第三节 仪器法血细胞检查

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第三节 仪器法血细胞检查

前面章节已经介绍了手工操作的血细胞计数方法。可发看出，由于操作地程的随机误差，实验器材的系统误差及测方法本身的固有误差，手工法细胞良数不但费时费力，实验结果的精神桷性、准确性也受影响。50年代初期，美国的库尔特研制了电阻抗血细胞分析仪器开创了血细胞分析的新纪元，随着基础医学的发展、高科技技术的应用，特别是计算机技术的引用，血细胞分析仪的测量水平不断得高，测量参数不断增加。不但得高了医学检验水平，还为临床提供了更多的有用的实验指标，对于某些疾病的诊断与治疗具有重要的临床意义。

一、电阻抗法血细胞分析仪测试原理

(一)白细胞分析原理

50年代初，库尔特(W。H。Coulter)发避孕药并申请了粒子计数技术的设计专利，其理是根据血细胞埋传导的怀质，以电解质溶液中悬浮的白细胞在通过计数时引起的电阻变化进行检查为基础，进行血细胞计数和体积的测定，这种方法称为电阻抗法，也称为库尔特原理(图2-7)

图2-7 电阻抗法血细胞计数原理

把用等渗电解质溶液(被称为稀释液,diluent)稀释的细胞悬液侄入一个不导电的容器中，将小孔管插到细胞悬液中。小孔管是电阻抗法细胞计数的一个重要的组成部分，其内侧充满了稀释液，并有一个内电极，外侧细胞悬液中有一个外电极。检测期间，当电流以接通通后，位于小孔两侧的电极产生稳定的电流。稀释液通过小孔孔管壁上固有的小孔(直径一般<100μm.厚度为75μm左右)向小孔内部流动。因为小孔这壁充满了具有专导性的液体，其电子脉冲是稳定的。如果供给电流I和阻抗Z是稳定的，根据欧姆定期律通过小孔的电压E也是不变的(这时E=IZ)。当有一个细胞通过小孔时，由于细胞的导电性质比稀释液要低，在电路中小孔感应区内的电阻的增加，于瞬间能上能下起了电压变化而出现一个脉冲信号，自然数为通过脉冲。电压增加的变化的程度取决于非传导的细胞占据小孔感应区的体积，即细胞体积越大，引起的脉冲越，产生的脉冲振幅越高，脉冲信号经过下列步骤，得出细胞计数结果。

1.放大：由于血细胞通过微孔时产生的脉搏冲讯号非常微弱，不能直接触发计数电路，因此必须通过电子放大器械，将微伏讯号放大为优级脉冲扭号。

2.甄别：通过微孔时的各种微粒均可产生相应脉冲讯号，讯号电平(脉冲幅度)与微粒在小成正比。因除血细胞外，血中细胞外，血中细胞碎片、稀释液中杂质微粒均可产生假讯号，使计数结果偏高。所谓甄别就是利用甄别器根据阈值调节器提供的参考电平，将低于参考电平的假讯号去掉，以提高细胞计数的准确性。

3.阈值鹿茸：在一定范围内调节参考电平的大小，使计数结果可能符合实际。

4.整形：经过放大和甄别后的细胞脉冲讯号波形尚不一致必须经过整形器作用，修整为形伏一致标准的平顶波后，才能触发电路。

5.计数：血细胞的脉冲信号，经过放大、甄别、整形后，送入计数系统。各型血液分析仪器计数系统甄别方式不同，通过各种方式得出计数结果。(图2-8)

图2-8 仪器监测屏上显示白细胞通过脉冲

目前很多仪器在给出细胞数据结果之外，是时提供细胞体积分布图形，这些可以表示出细胞群体分布情况的图形，称为细胞分布直方图(图2-9)。直方图是由测量通过感应区的每个细胞脉冲累积得到的，是在计数的同时进行分析测量的。如图2-8所示，示波器显示的是所分析的细胞的脉冲大小，图2-9是相应的体积分布直方图，横坐标为体积，纵坐标是血细胞的相对数量，血细胞分析仪在进行细胞分析时将每个细胞的脉冲根据其体积大小分配并存在相应的体积通道中，每个通收集的数据被统计出相对数并表示在Y轴上。体积数据以飞机升(fl)为单位，表示在X轴上。

在进行白细胞体积分析时，仪器计算机部分可以将白细胞体积从35-450fl 分为256个通道(channal)，每个通道为1.64fl，细胞根据其大小被分别放在不同的通道中，从而得到白细胞体积分布的地直方图。(图2-10)

