第三节FCM对外周白细胞的免疫荧光分析(理论书籍)

第三节 Fcm对外周白细胞的免疫荧光分析

http://www.100md.com 《免疫细胞化学》

第三节 FCM对外周白细胞的免疫荧光分析

外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。这些数字的变化与临床的某些疾病有一定的关系。近年来，由于多种识别白细胞膜表面抗原的单克隆抗体的发现，以及对这些单克隆抗体的直接或间接荧光标记物的出现，使得利用FCM的荧光组织化学分析获得被测细胞的多指标的更多、更准确的信息，这无疑对警觉临床和科研有很大帮助。本节主要讨论有关外周血的白细胞的免疫荧光标记技术、数据分析及临床应用等方面的问题。

一、白细胞的免疫荧光标记技术

1.白细胞抗原下面给出世界卫生组织对白细胞抗原的统一命名，以及它们的分子量、对应的单克隆抗体及反应阳性的细胞(见表10-2)。

表10-2 WHO对白细胞分化抗原的命名

图10-9 人的外周血白细胞分群的二维点图

图中， A、B图的淋巴细胞数大约有6000～9000个；C、D图约有2000～4000个。分群编号依次表示：①红细胞、死细胞和渣滓；②淋巴细胞群；③大颗粒淋巴细胞；④单核细胞；⑤粒细胞。数据是对1000个细胞分析得到的。

若用单指标直方图，对PBMC而言，可以把淋巴细胞和单核细胞分开。见图10-10中的A、B图。但对红细胞溶解后的全血，单指标图分辨率则不够了(图10-10的C、D图)，图A、B给出的是经ficoll后的PBMC；图C、D给出的是人外周血白细胞。图中数字编号所代表的组分和图10-9相同。

由上可见，在分析红细胞溶解后的全血时，必须先采用双指标二维点图。从图上也可清楚地看出，粒细胞、未被溶解的红细胞和一些渣滓，由于不同的体积和致密度，明显地区别于淋巴细胞和单核细胞从而能把它们分开。看到清楚的细胞分群以后，可以在计算机的显示屏上将所要分析的细胞画线框出，并通过指令送入存贮器，以后就可只对框出部分做各种数据分析和深入考查。图10-11就是对双指标点图上的淋巴细胞群框定的示意图。数字所表示的意思和图10-9相同。

图10-10 外周血白细胞及PBMC的单指标直方图

图10-11 双指标点图上细胞的框定

2.单维直方图上阴性分界游标设置前面已经强调，在用FCM分析时，阴性对照是必不可少的。首先用非染色细胞，根据前面介绍的双指标二维点图的办法，将某一细胞群框定；然后分别选用绿色荧光(GFL)和红色荧光(RFL)单指标直方图。在直方图上所出现的细胞均为阳性。可用改变GFL和RFL增益的办法，将细胞恰好调节到左侧并设立游标(图10-12)。

然后再测试MsIg染色的阴性对照。某些细胞，由于膜上的Fc受体可以与对照抗体鼠Ig非特异性结合，因而有一定的背景染色，不过这种阳性百分率不应超过5%。所以MsIg与非染色细胞的分界游标确立后，以后所测试的标本以此为标准，游标位置基本不变。

图10-12 阴阳性细胞分界游标的设置

MsIg的红、绿荧光阴阳性分界游标确立以后，可以测试实验标本。首先检查细胞分群情况，然后检查淋巴细胞群是否落在已输入计算机的淋巴细胞框定的范围里。若染色及FCM的工作性能都正常，则框定的位置不会改变。然后转换成荧光直方图。若为FITC标记的细胞，则GFL为X轴；若为PE标记的细胞，则用RFL为X轴。由于阴阳性分界游标记已确立，细胞阳性率及图像均显示于计算机荧光屏上；同时也可选用其它指标和图像、打印所需的资料等。

3.双染色分析游标设立和荧光校正

(1)游标的设立：游标设立的原理和单染并无不同，但具体要用二维点图和二维等高图来完成。分别选用GFL和RFL为X和Y轴。先用不染色细胞测试，将阴性细胞集中在左下角(图10-13)。分别为X、Y轴设立游标，再用MsIg的阴性对照测试。可将X、Y轴游标略为移动，使位于窗3内的细胞(阴性)在95%以上。

