直立百部鲜块根切片，滴加氯化金试液，于皮层细胞中有微黄色玫瑰花状结晶(示生物碱反应)。
肉桂粉末加氯仿2～3滴，略浸渍，速加2%盐酸苯肼1滴，可见黄色针状或杆状结晶(示桂皮醛反应)。
2.
取生药粗粉加适当溶剂浸提成分，将浸出液置载玻片上，滴加各种试液，加盖玻片，在显微镜下观察反应。
例如：槟榔粉末0.5g，加水3～4ml及稀硫酸1滴，微热数分钟，取滤液于玻片上，加碘化铋钾试液，即发生浑浊，放置后可见石榴红色球形或方形结晶(示槟榔碱反应)。
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3.
取生药切片或粉末，滴加名种试液，直接观察呈现的颜色。例如：
番木鳖胚乳薄片置白磁板上，加1%钒酸铵的硫酸溶液1滴，迅速显紫色(示番木鳖碱)；另取切片加发烟硝酸1滴，显橙红色(示马钱子碱)。
甘草粉末置白磁板上，加80%硫酸1～2滴，显橙黄色(示甘草甜素反应)。
4.
显微化学定位试验：利用显微和化学方法，确定生药有效成分在生药组织构造中的部位，称显微化学定位试验。
如北柴胡横切片加1滴无水乙醇-浓硫酸(1:1)液，在显微镜下观察可见木栓层，栓内层和皮层显黄绿色～蓝绿色，示此柴胡的有效成分柴胡皂甙存在于以上部位。
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二、物理常数
物理常数包括相对密度、旋光度、折光率、凝点、熔点等。对于油脂类、挥发油及树脂类药材的真实性和纯度的鉴别具有特别重要的意义。
1. 相对密度
系指在共同特定的条件下，某物质的密度与水的密度之比。某些生药具有一定的相对密度。纯度变更，相对密度随同改变。测定相对密度，可以区别或检查生药的纯杂程度。
2. 旋光度
平面偏振光通过含有某些光学活性的化合物液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转。旋转的度数，称为旋光度。偏振光透过长1cm，每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。测定比旋度(或旋光度)可以区别或检查某些生药的纯杂程度，亦可用以测定含量。
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3. 折光率
光线自一种透明介质进入另一透明介质时，由于两种介质的密度不同，光的进行速度发生变化，即发生折射现象。一般折光率系指光线在空气中进行的速度与在供试品中进行速度的比值。折光率因物质的温度与光线的波长不同而改变，透光物质的温度升高，折光率变小；光线的波长越短，折光率就越大。测定折光率可区别不同的油类或检查纯杂程度。
4. 凝点
系指一种物质由液体凝结为固体时，在短时期内停留不变的最高温度。某些生药具有一定的凝点，纯度变更，凝点亦随之改变。测定凝点可以区别或检查生药的纯杂程度，亦可用以测定含量。
5. 熔点
系指一种物质由固体熔化成液体的温度，熔融同时分解的温度。或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。某些生药具有一定的熔点，测定熔点可以区别或检查生药的纯杂程度。
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三、微量升华
利用生药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其形状、颜色以及化学反应作为鉴别特征。例如：
茶叶的升华物，为白色针状结晶(咖啡碱)。加浓盐酸1滴溶解升华物，再加氯化金试液，得黄色针状结晶(咖啡碱氯化金络盐)。
大黄的升华物为黄色针状或羽状结晶(蒽醌化合物)，加碱液溶解并显红色。
牡丹皮、徐长卿根的升华物为长柱状或针状、羽状结晶(牡丹酚)。
薄荷的升华物为无色针簇状结晶(薄荷脑)；加浓硫酸2滴及香荚兰醛结晶少许，显橙黄色，再加蒸馏水1滴即变紫红色。
斑蝥的升华物在130～140℃为白色柱状或小片状结晶(斑蝥素)；加碱溶解，再加酸又析出结晶。
