流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程

http://www.100md.com 《生物制品规范》

<流行性乙型脑炎灭活疫苗制造及检定规程

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<流行性乙型脑炎(下称乙脑)灭活疫苗是将乙脑病毒接种于地鼠肾细胞，培育后收获病毒液，加入甲醛溶液将病毒杀死后制成。用于预防乙脑。

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1 <毒种

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1<.1 <毒种来源

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P3株病毒，每<3～<5年应用新分离的乙脑流行株病毒检查

<1.2 毒种检定

<1.2.1 无菌试验

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<毒种启封和每次传代后均需做无菌试验，合格者方可使用。

<1.2.2 病毒滴定

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每正代必须用体重7～9g小白鼠进行脑内滴定，滴度≥9.0LogLD50/1.0ml可用于生产。

<1.2.3 纯毒试验

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<生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。中和指数必须在<500<以上。生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。

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1<.3 毒种传代

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分正亚代传递。从检定所取回的干燥毒种传递不超过15代称正代，由正代传递一代直接用于生产称亚代。每次用于传代的毒种不得少于3个鼠脑。

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传代时选用体重7～9g健康小白鼠或乳鼠，脑内接种病毒，72小时后选眼结膜正常，有典型痉挛战粟、肢体麻痹的小白鼠，无菌取脑并进行无菌试验。

<1.4 毒种保存

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鼠脑毒种收剖经无菌试验后立即保存于-60℃以下，无菌试验通过后方可<使用。亦可将鼠脑毒种研磨乳化制成<10%<脑悬液，分装小瓶冻存于<-60<℃以下，无菌试验合格后备用。

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2 <疫苗制造

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2<.1 <细胞制备

<2.1.1 地鼠

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<选用健康地鼠。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。

<2.1.2 细胞消化及培养

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取肾剪碎，用适量的胰蛋白酶溶液消化。用营养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃进行培养。营养液中牛血清含量不得超过8%。

<2.1.3 外源因子检查

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每生产批细胞留5%(或不少于500ml)悬液作为对照细胞检查外源病毒。该细胞除不接种病毒外，细胞浓度和处理均与生产过程平行进行，至原液收获之日用显微镜观察，应无病变发生。并用0.2%～0.5%豚鼠红细胞(4℃保存不超过7天)进行血吸附试验，置4～8℃30分钟判定结果，再置20～25℃30分钟再次判定结果，均应为阴性。如有可疑病变或血吸附可疑阳性，在同种细胞上继续盲传，如传出病毒，该批细胞制备的疫苗应予废弃。

<2.2 病毒接种和培育

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挑选生长良好的细胞瓶，充分淋洗细胞后加入适量维持液，接种病毒，病毒量不得>7.0LogLD50/1.0ml。在适当温度下培育适当时间，弃去病毒培养液，换以新维持液，继续培育一定时间。

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<疫苗生产过程中不得加青霉素或其他β内酰胺类抗生素。

<2.3 原液

<2.3.1 过滤

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<选择有典型细胞病变的培养瓶，经肉眼检查无菌者进行澄清过滤，细胞质量好时，可再加入新维持液，继续培育，再次收获病毒液。

<2.3.2 病毒灭活

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过滤后的原液，于取出无菌试验和病毒滴定样品后加入甲醛溶液，其最终浓度不得超过0.05%，置适当温度下一定时间灭活病毒。过滤后<加入硫柳汞防腐剂，其最终浓度不得超过<0.01%<。

<2.3.3 原液检定

<2.3.3.1 无菌试验

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<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<2.3.3.2 病毒滴定

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每个滴定批代表疫苗不得超过15万ml，将样品10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度用体重7～9g小白鼠4只，每只脑内接种0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度≥7.0LogLD50/1.0ml判为合格，不合格者可重试一次。

<2.4 半成品

<2.4.1 半成品取样

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<无菌试验合格及病毒灭活到期的疫苗原液，取样做灭活试验、效力试验和无菌试验。每次解剖的地鼠制备的疫苗为一生产批，按生产批进行检定，但每批灭活试验代表疫苗量不得超过<15<万