(2)红、绿荧光的校正：由于红色荧光探测器在最佳测试状态时，会让部分绿色荧光进入红色荧光探测器。这是因为一部分细胞发出的绿色荧光波长较长。若用阻断或滤色的办法消除进入红荧光探测器的这部分GRL，就会大大地降低RFL探测器的灵敏度。因而只好在操作时，通过电子计算机预先进入荧光校正，在RFL中适当扣除GRL的影响。

通常红色荧光进入绿色荧光探测器的情况比较光见，图10-14给出CD₁₁-PE(T细胞、RFL)及CD₈-FITC(T抑制细胞，GFL)双染细胞在二维等高图上进行荧光校正的示意图。X轴为GFL，Y轴为RFL，由X轴Y轴游标划分的四个窗的阴阳性和图10-13相同。各窗给出的百分数为该细胞群所占百分比。图A表示未经校正时的情形。窗2内31.46%表示双阳性细胞，即在T细胞中31.46%为抑制细胞毒细胞。经过适当校正，可见有两群阳性双标记细胞出现(B图)。高强度部分为真正的CD₈、CD₁₁双标记阳性细胞；低强度部分属于CD₈绿色阳性细胞(NK细胞)。此时2窗中细胞份额减为7.59%。需要指出的是校正过度则会使各区的阳性细胞都减少(图C)。

图10-13 双染色二维点图上游标的设置

1区：红色荧光阳性；2区：红、绿荧光均为阳性；3区：阴性细胞：4区：绿色荧光阳性细胞

图10-14 双染色在二维等高图上荧光校正

双染色的荧光校正是用电子补偿电路来完成的。补偿时先测定一种染料的荧光，此时除了应该接收该荧光的光电倍增管PMT₁有信号输出外，另一光电倍增管PMT₂也常会有微弱输出。调节补偿器使PMT₂的输出为0；然后再测另一种波长的荧光染料，调PMT₁的补偿器使之输出也为0；然后再测另一种波长的荧光的染料，调PMT₁的补偿器使之输出也为0：如此反复调节，使两种荧光的探测器都获得补偿。实际调节时用的是一种标准荧光微球，微球上标有已知数量的荧光分子。利用不同的微球可调整、补偿不同荧光的测量通道。需要指出的是：当PMT高压有所改变、激光和滤片系统有所变动时，都要对荧光校正做重新补偿调节。

三、淋巴细胞亚群的测定及其在临床医学中的实用意义

淋巴细胞由于表面特异性抗原的差异可分为四大类(表10-3)，这些不同抗原表现型的亚群执行不同的机能。而且某些疾病会选择性地损伤某些亚群而造成亚群之间的比例失调。根据FCM双荧光分析的结果，现将不同的抗原和不同的机能的淋巴细胞亚群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴细胞亚群的表面抗原

细胞表面抗原的类型

抗原表现的细胞

图10-15 健康人艾滋病人淋巴细胞表面抗原的比较

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺细胞均减少，而Leu₂⁺、Leu₈^-细胞相应增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺与Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺细胞明显增加

3.白血病和淋巴瘤的表现型近年来，为了弄清这些肿瘤的病理组织形态、影响治疗效果的原因与免疫状态的相互关系，对于不同类型的白血病和淋巴瘤作为广泛的细胞表面表现型的研究。

在诊断方面，FCM与单克隆抗体结合，可以弄清这些肿瘤的免疫起源，特别是分清B细胞性、T细胞性或骨髓性肿瘤。同时，还可以证实一些与细胞起源相关的抗原，如普通急性淋巴细胞性白血病抗原(CALLA、CD₁₀)。另外，可以用适当的试剂从反应免疫过程中来证实单克隆的肿瘤细胞的增殖。

大部分淋巴系统肿瘤均起源于B细胞。而B细胞肿瘤常用抗免疫球蛋白的抗体来证实。由于前B细胞与浆细胞表面均无免疫蛋白，所以用检测免疫球蛋白的办法就只能证实B细胞发育中间时期的肿瘤。目前，已有一系列的B细胞表面抗原被发现，而可以证实B细胞个体发育的各个时期的肿瘤。