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微量升华的方法：取金属片，安放在有圆孔(直径约2cm)的石棉板上，金属片上放一小金属圈(高度约0.8cm)，对准石棉板上的圆孔，圈内加入生药粉末一薄层，圈上放一载玻片。在石棉板下圆孔处用酒精灯徐徐加热(火焰距板约4cm)数分钟，至粉末开始变焦，并有气化物发生，去火待冷，则有结晶状升华物凝集于玻片上。将玻片取下反转，在显微镜下观察结晶形状，并可加化学试剂观察其反应。必要时可用显微熔点测定器测定结晶的熔点。
四、荧光分析
荧光分析是利用生物中的某些化学成分，接受自然光或紫外光照射时，能发生荧光，其特性和强度可以进行定性或定量分析。某些物质经吸收适当的紫外光辐射后，从基态跃迁到激发态，激发态分子在返回基态时以发射辐射的方式全部或部分地释放出所吸收的能量，便产生荧光，荧光的波长总是比其激发波长要长。如激发光源移去，则荧光会很快消失。实验证明，能发出荧光的物质在自然光下所现出的荧光，除少数例外，都是微弱的，而在波长短的光线下易产生较强的荧光。因此，紫外光就成为荧光分析中常用的光源。
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紫外光可由荧光分析仪(或紫外光灯)产生，通常可直接取生药饮片、粉末或其浸出液，置暗处，用荧光仪照射进行观察。例如黄连饮片显金黄色荧光；牛膝饮片显黄白色荧光；牛蒡子显蓝白色荧光；浙贝母粉末显亮淡绿色荧光；大黄粉末显深棕色荧光；秦皮的水浸液显天蓝色荧光(自然光下亦明显)；香加皮的水或乙醇浸出液显紫色荧光。
有些生药本身不产生荧光，但以酸或碱处理，或经其它化学方法处理后，可使某些成分在紫外光下变成可见色彩。例如芦荟溶液与硼砂共热，所含芦荟素即起反应显黄绿色荧光；矿物药中所含的锌、硼、铅等元素和某些有机试剂作用后能产生荧光；枳壳乙醇浸出液滴在纸上，干后喷0.5%醋酸镁甲醇溶液，烘干显淡蓝色荧光。
有些生药表面附有地衣或真菌，也可能有荧光出现。因此荧光分析还可用于检查某些生药的变质情况。
此外，可利用荧光显微镜观察生药的荧光，并观察化学成分存在的部位。例如国产沉香与进口沉香的显微特征比较近似，但在荧光显微镜下观察：国产沉香粉末的部分颗粒显海蓝色，部分显灰绿色荧光；进口沉香粉末的部分颗粒显竹篁绿色，部分显枯绿色，部分显枯绿色荧光。苍术粉末中少数颗粒显天蓝色荧光；白术粉末显芒果黄色，少数颗粒显初熟杏黄色荧光。又如黄连含小檗碱，特别在木质部能显出强烈的金黄色荧光。
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五、分光光度法
分光光度法是通过测定被测物质在某些特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
1. 紫外分光光度法
是利用物质的紫外吸收光谱进行物质的定性或定量分析方法。生药主成分的分析，一般用200～400nm的紫外光区；所用仪器为紫外分光光度计。
在紫外光区，灵敏度和精密度较高，一般每1ml溶液中含有数mg的物质即可测定；在此区域内，物质对光的吸收主要系分子中电子的能级跃迁所致，同时伴随着分子振动和转动级的变化；电子吸收光谱一般比较简单平缓，选择性不如红外光区，故主要用于定量分析及作为物理常数的测定。
2. 比色法
比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。在可见光区(400～850nm)，有些物质对光有吸收，有些物质本身并没有吸收，但在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后，可用此法测定。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，测定时需用标准品或对照品同时操作。常使用的仪器为可见分光光度计或比色计。比色法多用于生药的定量分析及理物常数的测定。
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3. 红外分光光度法 一般用2.5～15mm(或按波数计为4000～667cm-1)红外区吸收光谱进行物质的定性、定量分析的方法。所用仪器为红外分光光度计。
红外光区的灵敏度和精密度较低，一般需数百mg的供试品进行测定。在此区域内，物质对光的吸收系分子中振动和转动能级的跃迁所引起；红外光谱(或称振转光谱)的特征性很强，特别是在7～15mm一段称为"指纹区"，吸收峰很多，而且尖锐，故主要用于物质的鉴别和分析结构。本法在牛黄、血竭、熊胆等的鉴别上，效果良好。
4.
