冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程

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冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程

本品系将流行<性乙型脑炎(下称乙脑)14-14-2减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞，经培育后收获病毒液，加保护剂冻干制成。用于预防乙脑。

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1 毒种

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1<.1 毒种来源

<乙脑SA14-14-2减毒株病毒。由中国药品生物制品检定所检定与分发。

<该毒株经用乙脑敏感动物试验证明其嗜神经毒力减弱，经检查无外源因子存在，用乙脑特异性免疫血清做中和试验证实为乙脑病毒，并经免疫力试验证明具有免疫原性，经临床观察证明安全有效。

<1.2 生产毒种批制备

<毒种启封后，在地鼠肾单层细胞上增殖传递，传递代数不得超过3代。从原始毒种算起，总代数不是超过10代。在传代细胞病变明显时收获病毒液，经检定合格后为生产毒种批。

<1.3 毒种检定

<1.3.1 无菌试验

<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<1.3.2 支原体检查

<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<1.3.3 病毒滴定

<抽样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。冻干毒种批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。做病毒滴定同时应用参考苗进行滴定，以判断试验结果是否成立。

<1.3.4 纯毒试验

生产毒种批与非同源性乙脑高价免疫血清混合，置<37℃<90分钟，接种地鼠肾单层细胞或

<1.3.5 脑内致病力试验

<生产毒种批原液接种体重12～14g小白鼠10只，每只脑内注射0.03ml，接种后3天内死亡者不计，观察14天应活存。3天后如有小白鼠发病，应杀死取脑测定致病力，对小白鼠的脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠脑悬液进行皮下致病力试验，观察14天，应健存。

<1.3.6 皮下感染人脑试验

<生产毒种批原液接种体重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应健存。

<1.3.7 乳鼠传代返祖试验

生产毒种批原液接种<3～<5日龄乳鼠<10只，每只脑内注射<0.02ml。将发病的乳鼠杀死<3只，解剖取脑测其致病力，用体重<12～<14g小白鼠测定，脑内毒力不应超过<3.0LogLD₅₀/0.03ml，同时皮下注射<10只小白鼠<，每只0.1ml10-1乳鼠脑悬液，观察14天，应健存。

<1.3.8 外源因子检查

<生产毒种批经非同源性乙脑高价免疫血清中和后，进行细胞培养试验。样品分别接种人二倍体细胞、BHK21细胞、原代地鼠肾细胞，于33～35℃进行培育，同时做对照培育。培育7、14天细胞应无病变，分别进行次代培育和血吸附试验；次代培育7、14天时亦分别观察细胞病变和进行血吸附试验。结果均无细胞病变并血吸附试验阴性为合格。

<血吸附试验方法：观察到期的细胞，用0.2%～0.5%鸡、豚鼠红细胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次进行血吸附检查。所用红细胞于2～8℃保存应不超过7天。

<1.3.9 细胞基质外源因子检查

制备生产用种子批的细胞留取<5%～<10%不种毒，更换相应的维持液，置<33～<35℃培育。在培育<7、<14天时，镜下观察无细胞病变后分别做血<吸附试验(方法同1.3.8项)。细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。

<1.4 生产毒种批保存

<液体生产毒种批于<-60℃保存不超过<6个月可用于生产；冻干生产毒种批于<-20℃以下保存<2年内可用于生产。

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2 疫苗制造

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2<.1 细胞制<备

<2.1.1 地鼠

<选用10～14日龄健康地鼠，解剖取肾。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。

<2.1.2 疫苗生产过程中不得使用青毒素或其他β内酰胺类抗生素。

<2.1.3 细胞消化及培养

解剖取出肾脏<后剪成碎块，用适量的胰蛋白酶液消化，将分散后的细胞悬液种入培养瓶内，加入生长液，置36～37℃培养。细胞生长成致密单层即可接种病毒。

<2.1.4 外源因子检查

<每批细胞留取5%～10%不接种病毒，加入与生产相同维持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天时分别做血吸附试验(方法同1.3.8项)。在观察期内细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。如细胞出现病变或血吸附试验阳性，由该批细胞制备的病毒原液应废弃。

<2.2 病毒接种和培育

<挑选长成致密单层的细胞，用洗液充分洗涤后加适量维持液，病毒接种量为2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。

