第三节抗体的提取与纯化

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     精制免疫球蛋白的方法很多。一般采用综合技术，避免蛋白变性。如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。

    一、盐析法

    取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。

    ↓4℃，3h以上，使其充分沉淀

    离心(3000rpm),20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。

    ↓置4℃3h以上，[此时，(NH4)2SO4的饱和度为33%]

    重复上述第二步过程1～2次。末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02% mol/L pH7.4PBS溶解至x ml装入透析袋。

    ↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。

    取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。

    影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意(参阅本章第二节)。

    二、冷酒精沉淀法

    分离过程如下。血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精(-20℃)到最终浓度为20%，保持在-5℃。产生的沉淀(A)，含有大多数种类的免疫球蛋白。沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液(冷)中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀(B)，包括大部分的IgA和IgM，IgG留在上清液内。调节上清液的pH到7.4，加冷酒精(-20℃～-30℃)到最终浓度为25%，维持在-5℃。所得到的沉淀(C)含有90%～98% IgG。不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。见表2-5。从沉淀(B)可按下述方法进一步分离出IgA和IgM的混合物：将沉淀(B)悬浮在0℃

    水中，调节pH到5.1，离心去除不溶的蛋白。调节上清液离子强度到0.01～0.0075,pH5.5。然后加冷酒精到最终浓度为10%，保持在

    –2℃或-3℃低温，所得的沉淀(B-B)主要含IgA和IgM。

    表2-5 从几种动物和人血清沉淀A分离IgM的条件

    物 种 pH

    沉淀条件 IgG产量

    酒精浓度(%)

    离子强度

    人

    5.1

    15.

    0.01

    65

    山羊

    5.2

    0

    0.01

    65

    家兔

    5.2

    10

    0.01

    70

    大鼠

    5.0

    15

    0.01

    50

    豚鼠

    5.1

    15

    0.01

    70

    三、DEAE-Sephadex A-50 柱层析纯化免疫球蛋白

    原理：DEAE-Sephadex A-50(二乙氨基—乙基-葡萄糖凝胶A-50)为弱碱性阳离子交换剂。用NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可吸附酸性蛋白。血清中的γ球蛋白属于中性蛋白(等电点为pH6.85～7.5)，其余均属酸性蛋白。PH7.2～7.4的环境中，酸性蛋白均被DEAE- Sephadex A-50吸附，只有γ球蛋白不被吸附。因此，通过柱层析，γ球蛋白便可在洗脱中先流出，而其他蛋白则被吸附在柱上，从而便可分离获得纯化的IgG.

    (一)操作步骤

    1．DEAE-Sephadex A-50预处理 称DEAE-Sephadex A-50(下称A-50)5g，悬于500ml蒸馏水内，1h后倾去上层细粒。按每克A-50加0.5mol/L NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5mol/L NaOH液中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至 pH呈中性；再以0.5mol/L HCl同上操作过程处理，最后以0.5mol/L NaOH 再处理一次。处理完后，将A-50浸泡于0.1mol/L pH7.4PB中过夜 。

    2．装柱

    (1)将层析柱垂直固定于滴定架上，柱底垫一圆形尼龙纱，出水口接一乳胶或塑料管并关闭开关。

    (2)将0.1mol/L ,pH7.4PB沿玻璃棒倒入柱中至1/4高度，再倒入经预处理并以同上缓冲液调成稀糊状的A-50。等A-50。等A-50凝胶沉降2～3cm高时，开启出水口螺旋夹，控制流速1ml/min，同时连续倒入糊状A-50凝胶至所需高度。

    (3)关闭出水口，待A-50凝胶完全沉降后，柱面放一圆形滤纸片，以橡皮塞塞紧柱上口。通过插入橡皮塞之针头及所连接的乳胶或塑料管与洗脱液瓶相连接。

    3．平衡 启开出水口螺旋夹，控制流速12～14滴/min。使约2倍床体积的洗脱液流出。并以pH计与电导仪分别测定洗脱液及流出液之pH值与离子强度，两者达到一致时关闭出水口，停止平衡。

    4．加样及洗脱 启开上口橡皮塞入下口螺旋夹，使柱中液体缓慢滴出，当柱面液体与柱面相切时，立即关闭出水口，以毛细滴管沿柱壁加入样品(体积应<床体积2%，蛋白浓度以<100mg为宜)。松开出水口螺旋夹使面样品缓慢进入柱内，至与柱面相切时，立即关闭下口，以少量洗脱液洗柱壁2～3次；再放开出水口，使洗液进入床柱，随后立即于柱面上加入数毫升洗脱液，紧塞柱上口，使整个洗脱过程成一密闭系统。并控制流速12～14滴/min。

    5．收集 开始洗脱的同时就以试管进行收集。每管收集3～5ml。共收集10～15管。

    6．测蛋白 以751型紫外分光光度计分别测定每管OD

    280nm, 与OD

    260nm,按公式计算各管蛋白含量 。并以OD

    280nm为纵座标，以试管编号为横座标，绘制洗脱曲线。

    7．合并、浓缩 将洗锐峰的上坡段与下坡段各管收集液分别进行合并，以PEG(MW6000)浓缩至所需体积，加入0.02% NaN3防腐，于4℃保存备用。长期保存时应贮于-40℃冰箱。

    8． A-50凝胶的再生 在柱上先以2mol/L NaCl洗脱蛋白至流出液的OD

    280nm<0.02，再以蒸馏水洗去柱中盐。然后按预处理过程将A-50再处理一遍即达到再生。近期用时泡于洗脱缓冲液中4℃保存；近期不用时，以无水酒精洗2次，再置50℃温箱烘干，装瓶内保存。