原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于从光源辐射出的待测元素特征光波通过样品蒸气时，被蒸气中该待测元素的基态原子所吸收，测定辐射光强度减弱的程度，以求出供试品中待测元素含量的一种方法。原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律。比较标准品和供试品的吸收度，即可求得样品中待测元素的含量。所用仪器为原子吸收分光光度计。近年来用以测定生药中的微量金属元素的含量。
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六、色谱法
色谱法又称层析法，是一种对混合物进行分离和分析的物理化学方法，也是生药化学成分分离和鉴别的重要方法之一。
1. 根据色谱分离原理分类
可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。
(1)
吸附色谱：是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱，使组分达到分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等吸附活性的物质。
(2)
分配色谱：是利用被分离物质在两相中有不同的分配系数(或溶解度)而使组分分离。其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相；另一相为液体或气体，称为流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。
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(3)
离子交换色谱：是利用被分离物质对离子交换树脂上的离子亲和力程度的不同使组分分离。常用的有不同程度的阳、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。
(4)
排阻色谱(又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱)：是利用被分离物质分子量大小的不同导致的填料上渗透程度不同使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂为流动相。
2. 根据色谱分离方法分类
可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。
(1)纸色谱法：以纸为载体，纸上所含水分或其他物质为固定相，用流动相进行展开的分配色谱。
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样品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组分的位置。
由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。进行生药鉴别时，样品在色谱中所显主斑点的颜色(或荧光)和位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。进行纯度检查时，可取一定量样品，展开后，按药典规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。若进行含量测定时，则应定量地提取和点样，展开后将待测主斑点剪下洗脱后，再用适当方法测定。
(2)薄层色谱法：是将适当的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料或铝片上，成一均匀的薄层，待点样、展开后，与适当的对照物(对照品或对照生药)按同法在同板上所得的色谱图或主斑点作对比，用以进行生药鉴别。中国药典1995年版一部，用本法鉴别品种已达419种。
薄层板一般分无粘合剂和含粘合剂两种。前者是将细粉状的吸附剂或载体直接涂布于玻璃板(塑料或铝片)上即可使用；后者是在吸附剂或载全加入一定量的粘合剂，一般为10%～15%煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃烘4小时)混匀后加水适量，或加0.5%～0.7%羧甲基纤维素钠水溶液适量，调成糊状，均匀涂布于玻璃板上，置水平台上，在空气中晾干，通常于110℃烘0.5～1小时后使用。薄层厚度一般为0.2～0.3mm。
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薄层色谱法用于生药鉴定时，可作定性鉴别，又可作含量测定。首先要根据生药中所含主要化学成分的性质，在一定条件下将生药经提取制备成点样溶液，选择适当的吸附剂和展开剂，经展开获得斑点清晰、Rf值稳定的色谱图。在薄层色谱鉴别中，一般选用已知主成分的化学纯品或对照生药的相同提取物相对比，经薄层展开后，用一定方法显色，样品色谱应与对照物色谱在相应的位置上，有相同颜色的斑点或主斑点。稳定的薄层色谱可作为生药的鉴别特征。
薄层色谱用于生药主成分的定量测定，具有用量少、方法简便的特点。除可将薄层上主成分斑点刮取，经溶剂洗脱后进行测定外，也可在薄层板上直接测定含量，当前应用较多的是薄层扫描法。
薄层扫描法，是用一定波长的光，照射在薄层斑点上，对有吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于生药的鉴别、杂质检查或含量测定。对中药复方制剂，可用相当的原药材按需要组合作阴、阳性对照，然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。常用的仪器为薄层扫描仪。由于不必经洗脱等操作，因而方便快速，测量灵敏度高。
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薄层扫描的检测方法，有吸收法和荧光法，测量方法有反射法和透射法，扫描方式有双波长和单波长扫描，锯齿和线性扫描，可根据具体情况加以选择。薄层扫描法进行生药主成分的含量测定，虽然具有方便快速，测量灵敏度高的特点，但是，影响薄层扫描结果的因素很多，只有得到分离度和重现性好的样品薄层色谱，才能获得满意的结果。
(3)柱色谱法：是在色谱柱内进行分离后测定的一种方法。色谱柱为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂或载体，洗脱溶剂从管的上端借毛细作用或重力作用向下移动，使物质得到分离。
1)
吸附柱色谱：即色谱柱内装入吸附剂，其粒度应尽可能保持大小均匀，颗粒直径以0.07～0.15mm为常用。吸附剂的活性(或吸附力)对分离效果有较大影响。吸附剂的填装有干法与湿法两种。干法是将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱管下端出口处联结活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持充分的洗