图2-9 细胞体积直方图

图2-10 三部法血液分析仪白细胞分布直方图

经过溶血剂处理后的白细胞可以根据体积大小初步确认其相应的细胞群：第一群是小细胞区，主要是淋巴细胞。第二群是单个核细胞区，也被称为中间细胞(MID)，包括单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，核象左移或白血病可有各阶段幼稚细胞及白血病细胞。第三群是大细胞区，主要是中性粒细胞(GRAN)。仪器根据各亚群占总体的比例计算出各亚群的百分率，如果与该标本的白细胞总数相乘，即得到各类细胞的绝对值。可以看出，电阻法只是根据细胞体积的大小，将白细胞分成几个群体。在一个群体中，可能发某种细胞为主(如小细胞区主要是淋巴细胞)，但由于细胞体积间的交叉，可能还有其它细胞的存在。显然习惯上甩称的三分类、二分类血细胞分析仪达个名称是不够确切的。国外多采用三部法(3-part)或二部法(2-part)称之。国内也有专家建议使用三分群或二分群描述电阻抗法血细胞分析仪的白细胞分类。

(二)红细胞测试原理

根据各项参数在血液分析仪检测原理的不同，检测大致分为三个部分。

1.红细胞数和红细胞比积迄今，绝大多数血液分析仪使用电阻抗法进行红细胞计数和红细胞比积测定，其原理同白细胞一样。红细胞通过小孔时，形成的相应的脉冲的多少即红细胞的数目，脉冲的高度代表单个脉冲细胞的体积。脉冲高度叠加经换算即可得到红细胞的比积(有的仪器先以单个细胞高度计算平均红细胞容积(MCV)，再乘以红细胞的数得出红细胞比积。)稀释的血液进入红细胞检测通道时，其中含有白细胞，因此，红细胞检测的各项参数均含有白细胞因素，但正常血液有形成分中白细胞比例很少，故其影响可忽略不计，要某种病理情况下，如白血病，白细胞数明显增加而又伴严重贫血时，即可使所得务项参数产生明显误差。根据所测单个红细胞体积及相同体积细胞占总体的比例，可打印出红细胞体积分布直方图。

2.血红蛋白测定：任何类型、档次的血细胞分析仪，血红蛋白测定原理是相同的。被稀释的血液的加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血剂结合形成血红蛋白衍生物，进入血红蛋白测试系统，在特定波长(一般在530-550nm)下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例，仪器便可显示Hb浓度。不同系列血液分析仪配套溶血剂配方不同，形成的血红蛋白衍生物亦不同，吸光度各异但最大吸收峰均接近540nm .这是因为ICSH推荐的氰化高铁法，HICN最大吸收峰在540nm。校正仪器必须以HICN值为标准。大多数系列血液分析仪溶血剂内均含有氰化钾，与血红蛋白作用后形成氰化血红蛋白(注意不是氰化高铁血红蛋白)，其特点是显色稳定，最大吸收峰接近540nm，但吸收光谱与HICN有明显的不同。此点在仪器校正时应十分注意。

为了减少溶血剂的毒性，避免含氰化的血红蛋白衍生物检测后的污物处理，近年来，有些血液分析仪使用非氰化溶血剂(如SLS-HB)实验证明，形成的衍生物与HICN吸收光谱相似，实验结果的精确性、准确性达到含有氰化物溶血剂同样水平。既保证了实验质量又避锡了试剂对分析人员的毒性和环境污染。

3.各项红细胞指数检测原理：同一手工法一样，MCV、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、红细胞体积分布宽度(RDW)均是根据仪器检测，的红细胞数、红细胞比积和血红蛋白量的实验数据，经内存电脑换算出来的。

RDW由血液分析仪器测量后获得，是反映外周血红细胞体积异质性的参数。简言之，是反映红细胞大小不等的客观指标。多数仪器用所测红细胞体积大小的变异系数来表示，即RDW-CV，也有的仪器采用 RDW-SD报告方式。

红细胞通进小孔的一瞬间，计数电路得到一个相应的大小的脉冲，脉冲的高度是由细胞体积大小决定的，不同大小的脉冲的信号分别贮存在仪器内装计算机的不同通道内，计算出相应的体积及细胞数后，统计处理而得RDW 值。由于RDW 来自十几秒内近万个红细胞的检测数据，不但愿可以克服测量红细胞直径时人为制片因素和主观因素等影响，还较P-J曲线更能直接、客观、及时地反映红细胞大小不等程度，对贫血的诊断有重要意义。 RDW的正常参考范围见表2-4。

