第九章 免疫细胞化学与图像分析
在细胞生物学中，一个常见的问题是如何获取与细胞功能相关的各种定量测量信息。在免疫细胞化学中也存在同样的问题。制作免疫细胞化学标本环节 较多，只要有一个环节 失误就会影响实验结果，除了需要精制的药品外，还需要熟练的技术。那么，做成了理想的标本后，如何进行观察，才能获得尽量多的的各种定量信息，而且使这些信息能较客观的反映出来，这就是本章 的编写目的。
一、定量分析的重要性
目前有许多研究免疫细胞化学的文章 ，是做定性和定位研究的。如有文献中提到，P物质在脑组织中存在于30处以上，这只是解决了定性定位问题，这些部位含P物质的量是否相同？可否用快速简便的方法对细胞内免疫反应产物的量进行分析？从而可进行比较。所谓反应产物的“量”包括颜色深浅，其所占的长度或面积等，就要借助于图像分析仪(image analyzer)了。
以往我们对免疫细胞化学或一般组织化学光镜标本的观察，对反应产物的量常用“+”号表示，一般可分为0～+++，共五个等级，这种方法对差别较大的标本当然还是可以用的，但存在以下三方面的问题：①同一张标本，不同的观察者可以得到出不同的结论，因为这种分级没有明确的客观标准；②即使同一张标本同一个观察者，间隔若干天后进行再次观察时，可能结论也不一样的；③最后一点也是最重要的一点，人的视觉是有一定限制的，用一般观察法实际上已经丢失掉了许多可贵的信息，因为你察觉不到实际上存在的较小的差异。因此我们力求有一个客观的比较精密的标准。除了常用的仪器如显微分光光度计(microspectrophotometer)和显微密度计(microdensitometer)等以外，还可用图像分析仪进行测量。前二者已有许多有关著作中介绍过，就其精确与灵敏来说都是够的，但却不能同时测出标本中某些成分的面积、体积或长度等其他极有用的参数。图像分析仪的分析广度则要大得多，并能明显地提高工作效率，所得到的各种数据可通过分析仪上的计算机进行统计学处理，只要将各种统计学公式输入计算机，选择其中你所采用的公式，即可快速得出分析结果，告诉你有无显著性差异。
二、图像分析仪简介
图像分析仪又称图像分析系统(image analysis system)，主要用来解决如何客观地较精确地用数字来表达存在于标本中的各种信息，可称为数学形态学。它已经成为一种公认的科学研究工具，并且逐渐展现出巨大的潜能。图像中包含着极其丰富的内容，是人们从客观世界中获得信息的重要手段，因此，正确地测量和处理图像已成为测量技术中的重要课题，并广泛应用于航空遥感测量、金属图像测量、微电子技术中微图形检测、精密机件尺寸检测，光波干涉图、医学生物学的研究及应用等有关领域中。图像测量将会随着信息科学和人工智能的发展而日益显示其重要作用。现代图像测量是光学、电子学、计算机技术等相互渗透的跨学科的结果，涉及广泛的学科领域，医学只是其中一个分支。
我们在光学显微镜下看到的是光学图像，而在图像分析仪屏幕上看到的是电子图像，因此在显微图像分析中，整个系统最重要最关键的工作就是要保证得到的电子图像能最精确地反映出光学图像，这个过程由摄像机(图像扫描器)、显像管和图像处理机(计算机)来完成(图9-1)。图像可通过光学显微镜、透射电镜或扫描电镜传到摄像机而产生电信号，照片或胶卷上的图像也可以通过摄像机反映到电视屏幕上进行分析。图像在电视屏幕上是由许多像素(pixel)构成的，单位面积屏幕上像素愈多则图像愈清晰，即分辨率愈高。各厂家生产各种不同规格的产品，如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。当图像显示时，每个像素含有两方面的信息，即此像素的灰度及其在标本中的位置，两种信息决定了图像的形状和颜色深浅。