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脱剂留在吸附层的上面。湿法是将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入洗脱剂将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。
样品的加入除有一定要求外，一般将样吕溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起；或将样品溶于适当溶剂中，与少量吸附剂混匀，再挥发溶剂使呈松散状，加入已制备好的色谱柱上面。如样品在常用溶剂中不溶，可将样品与适量的吸附剂在乳体钵中研磨均匀后加入。
洗脱时通常按洗脱剂洗脱能力大小，递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中要始终保持有充分的洗脱剂留在吸附层上面。
2)
分配柱色谱：方法和吸附柱色谱基本一致，装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱管中并压紧。样品可溶于固定液，混以少量载体，加在制好的色谱柱上端。流动相需先加固定相混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。
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(4)
气相色谱法：气相色谱法的流动相为气体，称为载气，通常多为氮气。色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。样品注入进样口被加热气化，在色谱柱内，样品中各组分的气、液两相中进行反复分配因分配系数的不同而达到分离，先后由柱出口进入检测器，产生讯号，由记录仪记录色谱图。根据组分的量与检测响应值(峰面积)成正比，以进行定性和定量分析。
气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较广，精密度高，分离效果比薄层色谱好，但所得数据只有保留时间，多数情况下是在高温下进行，若成分不气化，就不能进行分析，故应用范围受到限制。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰的分离度较好，分离度(R)的计算公式为：
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tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间，tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间，W1及W2为此相邻二峰的峰宽度(图4-4)。除另有规定外，分离度应大于1.5。
色谱图中峰的测量可用峰面积法或峰高法。用峰高法测量量，应检查测量峰的拖尾因子(T)是否符合规定；或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求(一般变异系数应不大于2%)。拖尾因子(T)计算公式为：
W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d1为峰极大至峰前沿之间的距离，除另有规定外，T应在0.95～1.05间。
校正因子(f)的计算公式为：
As为内标物质的峰面积或峰高，Ar为待测组分标准品(或待测杂质对照品)峰面积或峰高，ms为内标物质的进样量，mr为标准品(或杂质对照品)的进样量。
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图1-4-5 峰高与峰宽
气相色谱的定量分析方法有：①外标法，即标准曲线法；②归一法，即测量每一个峰的峰面积，单个峰的峰面积除以样品中各峰面积之总和(即总面积)，得到该组分的百分数。若操作条件稳定，在一定的进样量范围内，也可用峰高归一法；③内标法，是在样品中加入一定量纯物质作为内标物，并根据样品和内标物的重量比和相应峰面积(或峰高)比，求得组分的含量。④追加法，即取一定量样品作一色谱图；再于同量样品中精确加入待测组分的纯品一定量，再作一色谱图，测量该组分的峰面积，两次之差即为追加的纯品峰面积，根据纯品的量，可计算样品中组分的量，由于进样量不易控制，故以内标法为多用。
(5)高效液相色谱法：高效液相色谱法是将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相。用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
所用仪器为高效液相色谱仪，常用的色谱柱填充剂有硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微孔球等用于排阻色谱。注样量一般为数ml，柱温多为室温，检测器为紫外光检测器、荧光检测器、示差检测器和蒸发-光散射(ELSD)检测器等。蒸发-光散射检测器适于无紫外吸收的物质的分析。
高压液相法进行生药分析具有快速、灵敏和准确的特点。比气相色谱法有适用范围广、流动相选择性广、色谱柱可反复应用，以及流出组分容易收集等优点，已广泛应用于生药及其制剂的质量分析，本法将逐渐成为生药成分定量方法的主流。, 百拇医药
理化鉴定分为定性分析和定量分析两类：定性分析确定生药的真实性；定量分析说明生药有效成分的含量，确定生药的品质优良度。理化鉴定的实验方法一般用少量干粉，切片或生药经初步提取分离后，选择理化反应速度快、灵敏度高的方法进行。当前，随着生药有效成分研究的深入和现代仪器分析技术的提高，生药的鉴定从宏观和微观的形态学鉴定向有效成分和药效鉴定方向发展，理化鉴定的方法和手段也正在不断的更新和发展。现将常用的理化鉴定方法介绍如下：
一、显微化学反应
显微化化学反应是将生药的干粉、手切片或浸出液少量，置于载玻片上，滴加某些化学试剂使产生沉淀或结晶，在显微镜下观察反应结果；或产生特殊的颜色，从而进行鉴定。
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1.
将生药切片或粉末置载玻片上，滴加各种试液，加盖玻片，稍放置，在显微镜下观察产生的结晶、沉淀或颜色。例如：
黄连粉末滴加稀盐酸，可见针簇状小檗碱盐酸结晶析出；或滴加30%硝酸，可见针状小檗碱硝酸盐结晶析出。
直立百部鲜块根切片，滴加氯化金试液，于皮层细胞中有微黄色玫瑰花状结晶(示生物碱反应)。
肉桂粉末加氯仿2～3滴，略浸渍，速加2%盐酸苯肼1滴，可见黄色针状或杆状结晶(示桂皮醛反应)。
2.