表2-4 RDW正常参考范围

*为北京协作组六家医院使用五种型号全自动血细胞分析仪调查2013例成人(男1013例，女1000例)RDW结果。

(三)血小板分析原理

目前有半自动、全自动两种血细胞分析仪器仪器的红细胞计数微孔旁有一股稳定持续的稀释液流，称扫洗液体。其流向与孔呈直角，使计数后的流体流走，可防止计数后细胞重新进入循环。计算机还可进行一次校正，即对有多个细胞是时经过通道时，只计一个脉冲数情况的校正。校正指数与计数值多少相关。另钉，用一个脉冲编排器消除中心轴外的颗粒计数及检测各种细胞经小孔时引起的电阻变化，脉冲经数学化后，数字被送到记忆线路全程，储存于体积通道中，形成直方图。血小板计数储存于64道直方图范围为2-20fl。不同仪器血小板直方图的范围不一。平均血小板体积就是此平整曲线所含的群体算术平均体积，所以MPV也就是PLT大小分布直方图的产物。为了使血小板更准确，有些仪器专门设置了增加血小板准确性的技术，如鞘流技术、浮动界标、拟合曲线等。

二、血细胞分析仪检测参数的临床意义

(一)细胞直方图的应用

1.白细胞直方图变化的临床意义，前已述及，在进行白细胞计数时，细胞根据体积大小分配在不同计算机通道中，从而得到白细胞体积分布直方图。反之从图形的变化可以会计被测血液中细胞群体的变化。这种变化细胞图形并无特异性。比如中间细胞群可包括大淋巴细胞、原始细胞、幼稚细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞，其中任何一类细胞的增多，均可使直方图产生相似变化，只是提示检查者粗略者判断细胞比例变化或有无明显的异常细胞出现 ，进而在显微镜下检查中注意这些变化或在正常人体栓中，筛选是否需要进一步作血涂片检查。图2-11显不的是各种血液学异常时，直方畋的变化，可以看出，尽管引起血液学变化的病因不同、细胞形态变化不同，但直方图型很相似，说明白细胞直方图形变化并无特异性。

图2-11 不同疾病白细胞分布直方图

图中横坐标为细胞体积，纵坐标为细胞相对数量，黑色区域是正常细胞分布图

(a)来自末梢血淋巴细胞增多(其中大颗粒淋巴细胞占42%)
(b)为急性非淋巴细胞性白血病(M₂)(其中幼稚细胞占72%)的图形
(c)为急性淋巴细胞白血病(L₂)(幼稚细胞63%)的图形

另外，白细胞直方图的变化也可反映某些人为的或现变化扰白细胞计数和分类计数的情况，比如外周血出现有核红细胞或巨大血小板，采血时由于技术大兵在造成血小板聚集或某些病理因素使红细胞膜对溶血剂有抵抗作用，使红细胞溶血不完全，以至测检标本中大量红细胞膜碎片等情况，均可使白细胞直方图在50fl以下区域出现一个或大或的小峰。因此当实验结果出现这种图形时，提示白细胞计数和分类计数均不准确，需在采取相应的手段进一步检测。

2.红细胞体积直方图的临床意义：与白细胞直方务图意义不同，某些贫血红细胞体积直方图的其特点，此种图形变化再结合其它参数进行分析，对鉴别诊断颇有价值。分析时，要注意观察图形的位置，峰底的宽度、峰顶的形态及有无双峰出象。

下面介绍几种贫血时图形变化：

(1)缺铁性贫血的直方图(2-12A)：其特点为曲线波峰左移，峰底变宽，显示小细胞不均一性。

(2)轻型β-血红蛋白合成障碍(β-珠蛋白障碍性贫血)的直方图图形表现为小峰左移，峰底变窄，典型的小细胞均一性贫血。

(3)铁粒幼细胞性贫血的直方图显示红细胞呈典型的双形性改变(即同时存在着两类型的红细胞，一种是低色素红细胞，另一种是正常形态的红细胞)多见于铁粒幼细胞性贫血。在缺铁性贫血经治疗有效时，也可出现类似的图形，但峰底要更宽些。

(4)顺酸缺乏引起的巨连续剧细胞性贫血治疗前与治疗后的直方图治疗前直方图波峰右移，峰底增宽，显示明显的大细胞不均一性，是叶酸或维生素B₁₂缺乏引起巨连续剧细胞性贫血的重要直方图特征。给予叶酸或维生素B₁₂后，幼稚细胞分化成熟正常，正常红细胞逐步释放入血液，而病理细胞并完全消亡，检测时即再出现双峰形，说明治疗有效。