图9-1 图像分析系统简图
有关图像分析的学术活动，1963年召开了第一届国际讨论会，此后每四年有一次国际学术交流活动。1983年在美国召开了第六届国际学术会议，与会代表约150人。1987年9月在法国召开了第七届学术会议，在200多正式代表中有2/3是生物医学方面的专家，而我国生物医学界没有人被邀参加，可见我国过去对如何将图像分析应用于医学生物学方面的研究重视得不够，对国际上这方面的信息掌握得不及时。国内自70年代末期相继从国外引进大型自动图像分析仪后，80年代才开始将医学生物学研究与图像分析方法结合起来。从1981～1983年召开了三次全国体视学与图像图像分析学术会议，1987年召开了第四次学术会议，虽然在宣读的论文中医学研究已占了很大的比例，但具体应用到免疫细胞化学则实例极少，仅是一个开端。1988年中国体视学会正式成立，是在民政部登记的属于新学科的第一个学会。并于1991年11月在重庆第三军大学召开了“全国计量学在形态学研究中应用研讨会”，与会代表来自22个省市，形态计量学的方法已应用到组织学、解剖学、病理学、细胞学等领域。更为可喜的是过去此类研讨会都是请外商到会介绍他们的产品，为他们提供中国市场，而此次会议上本国的三家研制生产图像分析仪的单位在大会上介绍各自的产品，以较好的性能价格比与国外产品竞争，扩大国内市场，我国在此领域的研究进展也是很快的。
三、常用的测量方法
(一)灰度
灰度(grey level)指图像各种分颜色的深浅程度。比较高级的图像分析仪可将灰度分成为256级，也有的只能将灰度分成64级，总之都是2n,24是26 256是28。免疫细胞化学标本上反应产物的染色深浅即可用灰度来表示。能将一张标本上不同染色深度区分为几十或更多的等级，这是人眼所不及的。因此，某些实验的结果，如果用光学显微镜作一般的观察，似乎实验组与对照组无明显差异，而用图像灰度法经统计学分析，则可反映出显著性差异，说明仅仅用显微镜观察是不够的，在某些情况下可能会辜负了制片过程中所花费的大量精力，而得不到应有的结果。
由于免疫反应产物在细胞内不一定是均匀分布的，在同一个细胞中就可产生各种灰度，这种情况如何进行比较？有两类方法可供选用：一种是测每个细胞的平均灰度，近年较新型的图像分析系统有此性能，而比较早期的或比较简单的图像分析系统就没有这种性能，例如某一细胞在电视屏幕上占有120个像素，按灰度级进行测量后，也许120个像素中有十多种不同的灰度，分析仪可立即显示其平均灰度。另一种方法是在反应产物不均匀的细胞中可用每一种灰度所占的百分率来表示，例如你要观察1000个细胞，在这些细胞中各种灰度所占的百分率可测出，并作出曲线，或用其他统计学方法处理，来进行比较。
如果用彩色图像分析仪，除了上述的灰度测量以外，还可以将不同的灰度编成不同的颜色，使图像更鲜明美丽，而且便于测量。彩色有两种情况：在屏幕上出现与标本一样的颜色称为真色(real color)，如果将不同的灰度转换成不同的颜色则称为假色(pseudo color)，应用假色的目的是增强对比度，来改善对细胞结构的视觉识别，同时可增强轮廓用来强调结构的细节 。例如，免疫细胞化学中常用的非标记抗体过氧化物酶—抗过氧化物酶法，最终反应产物呈棕色，假设在脑内某核团的许多细胞中，呈现出不同深度的棕色，深浅差别较大者显示在屏幕上人眼还能区别，若差别小的则不易区别了，操作者可将灰度11～15用红色显示，灰度16～20用蓝色显示、灰度21～25用黄色显示、灰度26～30用绿色显示等。一般可呈现数十种颜色。也可以将灰度11～20用深红色显示、灰度21～30用淡红色显示、灰度31～40用蓝色显示等，由操作者随心所欲加以编辑。这种图像如拍摄下来，旁边显示出一条彩色带，表明什么颜色代表什么范围的灰度，如此可将一种颜色的免疫细胞化学标本转换成多种彩色的，对比鲜明的照片。