取生药粗粉加适当溶剂浸提成分，将浸出液置载玻片上，滴加各种试液，加盖玻片，在显微镜下观察反应。
例如：槟榔粉末0.5g，加水3～4ml及稀硫酸1滴，微热数分钟，取滤液于玻片上，加碘化铋钾试液，即发生浑浊，放置后可见石榴红色球形或方形结晶(示槟榔碱反应)。
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3.
取生药切片或粉末，滴加名种试液，直接观察呈现的颜色。例如：
番木鳖胚乳薄片置白磁板上，加1%钒酸铵的硫酸溶液1滴，迅速显紫色(示番木鳖碱)；另取切片加发烟硝酸1滴，显橙红色(示马钱子碱)。
甘草粉末置白磁板上，加80%硫酸1～2滴，显橙黄色(示甘草甜素反应)。
4.
显微化学定位试验：利用显微和化学方法，确定生药有效成分在生药组织构造中的部位，称显微化学定位试验。
如北柴胡横切片加1滴无水乙醇-浓硫酸(1:1)液，在显微镜下观察可见木栓层，栓内层和皮层显黄绿色～蓝绿色，示此柴胡的有效成分柴胡皂甙存在于以上部位。
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二、物理常数
物理常数包括相对密度、旋光度、折光率、凝点、熔点等。对于油脂类、挥发油及树脂类药材的真实性和纯度的鉴别具有特别重要的意义。
1. 相对密度
系指在共同特定的条件下，某物质的密度与水的密度之比。某些生药具有一定的相对密度。纯度变更，相对密度随同改变。测定相对密度，可以区别或检查生药的纯杂程度。
2. 旋光度
平面偏振光通过含有某些光学活性的化合物液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转。旋转的度数，称为旋光度。偏振光透过长1cm，每1ml中含有旋光性物质1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。测定比旋度(或旋光度)可以区别或检查某些生药的纯杂程度，亦可用以测定含量。
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3. 折光率
光线自一种透明介质进入另一透明介质时，由于两种介质的密度不同，光的进行速度发生变化，即发生折射现象。一般折光率系指光线在空气中进行的速度与在供试品中进行速度的比值。折光率因物质的温度与光线的波长不同而改变，透光物质的温度升高，折光率变小；光线的波长越短，折光率就越大。测定折光率可区别不同的油类或检查纯杂程度。
4. 凝点
系指一种物质由液体凝结为固体时，在短时期内停留不变的最高温度。某些生药具有一定的凝点，纯度变更，凝点亦随之改变。测定凝点可以区别或检查生药的纯杂程度，亦可用以测定含量。
5. 熔点
系指一种物质由固体熔化成液体的温度，熔融同时分解的温度。或在熔化时自初熔至全熔的一段温度。某些生药具有一定的熔点，测定熔点可以区别或检查生药的纯杂程度。
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三、微量升华
利用生药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其形状、颜色以及化学反应作为鉴别特征。例如：
茶叶的升华物，为白色针状结晶(咖啡碱)。加浓盐酸1滴溶解升华物，再加氯化金试液，得黄色针状结晶(咖啡碱氯化金络盐)。
大黄的升华物为黄色针状或羽状结晶(蒽醌化合物)，加碱液溶解并显红色。
牡丹皮、徐长卿根的升华物为长柱状或针状、羽状结晶(牡丹酚)。
薄荷的升华物为无色针簇状结晶(薄荷脑)；加浓硫酸2滴及香荚兰醛结晶少许，显橙黄色，再加蒸馏水1滴即变紫红色。
斑蝥的升华物在130～140℃为白色柱状或小片状结晶(斑蝥素)；加碱溶解，再加酸又析出结晶。
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微量升华的方法：取金属片，安放在有圆孔(直径约2cm)的石棉板上，金属片上放一小金属圈(高度约0.8cm)，对准石棉板上的圆孔，圈内加入生药粉末一薄层，圈上放一载玻片。在石棉板下圆孔处用酒精灯徐徐加热(火焰距板约4cm)数分钟，至粉末开始变焦，并有气化物发生，去火待冷，则有结晶状升华物凝集于玻片上。将玻片取下反转，在显微镜下观察结晶形状，并可加化学试剂观察其反应。必要时可用显微熔点测定器测定结晶的熔点。