<2.3 原液

<2.3.1 收获病毒液

种毒后培育<72小时以上，细胞出现明显病变时收获病毒液，澄清过滤后为原液<。

<2.3.2 原液检定

<2.3.2.1 无菌试验

<每瓶原液分别取样做无菌试验，样品种入硫乙醇酸盐、乙良马丁和肝斜面培养基，培养8天判定结果。

<2.3.2.2 支原体检查

<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<2.3.2.3 纯毒试验

<每一消化批应抽样进行纯毒试验。方法同1.3.4项。

<2.3.2.4 病毒滴定

<方法同1.3.3项。滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。

<2.4 疫苗半成品

<2.4.1 疫苗混合

<检定合格的原液合并后，加适宜保护剂。每批疫苗量应不超过15万ml。

<2.4.2 无菌试验

<按《生物制品无菌试验规程》进行

<2.4.3 分装和冻干

<疫苗应在冰浴下进行分装，采用适宜的冻干条件进行冻干。出柜后应在15℃以下进行封口。

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3 成品检定

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3<.1 外观<检查

<冻干疫苗应为淡黄色疏松体。如稀释液后迅速溶解，溶解后应为橘红色透明液体，无异物。

<3.2 残余水分含量

<冻干疫苗残余水分应≤3.5%。

<3.3 pH值

<冻干疫苗用蒸馏水复溶后，pH值应为7.2～8.0。

<3.4 病毒滴定

<方法同1.3.3项。病毒滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。

<3.5 热稳定性试验

冻干疫苗置<37℃<7天后进行滴定(方法同<1.3.3项)，滴度下降不应超过<1.0LogPFU/ml。

<3.6 无菌试验

<按《生物制品无菌试验规程》进行。

<3.7 安全试验

<3.7.1 脑内致病力试验

<方法及判定标准同1.3.5项。

<3.7.2 皮下感染入脑试验

<方法及判定标准同1.3.6项。

<3.7.3 乳鼠传代返祖试验。

<方法及判定标准同<1.3.7项。

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3<.8 毒性试验

<冻干疫苗每支加稀释液2.5ml溶解复原后，用体重12～15g小白鼠4只，每只腹腔注射0.5ml。注射后密切观察，30分钟内不应有异常反应，观察3天应健存。

<3.9 残余牛血清蛋白含量

<冻干疫苗每支加稀释液<2.5ml溶解复原后，残余牛血清蛋白含量≤<50ng/ml为合格。

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4 疫苗稀释液

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pH7.4～<7.6灭<菌磷酸盐缓冲生理盐水。每支安瓿<2.5ml。

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5 保存与效期

疫苗自冻干后病毒滴定合格之日起，在<8℃以下保存效期为<1年半，在<-20℃保<存效期为2年。

<冻干流行性乙型脑炎活疫苗使用说明书

本品系将流行性乙型脑炎14-14-2减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞，经培育后收获病毒液，加保护剂冻干制成。为淡黄色疏松体<，溶解后为澄明橘红色液体。用于预防流行性乙型脑炎。

接种对象

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1周岁以上<健康儿童。

用法

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1<.冻干活疫苗使用前，以无菌手续于每安瓿内加本品附带的稀释液(灭菌磷<酸盐缓冲生理盐水)2.5ml待完全溶解后使用。

<2.上臂外侧三角肌附着处皮肤用75%酒精消毒，待酒精干后皮下一次注射0.5ml。

<3.第1年1岁儿童注射<1针，<0.5ml；<2岁时加强<1针，<0.5ml；<7岁时注射<1针，<0.5ml。以后可不再免疫。

禁忌

发热，患急性传染病，中耳炎，活动性结核，心、肾及肝脏等疾病，体<质衰弱，有过敏史或抽风史者，近期或正在进行免疫抑制治疗者，均不可注射本疫苗。

注意事项

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1<.启开安瓿和注<射时切勿使消毒剂接触疫苗。

<2.本疫苗溶解后有摇不散的块状物，安瓿有裂纹或溶解前疫苗变红，均不可使用。

<3.疫苗溶解后应在1小时内用完，用不完的应废弃。

保存

应于<8℃以下避光保存和运输。

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