有些图像分析仪中带有光密度计组件，光密度计能将扫描器视频信号变换成对数等值，然后数值化，就能用绝对光密度单位来校正。因此，光密度计把被测物的积分光密度作为主要输出，所谓积分光密度即各个单独探测的像素密度分布的总和。因为容易得到被测物的面积，也就很容易求出平均密度。光密度在细胞化学反应的定量领域内极为有用。灰度是一种相对值，因为你可将标本上的灰度随你编辑分为64级、也可将其分为128级或者256组，而光密度是绝对值。在文献中光密度常用OD表示(optical density)。有的单位购置了图像分析仪后才发现不能作光密度测量，但已无法再去掉换，所以在购买前必须详细了解其性能，包括屏幕像素数、有无光密度计组件等。
(二)长度
形状不规则的线形组织结构，一般方法很难计算出其长度，如组织中的毛细血管，神经纤维、细胞超微结构中的各种膜性结构等，以往常用排列稀疏或密度集等词描述，图像分析仪则可测出各种图像周界线的长度。例如：在活检组织的子宫颈上皮细胞的电子显微镜照片上，测出在一定范围的细胞膜长度为8128像素，桥粒长度为1229像素，计算出桥粒长度占细胞膜总长度的15%，wiernik等用此方法观察到癌细胞的桥粒值远小于正常细胞，提出这可能与癌细胞易于失去相互间的的细胞连接，从而形成转移有关。用免疫细胞化学法显示的神经纤维，在局部组织中可能出现纵横交错的复杂图像，用图像分析仪可获得单位面积内神经纤维的总长度。又如去甲肾上腺素神经纤维呈串珠样，如果测出一定范围内神经纤维总长度及局部膨大数目，即可计算出串珠平均间隔距离，比较精确。
(三)面积
无论是在光镜或电镜免疫细胞化学标本的观察中，都要涉及有关标本中某些结构的面积问题。即使是极不规整的结构，用图像分析法容易算出其面积。在一定的放大倍数下，每μm2中含多少像素可以测出，画出待测结构的轮廓，在所勾画的范围内含多少像素是立即可显示出来的，这样，很快可算出面积的数值。例如免疫电镜技术中的铁蛋白法、胶体金法等，可用上述方法进行单位面积中反应产物颗粒的计数，可进行各种实验条件的比较。
曾有人在肝脏切片上进行图像分析，在一定范围内所有细胞核的总面积显示为51554像素，其中肝细胞核总面积为27431像素，可知肝细胞核占全部细胞核总面积的53%。
四、图像分析仪工作程序
使用者对硬件不需操纵，它们可完成复杂的运行过程，完整的计算机软件可按实际需要使其执行功能。对操作者来说，图像分析仪的实际操作很少，几乎完全是通过一个称为光电鼠标(mouse)的附件来操纵的。计算机屏幕上显示出多项指令，可由光电鼠标来指明你所需要的程序，光电鼠标可控制计算机屏幕上的一个光标，移动光电鼠标也随着移动，将光标移到计算机屏幕上显示的某项功能的区域内，就表示选择了该项功能，可以开始工作，极简便。图9-1为图像分析仪的简化图。
图像分析仪主要包括输入(input)、中央信息处理机(central processor)和输出(output)三大部分。实际上，工作程序并不是一成不变的，后面的步骤的信息常会反馈到前面，于是又重复前面的程序，具体步骤如下：
1.标本成像 移动标本使需要观察的部位在电视摄像机上得到适当放大的图像，标本包括组织切片或电镜照片或照相底片等。
2.图像获取 用电视摄像机或其他方法将图像转变为电信号，在此过程中，摄像机的性能极重要，不能使用那些便宜的适用于监视的电视摄像机，一定要用使图像具有很好的清晰度的摄像机。