四、荧光分析
荧光分析是利用生物中的某些化学成分，接受自然光或紫外光照射时，能发生荧光，其特性和强度可以进行定性或定量分析。某些物质经吸收适当的紫外光辐射后，从基态跃迁到激发态，激发态分子在返回基态时以发射辐射的方式全部或部分地释放出所吸收的能量，便产生荧光，荧光的波长总是比其激发波长要长。如激发光源移去，则荧光会很快消失。实验证明，能发出荧光的物质在自然光下所现出的荧光，除少数例外，都是微弱的，而在波长短的光线下易产生较强的荧光。因此，紫外光就成为荧光分析中常用的光源。
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紫外光可由荧光分析仪(或紫外光灯)产生，通常可直接取生药饮片、粉末或其浸出液，置暗处，用荧光仪照射进行观察。例如黄连饮片显金黄色荧光；牛膝饮片显黄白色荧光；牛蒡子显蓝白色荧光；浙贝母粉末显亮淡绿色荧光；大黄粉末显深棕色荧光；秦皮的水浸液显天蓝色荧光(自然光下亦明显)；香加皮的水或乙醇浸出液显紫色荧光。
有些生药本身不产生荧光，但以酸或碱处理，或经其它化学方法处理后，可使某些成分在紫外光下变成可见色彩。例如芦荟溶液与硼砂共热，所含芦荟素即起反应显黄绿色荧光；矿物药中所含的锌、硼、铅等元素和某些有机试剂作用后能产生荧光；枳壳乙醇浸出液滴在纸上，干后喷0.5%醋酸镁甲醇溶液，烘干显淡蓝色荧光。
有些生药表面附有地衣或真菌，也可能有荧光出现。因此荧光分析还可用于检查某些生药的变质情况。
此外，可利用荧光显微镜观察生药的荧光，并观察化学成分存在的部位。例如国产沉香与进口沉香的显微特征比较近似，但在荧光显微镜下观察：国产沉香粉末的部分颗粒显海蓝色，部分显灰绿色荧光；进口沉香粉末的部分颗粒显竹篁绿色，部分显枯绿色，部分显枯绿色荧光。苍术粉末中少数颗粒显天蓝色荧光；白术粉末显芒果黄色，少数颗粒显初熟杏黄色荧光。又如黄连含小檗碱，特别在木质部能显出强烈的金黄色荧光。
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五、分光光度法
分光光度法是通过测定被测物质在某些特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
1. 紫外分光光度法
是利用物质的紫外吸收光谱进行物质的定性或定量分析方法。生药主成分的分析，一般用200～400nm的紫外光区；所用仪器为紫外分光光度计。
在紫外光区，灵敏度和精密度较高，一般每1ml溶液中含有数mg的物质即可测定；在此区域内，物质对光的吸收主要系分子中电子的能级跃迁所致，同时伴随着分子振动和转动级的变化；电子吸收光谱一般比较简单平缓，选择性不如红外光区，故主要用于定量分析及作为物理常数的测定。
2. 比色法
比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。在可见光区(400～850nm)，有些物质对光有吸收，有些物质本身并没有吸收，但在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后，可用此法测定。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，测定时需用标准品或对照品同时操作。常使用的仪器为可见分光光度计或比色计。比色法多用于生药的定量分析及理物常数的测定。
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3. 红外分光光度法 一般用2.5～15mm(或按波数计为4000～667cm-1)红外区吸收光谱进行物质的定性、定量分析的方法。所用仪器为红外分光光度计。
红外光区的灵敏度和精密度较低，一般需数百mg的供试品进行测定。在此区域内，物质对光的吸收系分子中振动和转动能级的跃迁所引起；红外光谱(或称振转光谱)的特征性很强，特别是在7～15mm一段称为"指纹区"，吸收峰很多，而且尖锐，故主要用于物质的鉴别和分析结构。本法在牛黄、血竭、熊胆等的鉴别上，效果良好。
4.