应该指出，不同型号仪器其特点及使用稀释液不同，红细胞直方图的形态亦异常，但反映病理变化基本特征是相同的，不同实验室应根据本室仪器的图形进行对比分析。

3.血小板直方图的变化：血小板测量结果是根据血小板直方图得出的，微机根据直方图形态，绘出拟合曲线，决定大血小板数目的补偿并计算MPV、PCT、PSW各项参数。当测标本中小细胞增多或出现细胞碎片或血小板凝聚时影响实验结果，血小板体积直方图均能反映这些变化。因此在发出血小板报告之前，首先要观察其图形是否正常，如为异常的图形(见图2-13)，均为检查血液是整流器 有血小板凝聚，必要时作血涂片检查是否有小红细胞或大血小板增多现象。

图2-12 不同类型贫血红细胞体积分布直方图

(图中横会标是细胞体积(fl)，纵坐标代表红细胞相对数量。黑色区域是正常图形)
(A)缺铁性贫血图形
(B)轻型珠蛋白生成障碍性贫血
(C)铁粒幼细胞贫血图形
(D)、(E)治疗前后巨幼细胞性贫血图形

图2-13 不同情况血小板体积直方图
图中横坐标为血小板体积(fl)纵坐标代表血小板相对数量，黑色区域是正常图形
(a)标本中含有大量红细胞碎片引起图形变化
(b)标本中有多数血小板聚集
(c)由于标本中小红细胞增多所致

(二)RDW的临床意义

1.鉴别缺铁性贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血，由于Hb合成障碍，缺铁性贫血和轻型β-珠蛋白生成障碍性性贫血均可表现为小细胞低色素性贫血，但前者红细胞形态明显小于不等，后者形态大小较为均一。Bassman曾分析了两类贫血患者的RDW变化，发出53例缺铁性贫血RDW全部增高(异常率为100%)，而44例轻型β-珠蛋白生成障碍性贫血中38例中RDW正常(正常率为88%)他认为RDW可作为此两类贫血筛选及鉴别指标。

2.诊断向导铁性贫血：鉴于95%以上的缺铁性贫血的RDW均异常，一般认为，如果患者血液检查表现为小细胞低色素性贫血而RDW正常，此类病人患缺铁性贫血的可能性不大。

3.进行贫血的新形态学分类(MCV/RDW分类)根据不同病因引起的贫血的红细胞形态特点不同，Bassman(1983)观察各种贫血红细胞参数变化，提出了MCV、RDW贫血分类法(见表2-5)将其分成六类。实践症明：这种分类方法更能反映贫血的病理变化对贫血的鉴别诊断有一定参考价值。

表2-5 MCV、RDW 贫血分类法

(三)血小板测量参数的临床意义

1.涸小板各项参数的正常参考范围：有文献报道国内2013例正常人成人血小板计数参考范围大致为(100-300)×10⁹/L，而MPV和参考值并非一个统一的范围。Bassmen测量683例年龄为20-34岁正常人积压小板数和MPV值，发现人种及性别间无显明差异，但MPV的正常范围地随群体中不同血小板数量而变化的，根据检测结果设计了一个关于血小板数和血小板体积的列线图(见图2-14)，用于分别估计每个人的结果是否异常。

图2-14 血小板数与MPV的关系

2.血小板各项参考测定的临床意义

(1)血小板计数的临床意义：见第三章

(2)MPV变化的临床意义：各种疾病PLT 与MPV可出现以下几外方面结果：1)血小板数低而 MPV增升高：骨髓自身正常，但外周血血小板破坏增多造成血小板降低的刺激后反应性增生时，巨核细胞 DNA倍体数及细胞大小都增加， MPV也增高。由于骨髓受抑制而造成血小板减少的病人在恢复初期 MPV也升高，这主要因外周血血小板数减低应激性地致使巨核细胞倍体数增加所致。

2)血小板数高、MPV正常：骨髓增生性疾病如血小板增多，红细胞增多但MPV正常。

3)血小板数与MPV值均下降：AIDS (艾滋病)病毒直接影响巨核细胞并导致血小板减少。大约2/3的病人血小板数降低，92%的病人MPV值下降，与骨髓受抑时的血小板状态相似。患发育不良性贫血的病人积压小板数通常都降低，其 MPV值也低，但 PDW升高。当骨髓纤维化或被脉冲瘤细胞浸润危及正常造血时，血小板数减少，随即 MPV值也降低。再生障碍性贫血，骨髓瘤或白血病化疗后，败血症所致血小板沽少等骨髓受抑性疾病中，虽然仍可能有一些大血小板，但血小板的平均体积减小。