对B细胞肿瘤最有价值的抗原是CALLA。这种抗原仅存在于B细胞正常以育期的前B细胞、早期B细胞以及80%～90%的急性淋巴细胞性白血病。因此，抗CALLA抗体可以区别淋巴细胞性和髓性白血病。用抗CALLA结合其它一些成熟B细胞的单克隆抗体，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄(B₄，B₁，BA_-1)将能证实大部分B细胞来源的肿瘤。图10-16给出了B细胞分化的各个时期细胞膜的表现型。来源于B细胞的肿瘤和正常B细胞的表现型相似，也就是说，B细胞前身、成熟B细胞及最后分化为分泌B细胞—浆细胞。

图10-16 B细胞分化各时期的细胞膜表现型

由于T淋巴细胞来源的肿瘤浸润性较强，预后较差，并需要多种治疗。T细胞肿瘤的表现型千变万化，但大部分均表现T细胞抗原CD₇(Leu₉,3A)或其它T细胞抗原CD₂、CD₅(OKT₁₁，OKT₁)。这些抗原与肿瘤的细胞成熟时间有关，因而有助于拟定治疗方案。从FCM分析的结果表明，非成熟的T细胞肿瘤常表现非成熟的T细胞抗原，如CD₁和T ₁₀。而成熟的T 细胞肿瘤则仅表现成熟T细胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有时也可表现CD₂、CD₈，但不会出现在同一个细胞上面。

由于肿瘤细胞的多种来源，很难避免在肿瘤标本中混杂正常细胞，这给FCM的分析带来技术上的困难。如残留的红细胞在FCM分析时，落入淋巴细胞框定的范围内而造成淋巴细胞各种亚群百分率下降。所以在制备标本时，应尽量想法去除红细胞。另一种污染是正常细胞存在于肿瘤细胞之间，这是一个很头痛的问题。例如骨髓常被外周血污染，反应性的正常淋巴细胞渗入到肿瘤组织中等，因此估计污染程度对解释FCM分析的资料有一定的意义。因为在FCM分析时，正常细胞与肿瘤细胞可能由于不同的体积和密度而被分开，根据对污染的估计，仔细分析图像就能得到比较正确的结果。

4.FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤分析 FCM对正常B细胞和B细胞肿瘤的分析在免疫学研究和临床诊断上有着重要的实用价值，B细胞的某些特征必须使用FCM来分析，但是这在FCM技术方法中仍存在着一些需要解决的问题。

(1)B细胞的标记：B细胞膜表现免疫球蛋白(SIg)存在于所有成熟B细胞。最早的B细胞前身，细胞质内含有免疫球蛋白M(IgM)，但不存在于细胞膜表面。细胞质内IgM的证实以及同时测定细胞表面的SIg，对FCM是很困难的，当然今后可能会用双染法来解决这样的难题。大部分成熟B细胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，当然这也可能是因为不同的亚群的缘故。但仅以Ig的重链来分类B细胞是不可靠的，因为B细胞可以从膜表面的IgM逐渐转变成IgG，因而从重链着手无法把B细胞分类。大部分B细胞肿瘤也表现出带有SIgM和SigD。随着B细胞逐渐转变成浆细胞，膜表面Ig 逐渐丧失，在细胞质内又出现大量的免疫球蛋白。

与重链相反，B细胞的整个发生期只有一种k或者λ轻链，B细胞肿瘤克隆仅表现一种轻链，因此通过在FCM上显示的不平衡的轻链表现可以确定B细胞肿瘤。测定方法见(3)。

用SIg的最大缺点是它的嗜细胞性，因为正常B细胞、自然杀伤细胞(NK)、激活T细胞以及所有巨噬细胞均有Fc段受体，因而可以不同程度地与抗SIg单克隆抗体的Fc段结合而产生非特异性的结果，因此选择抗体时，应使用已被胃蛋白酶消化过的、Fc段也被去除的、仅留下来的F(ab’)₂。