原子吸收分光光度法 原子吸收分光光度法是基于从光源辐射出的待测元素特征光波通过样品蒸气时，被蒸气中该待测元素的基态原子所吸收，测定辐射光强度减弱的程度，以求出供试品中待测元素含量的一种方法。原子吸收遵循一般分光光度法的吸收定律。比较标准品和供试品的吸收度，即可求得样品中待测元素的含量。所用仪器为原子吸收分光光度计。近年来用以测定生药中的微量金属元素的含量。
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六、色谱法
色谱法又称层析法，是一种对混合物进行分离和分析的物理化学方法，也是生药化学成分分离和鉴别的重要方法之一。
1. 根据色谱分离原理分类
可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱与排阻色谱等。
(1)
吸附色谱：是利用被分离物质在吸附剂上被吸附能力的不同，用溶剂或气体洗脱，使组分达到分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等吸附活性的物质。
(2)
分配色谱：是利用被分离物质在两相中有不同的分配系数(或溶解度)而使组分分离。其中一相被涂布或键合在固体载体上，称为固定相；另一相为液体或气体，称为流动相。常用的载体有硅胶、硅藻土、硅镁型吸附剂与纤维素粉等。
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(3)
离子交换色谱：是利用被分离物质对离子交换树脂上的离子亲和力程度的不同使组分分离。常用的有不同程度的阳、阴离子交换树脂，流动相为水或含有机溶剂的缓冲液。
(4)
排阻色谱(又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱)：是利用被分离物质分子量大小的不同导致的填料上渗透程度不同使组分分离。常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，根据固定相和供试品的性质选用水或有机溶剂为流动相。
2. 根据色谱分离方法分类
可分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。
(1)纸色谱法：以纸为载体，纸上所含水分或其他物质为固定相，用流动相进行展开的分配色谱。
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样品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组分的位置。
由于影响比移值的因素较多，因而一般采用在相同实验条件下与对照物质对比以确定其异同。进行生药鉴别时，样品在色谱中所显主斑点的颜色(或荧光)和位置，应与对照品在色谱中所显的主斑点相同。进行纯度检查时，可取一定量样品，展开后，按药典规定，检视其所显杂质斑点的个数或呈色(或荧光)的强度。若进行含量测定时，则应定量地提取和点样，展开后将待测主斑点剪下洗脱后，再用适当方法测定。
(2)薄层色谱法：是将适当的吸附剂或载体涂布于玻璃板、塑料或铝片上，成一均匀的薄层，待点样、展开后，与适当的对照物(对照品或对照生药)按同法在同板上所得的色谱图或主斑点作对比，用以进行生药鉴别。中国药典1995年版一部，用本法鉴别品种已达419种。
薄层板一般分无粘合剂和含粘合剂两种。前者是将细粉状的吸附剂或载体直接涂布于玻璃板(塑料或铝片)上即可使用；后者是在吸附剂或载全加入一定量的粘合剂，一般为10%～15%煅石膏(CaSO4·2H2O在140℃烘4小时)混匀后加水适量，或加0.5%～0.7%羧甲基纤维素钠水溶液适量，调成糊状，均匀涂布于玻璃板上，置水平台上，在空气中晾干，通常于110℃烘0.5～1小时后使用。薄层厚度一般为0.2～0.3mm。
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薄层色谱法用于生药鉴定时，可作定性鉴别，又可作含量测定。首先要根据生药中所含主要化学成分的性质，在一定条件下将生药经提取制备成点样溶液，选择适当的吸附剂和展开剂，经展开获得斑点清晰、Rf值稳定的色谱图。在薄层色谱鉴别中，一般选用已知主成分的化学纯品或对照生药的相同提取物相对比，经薄层展开后，用一定方法显色，样品色谱应与对照物色谱在相应的位置上，有相同颜色的斑点或主斑点。稳定的薄层色谱可作为生药的鉴别特征。
薄层色谱用于生药主成分的定量测定，具有用量少、方法简便的特点。除可将薄层上主成分斑点刮取，经溶剂洗脱后进行测定外，也可在薄层板上直接测定含量，当前应用较多的是薄层扫描法。
薄层扫描法，是用一定波长的光，照射在薄层斑点上，对有吸收紫外光或可见光的斑点，或经激发后能产生荧光的斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分数据用于生药的鉴别、杂质检查或含量测定。对中药复方制剂，可用相当的原药材按需要组合作阴、阳性对照，然后比较其薄层扫描图谱加以鉴别。常用的仪器为薄层扫描仪。由于不必经洗脱等操作，因而方便快速，测量灵敏度高。
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薄层扫描的检测方法，有吸收法和荧光法，测量方法有反射法和透射法，扫描方式有双波长和单波长扫描，锯齿和线性扫描，可根据具体情况加以选择。薄层扫描法进行生药主成分的含量测定，虽然具有方便快速，测量灵敏度高的特点，但是，影响薄层扫描结果的因素很多，只有得到分离度和重现性好的样品薄层色谱，才能获得满意的结果。
(3)柱色谱法：是在色谱柱内进行分离后测定的一种方法。色谱柱为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂或载体，洗脱溶剂从管的上端借毛细作用或重力作用向下移动，使物质得到分离。
