第四节非化酯化脂肪酸测定

http://www.100md.com 《动脉粥样硬化与生物化学检验》

临床上将C10以上的脂肪酸称为游离脂肪酸（free fatty acid,FFA）或非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid,NFFA），正常血清中含有油酸（18:1,W9）占54%，软脂酸（16：0）占34%，硬脂酸（18：0）占6%，是其主要的NFFA。另外还有月桂酸（12：0）、肉豆蔻酸（14：0）和花生四烯酸（20：4，W6，9，12，15）等含量很少的脂肪酸。与其他脂质比较，NFFA在血中浓度很低，其含量水平极易受脂代谢，糖代谢和内分泌机能等因素影响，血中NFFA半寿期为1～2min，极短。血清中的NFFA是与清蛋白结合进行运输，属于一种极简单的脂蛋白。

测定血清NFFA法有滴定法。比色法，原子分光光度法，高压液相层析法和酶法等。一般多以酶法测定。作NFFA测定的标本一定要注意在4℃条件下分离血清并尽快进行测定。因为血中有各种脂肪酶存在，极易也极快使血中TG和PL的酯型脂肪酸分解成非酯化的FFA，使血中NFFA值上升。贮存标本仅限于24h内，若保存三天，其值约升高30%，使结果不准确。

1．非酶法测定

非酶法测定包括滴定法、比色法、原子吸收分光光度法和高压液相层析法。前三种方法准确性差；高压液相层析法，仪器太昂贵，不便于批量操作。

2．酶测定法

主要用脂肪酶测定。血清中游离脂肪酸可分别测定酶水解后的产物乙酰CoA或AMP或辅酶A（CoA）进行定量。酶法测定结果准确可靠，快速，易于批量检测。测定原理如图15-6所示。

图15-6 血清主要FFA酶法测定图

□：内物质作为生成量与变化量进行测定；ACS：乙酰CoA合成酶；MK：肌激酶； PK：丙酮酸激酶；POD：丙酮酸氧化酶；DTNB：α-磺基苯甲酸；ACO：乙酰CoA氧化酶；ACD：乙酰CoA脱氢酶。

一、光度法

1．原理

血清中游离脂肪酸经抽提到高密度铜试剂中，形成铜皂在上层溶剂中，再用二苯卡巴肼与铜显色，进行定量。

2．试剂组成

代号

种类

浓度

组成

贮存2～8℃

有效期 R-1

抽提剂

氯仿：庚烷：甲醇=5：5：1（V/V） R-2

缓冲液

33mmol/L KH2PO44.539g/L 100ml+Na2HPO4·2H2O5.983g/L

50ml调pH至6.4 R-3

铜贮液

500mmol/L Cu（NO3）2·3H2O

12.07g加H2O→100ml R-4

三乙醇胺

1.0mol/L

三乙醇胺10ml，加水→100ml R-5 NaOH液

1mol/L R-6

铜试剂 R-3 10ml+R-4 10ml+R-6 6ml

+H2O→100ml调pH至8.1 R-7

二苯卡

巴肼液

二苯卡巴肼（乙醇）液（4g/L）10ml+R-4 0.1ml

临用前配制 R-8

软脂酸标准贮存液

2mmol/L

软脂酸51.2mg溶于100ml R-1液

冷藏 R-9 R-8的应用液

500μmol/L

用R-1液稀释

冷藏

3．操作

按图15-7操作。

4．计算

血清游离脂肪酸（μmol/L）=ESA/EST×500

二、酶法

1．原理

血清中游离脂肪酸或非酯化脂肪酸（NEFA），经酶试剂作用生成紫色化合物，其颜色深浅与NEFA含量成正比。

2．试剂组成

代号

种类

组成

浓度贮存

贮存 R1

缓冲液

磷酸缓冲液 MgCl2液

去垢剂

0.04mmol/LpH6.9

3mol/L R2

酶/辅酶

乙酰CoA合成酶

抗坏血酸氧化酶 CoA ATP

4-AAP

溶于10ml R1液中

≥0.3U/ml

≥1.5U/ml

0.9mmol/L

5.0mmol/L

1.5mmol/L

冷藏5日 R3

酶稀释液

苯氧乙醇

去垢剂

0.3%(V/V) R4

马来酰亚胺

该试剂与R3等体积混合

10.6mmol/L R5

酶试剂

乙酰CoA氧化酶

过氧化物酶 TOOS

混合上述试剂，再等体积R4试剂混合

≥10U/ml

7.5U/ml

0.2mmol/L

冷藏5日 R6

标准液

1mmol/L

冷藏

*应用带玻塞离心管

3．操作

按图15-8操作。

4．计算

图15-7 血清非酯化脂肪酸测定(光度法)操作图

图15-8 血清非脂化脂肪酸测定（酶法）操作图

（胡汉宁 储建中）

参考文献

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