(2)FCM测定B细胞的临床指证：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或获得性的。低丙种球蛋白白血症和无丙种球蛋白白血症常伴有免疫球蛋白分泌的紊乱，因此有必要分析B细胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%来源于B细胞。因而一旦怀疑为淋巴瘤，就应仔细用FCM对B细胞的表现型进行分析，可以分析血、骨髓、以及活检淋巴结等。首先确定肿瘤细胞的来源：B细胞性(CD₂₀⁺，SIg⁺)或T细胞性(CD₃⁺)。也有可能某些淋巴病来源于单核细胞(CD₁₁⁺)成裸细胞而表现出非T非B。一旦确立为B细胞来源后，就应更进一步分析克隆增殖的性质：单克隆、少克隆、或是多克降珠。单克隆性的增殖往往是肿瘤的标志。可以用SIg的轻链和重链分别加以测试，往往轻链比重链更有价值。在不久的将来，或许可以直接用免疫球蛋白的基本加以鉴别。

对B细胞亚群的确定，目前并未定论，但某些B细胞被CD₅(T₁，OKT₁)染色。正常B细胞中这些细胞较少，而多见于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷时期。在B细胞的肿瘤病人中，10%的也可以出现CD₂₀(B₁)阴性反应，这是B细胞成熟而将分化为浆细胞的标志。在异常B细胞上，往往有一些B细胞的标记缺失或其它表现型出现，因而对异常B细胞的FCM的分析尤为重要。图10-17显示CD₁₉—FITC (B细胞)和CD₅-PE(T细胞)双染色的假三维图像分析。X轴为绿色荧光的Leu₁₂(B细胞)，Y轴为红色荧光的PE—Leu₁( T细胞)。从图中可见，有较多的细胞表现出Leu₁₂⁺t Leu₁⁺,阴性区内为NK细胞和红细胞等。

图10-17 异常B细胞双染色的假三维图

(3)k-λ测定B细胞克隆：k、λ测定法是一种从正常B细胞中测定少量B细胞克隆生长的方法。其基本原理是：若有B细胞克隆存在，将改变某一种轻链(k或λ)的荧光强度的分布。若轻链为k的B细胞生长，则抗k的抗体能测试出这种变化，而抗λ的抗体的测试没有任何改变。正常情况下，B细胞的k和λ的荧光强度分布是一致的(见图10-18)。

图10-18 k-λ克隆的测定

正常情况，B细胞轻链分布图像，一致κ和λ的波形没有区别。但在异常时，若有单克隆生长，κ链有分布则与λ不一致，在总和的曲线形态上也会产生差异。

在实际应用中，血液、体液、组织细胞的悬浮液效果均较好，而对于骨髓，大量细胞的非特异性标记会影响测定的结果。这里面必须强调，正常B细胞中的克隆细胞生长并不意味着它们必然是肿瘤细胞，还必须结合其它指标再做结论。不过这种方法对确定肿瘤细胞的存在、细胞发育阶段、以及经治疗后病情控制的状况等，都可以提供一些有用的资料。

以上仅限于从外周血的白细胞分析这一侧面介绍了FCM的某些疾病中的临床应用。其实，它也仅只是问题的一个部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由红系、巨核系、粒系和巨噬细胞三个细胞成株单元组成的成株细胞中有所表现。CD₃₄⁺细胞在人的骨髓细胞中约占1～4%，而在外周血中却探测不到。又如，NK细胞近来被认为可能和人类的某些疾病的发病机理有关，对NK细胞的测量可以作为免疫治疗的免疫监测的重要参数和有效的预后征状的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的释放来检测NK敏感的靶细胞的毒理学活性从而评估NK的功能的，而采用荧光探针CFDA(car-boxy—fluorescein diacetate)标记则可用FCM技术更为安全可靠地进行测定。有报告指出，健康男人的数值为(67.1±22.7%)%，健康女人为(63.9±20.0%)；患有妇科癌肿病人则为(38.5±23.1)%,明显偏低。这些工作表明，FCM的技术从免疫组织化学角度还会有所发展。在第二节我们曾简单介绍了流式细胞分析技术在生物医学工程中应用的一些技术途径，这也可以启发我们借助于FCM来提高免疫组织化学的分析能力。可以预见，FCM一定会成为免疫组织化学的一项重要的技术工具，并将在医学科研和临床应用中发挥更大的作用。

附【美国Becton –Dickinson 公司可提供的FCM标准】荧光微球(Fluorescent beads)；鸡红细胞核(Chicken erythrocyte nu-clei)和小牛胸腺细胞核(Calf thymocyte nuclei)，用于DNA测量的质量控制；单克隆抗体试剂；以及用于免疫表型(immunopheno-typing)和其它临床应用的药盒。

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