3.加强图像 加强电子图像(electronic image)使其更适合于分析。
4.检测检测(detection )是图像分析过程中设法从图像中确定并且分离出需要分析灰度相的步骤，“相(phase)”是图像中我们想要测量的部分的总称。检测是通过选择一定的阈值来完成的，如果所需相比背景暗，那么所有暗于下限的东西都被选，例如相的灰度是20～50，20是下限，50是上限，背景的灰度小于20，检定时暗于灰度20的东西都被选。如果所需相比背景亮，如免疫荧光细胞化学技术的标本，那么亮于上限的东西都被选。如果所需相比背景亮，如免疫荧光化学技术的标本，那么亮于上限的东西都被选，例如相的灰度是5～20，5是下限，20是上限，背景灰度大于20，所谓上限既指比灰度20浅的亦即灰度20以下的相被选，而背景是暗于上限的，不被选作测量。如果相暗于图像某些部分而又亮于图像的另一些部分，那就要在二限之间的部分选择灰度了。
在检测过程中要使用图像框(image frame)和测量框(measurement frame)。检测只在图像框内进行，框的大小按需要而定，测量框在图像之内，是进行测量的部位。两个框之间的部分称为保险区(图9-2)。
图像中每个被测物都有其特有的特征计算点(feature count point, FCP),FCP在被测物的最底点，如图9-2中上面10个被测物的FCP均在测量框内，可计数或作其他测量，而最下面2个被测物的FCP不在测量框内，则不计在内，在测其他区域时再计算，有的被测可能被测量框截断，那么测量框外的那部分被测物应该位于保险区，即保险区要大于被测物，才能观察FCP是否在测量框内而决定取舍。这样当换到相邻的区域进行测量时，不会使某图形重复测量，可避免测量误差，图9-3显示放置标本的显微镜载物台的移动方式，可由计算机控制，用编制好的程序，使载物台按一定方式移动，也可以人工操作。图中可以看出每个部位都将通过测量框，不会遗漏。
图9-2 示测量框位置，图中有10个被测物的FCP在测量框内
5.阴影校正校正图像细节 直到正确无误并达到能被测量的要求。所谓阴影(shading)是指人眼看来是均匀的视场内存在着不均匀的电子反应，这使得灰度相同的图像成分由于在视场中所处位置不同而显示出不同的灰度，这种影响必须校正才能使图像得到准确测量。阴影有三个主要的来源：
(1)图像源的不均匀的光照。
(2)穿过透镜时光路发生变化引起的透镜阴影。
(3)显像管本身的图像灵敏度差异引起的扫描阴影。]
任何图像分析在具体运用中都有这些阴影存在，前二者可通过精密安装图像分析仪来控制，后者可通过对显像管的质量严格筛选来减少影响。阴影可贮存起来，并且在每上次扫描时同步地从图像信号中去掉。
图9-3 显微镜载物台移动方式 1.载物台移动方向；
2.晕微镜观察视场；3.图像框；4.测量框
6.测量经以上各步骤后，可以用图像分析仪的计算机对图像进行测量来取得所需的参数，如灰度、面积、长度、个数等。原始的参数可由计算机转化成容易理解的数值，例如面积可由某图形所占像素数转化为平方微米，使观察者容易理解。
7.资料分析 将资料进行分类，并加以说明，以便做出结论。也可将资料贮存，随意可提取出来，供研究者使用。
8.其他事项
(1)标本要清洁：如果标本上有污点，研究者可分辨哪些是正常的免疫反应产物，哪些是污染引起的，但仪器不会区别，只要是电视屏幕上测量框内有的东西都会被测量，如测灰度时切片上有污点，会影响结果。
(2)电压要稳定：这一点是结合我国目前情况而言，虽然仪器使用时是通过稳压器的，也要经常注意稳压器上的电压指针是否稳定，否则也影响结果。