<2.4.2 半成品检定

<2.4.2.1 灭活试验

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(1)动物法：将样品脑内接种体重12～14g小白鼠8只， 每只 0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第一代；7天后将第一代小白鼠处死3只，取脑做成10%悬液，脑内接种6只小白鼠，为第二代；7天后将第二代小白鼠处死3只，同法接种6只小白鼠，为第三代。从接种之日起逐日观察14天，每代小白鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡者外，全部健存为合格。

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若传代3日后有个别小白鼠死亡，应立即取死鼠脑乳化成悬液再接种3只小白鼠，观察14天，该3只小白鼠健存仍判为合格。如仍有小白鼠死亡，该批疫苗应重试，重试合格后仍可使用。若传出活病毒应<重试，查明原因。必要时继续灭活并进行灭活试验，若仍传出活病毒，该批半成品应予废弃。

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<(<2<)细胞培养<-<动物法：将样品<25ml<透析<24<小时后，接种地鼠肾细胞或2<细胞片，置培养病毒的温度下培育<14<天，不得有细胞病变出现。到期的培养液脑内接种体重7～9g小白鼠10只，每只0.03ml，观察14天，应全部健存。若有死亡者应查明原因或重试，重试合格者仍可使用。不合格者应废弃。

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<以上两种灭活试验方法可任选一种。

<2.4.2.2 效力试验

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采用免疫小白鼠中和抗体测定法。中和抗体测定采用蚀斑减少试验。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清由中国药品生物制品检定所提供。

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将被检苗(T)和参考苗(R)稀释成1∶32腹腔免疫体重12～14g小白鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，间隔7天，第二次免疫后7天采血，分<离血清，同组小白鼠血清等量混合，<56℃<30<分钟灭活，备用。

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<稀释阳性血清、被检苗血清和参考苗血清，分别与稀释好的病毒(约<200PFU/0.4ml<)等量混合，同时将稀释好的病毒再<1∶<2<稀释，作为病毒对照，置<37<℃水浴作用<90<分钟，接种<6<孔板<

<判定标准

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(1)合格：T≥(RA+RB)/2-0.33

<(2)重试：(RA+RB)/2-0.66

<(3)不合格：T<(RA+RB)/2-0.66

<2.4.2.3 残余牛血清蛋白含量测定

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<用检定所认可的试剂和方法测定，残余牛血清蛋白含量应≤<50ng/ml<。

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3 <成品检定

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3<.1 <外观检查

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<疫苗应为橘红色透明液体，无异物，无沉淀。

<3.2 无菌试验

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<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<3.3 化学检查

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按《生物制品化学检定规程》进行。pH值为7.2～8.0。游离甲醛不高于0.05%，硫柳汞不高于0.01%。

<3.4 安全试验

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每批疫苗腹腔注射体重18～20g小白鼠4只，每只0.5ml，逐日观察3天，均应健存，如有小白鼠死亡，除检查原因外，应立即进行重试。

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3.5 <亚硫酸氢钠检定

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<分装后的亚硫酸氢钠要进行含量测定和无毒性试验。含量不得低于原配浓度的<60%<。无毒性试验系将样品稀释成<1∶<100<，腹腔注射体重<18<～<20g<小白鼠<2<只，每只<0.5ml<，观察<5<日，应全部健存。

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4 <保存与效期

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<保存于<2<～<8<℃暗处。自效力检定合格之日起效期为<2<年。

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<流行性乙型脑炎灭活疫苗使用说明书

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<本品系将流行性乙型脑炎病毒接种地鼠肾细胞，培养后收获病毒液，另入甲醛溶液将病毒灭活后制成，为橘红色透明液体，含硫柳汞防腐剂，用于预防流行性乙型脑炎。

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<接种对象

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<主要为<6<个月～<10<周岁儿童和由非疫区进入疫区的儿童和成人。

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<用法

<1.于上臂外侧三角肌附着处皮肤消毒后皮下注射。

<2.剂量如下：<