4)MPVE值与血小板数都升高：反应性血小板增多症病人中，其 MPV值升高，因血液的流失和本内损伤造成的急性大失血都可使血小板值上升。

5) MPV值升高而血小板正常：慢性髓细胞性白血病、骨髓纤维化、脾切除均可周到MPV升高，慢性髓细胞性白血病和骨髓纤维化主要使骨髓增生异常，两种疾病中，血小板体积经常增大并大小不均。外周血涂片中可出现大血小板。半数 α-型和β-型珠蛋白生成障碍性贫血的患者有4种明显的血液学改变；血小板大小改变、红细胞大小改变、肝珠蛋白改变和对疟原虫抵抗力改变。其MPV值增高而血小板数正常。

另外，因为MPV先于 PLT变化，因此，可用于观察病情变化。白血病化疗时， MPV上升是 BM恢复的第一特征。在感染时 Lelie等认为，局部炎症的 MPV正常而败血症中则一半病人有 MPV增加；并认为 MPV持续低时，说明存在感染未控制而继续抑 PLT抑生成，如 MPV随 PLT数持续下降则为骨髓衰竭的特征。 MPV越小越严重，直到 MPV上升， PLT数才恢复。 Elder每日检测 MPV并观察结果，以了解出血性素质病人的变化，发现有出血倾向者 MPV显著低于无出血倾向者，即使严重 PLT下降者，如 MPV>6.4fl，出血发生率也低。Thompson研究结果表明MPV与PLT体外功能之间明显相关，对佼原和凝血酶诱导的PLT聚集，其速度信程度随MPV增加而增加。

三、方法学评价

白细胞计数及分类有两种方法：一种是显微目视法，一种是血液分析仪方法。显微镜法是基础，血细胞分析仪在要根据显微镜法准确计数结果进行校正后方能使用，但这种计数不同于常规工作进行的白细胞计数，根据统计学研究白细胞计数结果的总变异系数为：

(公式中nb为所见实际数目，nc为用计算盘的次数，np为用吸管的次数)。

在一个标本中，只有使用多支吸管，使用多次(个)计数盘，计数细胞数量达到一定程度时，才能避免细胞在计数盘分布的固有误差，计数盘和吸管的系统误差和操作随机误差的影响，使计数结果接近真值。一般在进行血细胞分析仪校正时，应使用这种方法。但实常规检验中，目视法很难达一上述在求。由于上述各方面误差的影响，白细胞计数的重复性和准确相对较差。经过严格校正的血细胞分析仪，由于计数细胞多，计数的每个步骤都可标准化，便于质量控制(特别是全自动血液分析仪)，计数的精确性、准确性均较高(CV可在2%以下)。这一点在红细胞计数和血小板计数时也是相似的。

仪器法白细胞分类有两大类：一类是电阻抗法，这类仪器是根据溶血剂作用后的白细胞大小，人为地分成几个部分，显然这种分类是不够准确的。另一类是利物用各种高科技技术联合对同一白细胞的体积、细胞核形状及胞质中颗粒进行检测，综合分析后，进行细胞分类。这种多方位检测分类法，可较准确地进行白细胞分类，但仍不能准确地检查白细胞形态的病理变化，特别是对幼稚白细胞的检测。因此必须强调，仪器法白细胞分类计数，只能提供正常血液标本(血红蛋白、白细胞数、血小板数均正常)中各种白细胞数目的大致分布情况或为常规工作进一步镜检提供筛选的信息，而决定不能完全代替油浸显微镜下进行的白细胞分灯检查，另外由于目视法与仪器法实验方法的不同，且全自动力血液分析仪多使用静脉血检测，仪器法测定值的参考范围与传统使用的目视法的参考值有所差异，表2-6是近年来国内外文献介绍的静脉血全自动血细胞公析仪的正常参考范围。

表2-6(1) 血细胞分析仪检测静脉血各项参数胡考值

表2-6(2) 血细胞分析仪检测静脉血各项参数参考值 [续表(1)]

1)摘自：周子秋主编，实用临床检查，1993
2)摘自：Williams 主编，hematology，第15版，1995
3)摘自：北京市成人静脉血正常参考值调查，中华医学检验杂志，1996(3)
4)摘自：Bassmen主编， Automateb Blooc Blood Countw and Differentials，1986

虽然血液分析仪提高了实验结果的精确性和准确性，但先进的仪器应用，必须有一套全面质量管理措施，性质在有高素质的技术人员。这方面包括：

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