(3)价格问题：图像分析仪广泛应用于工业、农业、医学等领域，因此并不是价格愈贵就愈好，而要看我们的应用目的及其性能，以免购置一些用不着的昂贵的附件而造成浪费。一般可以从以下三方面来考察仪器性能：在本专业范围内应用的广度、运算的速度和操作的方便程度。
(4)合作使用：分析仪价格昂贵，根据国内目前实际情况，有些工厂购置了图像仪而仅仅用作工业金相分析，闲置的时间很多，我们从事医学研究的人可以去充分利用它的性能，联合进行科研工作，发四川省目前最高级的图像分析仪就是在工厂中而不是在高等学校中。
五、没有图像分析仪可否进行图像分析？
当没有图像分析仪时，研究者早已想到用网格来进行图像分析，也获得了客观的评定结果。网格可分为两大类：一类是置于目镜内的网格，可测量切片标本上的各种数据；另一类是大的网格，可放在照片上，光镜电镜照片均可用，对照片上的各种结构可进行测量。以上二者至今仍被采用。英国标线片公司提供许多型号的市售标线片(即网格)。有的国家制造的显微镜，将目镜与带有六种不同型号标线片的旋转盘装在一起，以便于观察者作各种测量。国内某些单位有自制标线片，并有少量出售。
Aalto等1982年曾在“免疫组织化学的形态测量法一卵巢肿瘤内的胚性癌抗原”一文中推荐用视野评分法，他用三种方法对PAP法免疫组化标本进行分析：①对全切片的染色进行分级。②在10×10放大倍数下，每一切片用目镜网格任选25个方形视场进行观察，并对每一视场进行分级。③在25个视场内取25个点的着色强度进行分级。染色强度分为0级、1级(轻度)2级、(中度)、3级(重度)。方法①的结果不同于②③，而方法②和③差别不大，说明主观估算的鉴别能力低，一般镜下观察不能确切反映染色强度。
用网格进行图像分析的方法很多，如用免疫荧光等方法显示神经纤维，要表示各处的纤维密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用网格法就要客观一些，在目镜或照片上放上网格，观察阳性神经纤维与网格上的线条的交叉次数，排列密集的区域交叉次数必然多些，这就比较客观，重复性也较好。
用荧光显微镜观察免疫荧光标本，Ploem曾在1977年指出荧光强度之差至少要二倍才能在直观估计时显示出差别，说明人视觉对荧光强度变化不够敏感。作者在工作中体会到，可利用照相的自动曝光系统来作相对定量，因为荧光愈强则自动曝光时间愈短，荧光弱则自动曝光时间长，相当敏感，用眼睛观察二个荧光强度几乎无差别的细胞，也能在自动曝光时间上显示出差别来。作者曾经将许多荧光标本用相同的曝光时间拍在同一个胶卷中，冲洗后，荧光强的区域胶卷上显色深，荧光弱的区域胶卷上显色浅，因为荧光容易淬灭，用此法可将胶卷较长期保存，而且胶卷上的信息还可通过图像分析仪测灰度等数据。这些都是在实践中的一点经验，供读者参考。
用网格测量的具体操作举例：图9-4为一关联方测格，由于测点、测线、测面之间有互相关联的关系，故称为关联方测格。方格直线交叉称为测点，总数为100个，方格中所有直线称为测线，小方格边长为d如图中所示，测线总长度为200d,整个大方格为测面，测面总面积为100d2，测格周围的虚线不是测线。关联测格的优点是：只在计数位于欲测图像中的测点数P，就可计算位于该图像中的测线长度L及测面的面积A。计算方法为：L=2d·P，A=d2·P。
可将图9-4摄制于小的透明胶片上，剪成你所用的目镜筒的内径大小，将其置于目镜内，使测格清晰地叠映组织标本的图像上，则可进行测量。d的长度可用台微尺来确定。也可将9-4复印在?, 百拇医药(方一心)