1)
吸附柱色谱：即色谱柱内装入吸附剂，其粒度应尽可能保持大小均匀，颗粒直径以0.07～0.15mm为常用。吸附剂的活性(或吸附力)对分离效果有较大影响。吸附剂的填装有干法与湿法两种。干法是将吸附剂一次加入色谱管，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱管下端出口处联结活塞，加入适量的洗脱剂，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。操作过程中应保持充分的洗
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脱剂留在吸附层的上面。湿法是将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱管中，然后再加入洗脱剂将附着于管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。
样品的加入除有一定要求外，一般将样吕溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起；或将样品溶于适当溶剂中，与少量吸附剂混匀，再挥发溶剂使呈松散状，加入已制备好的色谱柱上面。如样品在常用溶剂中不溶，可将样品与适量的吸附剂在乳体钵中研磨均匀后加入。
洗脱时通常按洗脱剂洗脱能力大小，递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中要始终保持有充分的洗脱剂留在吸附层上面。
2)
分配柱色谱：方法和吸附柱色谱基本一致，装柱前，先将载体和固定液混合，然后分次移入色谱管中并压紧。样品可溶于固定液，混以少量载体，加在制好的色谱柱上端。流动相需先加固定相混合使之饱和，以避免洗脱过程中两相分配的改变。
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(4)
气相色谱法：气相色谱法的流动相为气体，称为载气，通常多为氮气。色谱柱分为填充柱和毛细管柱两种，填充柱内装吸附剂、高分子多孔小球或涂渍固定液的载体。毛细管柱内壁或载体经涂渍或交联固定液。样品注入进样口被加热气化，在色谱柱内，样品中各组分的气、液两相中进行反复分配因分配系数的不同而达到分离，先后由柱出口进入检测器，产生讯号，由记录仪记录色谱图。根据组分的量与检测响应值(峰面积)成正比，以进行定性和定量分析。
气相色谱法对含挥发性成分的生药应用较广，精密度高，分离效果比薄层色谱好，但所得数据只有保留时间，多数情况下是在高温下进行，若成分不气化，就不能进行分析，故应用范围受到限制。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰的分离度较好，分离度(R)的计算公式为：
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tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间，tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间，W1及W2为此相邻二峰的峰宽度(图4-4)。除另有规定外，分离度应大于1.5。
色谱图中峰的测量可用峰面积法或峰高法。用峰高法测量量，应检查测量峰的拖尾因子(T)是否符合规定；或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求(一般变异系数应不大于2%)。拖尾因子(T)计算公式为：
W0.05h为0.05峰高处的峰宽，d1为峰极大至峰前沿之间的距离，除另有规定外，T应在0.95～1.05间。
校正因子(f)的计算公式为：
As为内标物质的峰面积或峰高，Ar为待测组分标准品(或待测杂质对照品)峰面积或峰高，ms为内标物质的进样量，mr为标准品(或杂质对照品)的进样量。
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图1-4-5 峰高与峰宽
气相色谱的定量分析方法有：①外标法，即标准曲线法；②归一法，即测量每一个峰的峰面积，单个峰的峰面积除以样品中各峰面积之总和(即总面积)，得到该组分的百分数。若操作条件稳定，在一定的进样量范围内，也可用峰高归一法；③内标法，是在样品中加入一定量纯物质作为内标物，并根据样品和内标物的重量比和相应峰面积(或峰高)比，求得组分的含量。④追加法，即取一定量样品作一色谱图；再于同量样品中精确加入待测组分的纯品一定量，再作一色谱图，测量该组分的峰面积，两次之差即为追加的纯品峰面积，根据纯品的量，可计算样品中组分的量，由于进样量不易控制，故以内标法为多用。
(5)高效液相色谱法：高效液相色谱法是将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等作为流动相。用泵将流动相压入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
所用仪器为高效液相色谱仪，常用的色谱柱填充剂有硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微孔球等用于排阻色谱。注样量一般为数ml，柱温多为室温，检测器为紫外光检测器、荧光检测器、示差检测器和蒸发-光散射(ELSD)检测器等。蒸发-光散射检测器适于无紫外吸收的物质的分析。
高压液相法进行生药分析具有快速、灵敏和准确的特点。比气相色谱法有适用范围广、流动相选择性广、色谱柱可反复应用，以及流出组分容易收集等优点，已广泛应用于生药及其制剂的质量分析，本法将逐渐成为生药成分定量方法的主流。, 百拇医药