    (二)注意事项

    (1)柱的选择：从理论上说，只要柱足够长，就能获得理想的分辨率，但由于层析柱流速同压力梯度有关，柱长增加使流速减慢，峰变宽，分辨率降低。柱的直径增加，使流体流动的不均匀性增加，分辨率明显下降。

    (2)纯化过程必须严格控制缓冲液的pH及离子强度。样品与A-50凝胶必须用洗脱缓冲液彻底平衡后，才能进行柱层析。

    (3)所装的柱床必须表面平整，无沟流及气泡，否则应重装。

    (4)洗脱过程中应严格控制流速，切勿过快。

    (5)上样的体积要小，浓度不宜过高。

    (6)加样及整个洗脱过程中，严防柱面变干。

    四、SPA-Sepharose CL-4B 亲合层析纯化 IgG及IgG亚类

    (一)原理

    葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B 柱上的IgG或不同的 IgG 亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。

    (二)操作步骤

    用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml上述缓冲液充分洗涤凝胶，(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)。

    ↓

    装柱后用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡。

    标本可用硫酸铵粗提物，先10000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤，上样前用1mol/L pH9.0 Tris 液调整标本液pH至8.1或对平衡液透析过夜。

    ↓

    加样，一般按25～30mg IgG/g湿胶比例加样，室温作用15min，用0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液充分淋洗，到淋洗液OD值为<0.02。

    ↓

    用不同pH的枸橼酸洗脱液洗脱，流速20ml/h。如纯化小鼠IgG1一般用pH6.0;纯IgG2a用pH4.0；纯化IgG2b用0.1mol/L pH3.0醋酸盐缓冲液0.1mol/L pH3.0glycine-HCl缓冲液洗脱。

    ↓

    用pH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。

    ↓

    收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定。

    (三)试剂器材

    (1)SPA-Sepharose CL-4B (pharmacia)

    (2)磷酸缓冲液0.1mol/L pH8.0+0.02% NaN3

    (3)枸橼酸缓冲液

    0.1mol/LpH6.0

    0.1mol/LpH4.0 +0.02% NaN3

    0.1mol/LpH3.0

    (4)1mol/L pH9.0 Tris溶液

    (5)再生缓冲液：①0.1mol/L Tris含0.5mol/L NaCl调整pH至8.5+0.02% NaN3;②0.1mol/L 醋酸钠含0.5mol/L NaCl调整pH至4.5+0.02%NaN3。

    (四)注意事项

    (1)SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法：

    先用10倍柱体积0.1mol/L pH8.5 Tris含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1mol/L pH4.5醋酸钠缓冲液含0.5mol/L NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。

    (2)SPA-Sepharose CL-4B亲 合层析法还可用于：①除去抗体液中IgG,检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；②除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段；③吸收或纯化免疫复合物。

    (3)狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。

    五、高效和液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体

    从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲合层析等。应用TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率高 ，而且保持良好的生物学活性。

    (一)原理

    根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增加洗

    脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。

    (二)操作步骤

    腹水离心10000 g,10min，除去细胞和杂质，在4℃下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为40%饱和硫酸铵

    ↓搅拌20～30min

    离心，沉淀用40%饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(pH8.5,20mmol/L Tris缓冲液)透析除盐

    ↓4℃过夜

    用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的TSK DEAE SPW离子交换层析柱

    ↓

    洗脱流速1ml/min

    0～1min ：0→5%缓冲液B(20nmol/L Tris, Ph 8.5,含2.0 mol/L醋酸钠)

    1～2 min( 线性梯度洗脱)：5→20%缓冲液B

    20～22min：20→0%缓冲液B

    ↓

    洗脱液用紫外280nm进行监测

    ↓

    收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定

    (三)试剂和器材

    (1)TSK DEAE SPW离子交换层析柱 (75mm×7.5mm,Bio Rad)

    (2)高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测系统)

    (3)PBS，缓冲液A和B。

    (四)注意事项

    (1)所用缓冲液和加样粗提物均需0.2μm滤膜过滤。

    (2)在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11-12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb

    的存留时间(retention time)有所差异。

    【附录】

    制备单克隆抗体常用的试剂

    1．RPMT-1640培养液 其中含2mmol/L 谷氨酰胺，25 mmol/L Hepes,5×10-5mol/L

    2-巯基乙醇2. RPMT-1640完全培养液 上述溶液加10%～20%灭活小牛血清

    3．HT母液×100

    次黄嘌呤(H)

    1.0×10-2mol/L

    136.1mg

    胸腺嘧淀核苷(T) 1.6×10-3mol/L 38.8mg

    蒸馏水 100ml

    4. A母液×100

    氨基喋呤(A) 4×10-3mol/L

    1.76mg

    蒸馏水 90.0ml

    1mol/LNaOH 0.5ml

    溶解后,加1mol/L HCl 0.5ml,再补加蒸馏水至100ml 。

    5．HAT选择培养液 RPMI-1640培养液

    80ml

    灭活小牛血清 20ml HT母液×100

    1ml A母液×100

    1ml

    用5%NaOH调节pH至7.4左右。

    6．HT培养液 RPMI-1640培养液

    80ml

    灭活小牛血清

    20ml HT母×100

    1ml

    用5%NaOH调节pH至7.4左右。

    参考文献

    1．北京医学院微生物学教研室.实用免疫学.北京：人民卫生出版社，1980.3

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    (宋 朝 佑 倪 鑫)

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