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第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用
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第二十三章 DNA重组技术及其在基因诊断中的应用

第一节 工具酶

基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。基因是一段具有一定功能的DNA分子,要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来,需要各种限制性核酸内切酶(restriction endonuclease);要把不同片段连接起来,需要DNA连接酶(ligase);要结合基因或其中的一个片段,需要DNA酶(DNA polymerase)等。因此,酶是DNA重组技术中必不可少的工具,基因工程中所要用的酶统称为工具酶。

一、DNA限制性内切酶

Lurva和Human(1952)以及Bertani和Weigle(1953)发现了噬菌体λ的限制作用,即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞生长良好,但在另一种宿主细胞中生长很差,其原因在于它的DNA受到后一种宿主的“限制”。由此发现了限制-修饰系统。

各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。这些酶切割DNA的双链,因为它们的功能就是切割DNA,限制外源性DNA存在于自身细胞内,所以称这种核酸内切酶为限制酶。合成限制酶的细胞自身的DNA可以不受这种酶的作用,因为细胞还合成了一种修饰酶,它改变了限制酶识别的DNA顺序的结构,使限制酶不能起作用。限制-修饰系统是细胞的一种防卫手段。如果用噬菌体去感染限制-修饰系统有活性的细菌,噬菌体DNA没有先经修饰,它与先经修饰的噬菌体相比,感染效率要低几个数量级。未经修饰的噬菌体DNA进入细胞后被限制酶切成片段,片段的数目与DNA分子中限制酶的识别点数目成正比,这些片段进一步被细胞的核酸外切酶降解,就会开始裂解感染,由此产生的子代噬菌体全部带有修饰过的DNA,因此能以很高的效率去感染另一些具有相同限制-修饰系统的细菌。目前,从各种生物中分离出的限制性内切酶已超过175种,其中80多种是切割DNA双链。

(一)命名原则

限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。现在通用的命名原则是:第一个字是细菌属名的第一个字母,第二、三个字是细菌种名的前二个字母,这些字母都用斜体字母;接下去是细菌株的第一个字母,用正体字母书写。如果同一菌株中有几种不同的内切酶时,则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表。现在列表举例说明如下(表23-1)。

表23-1  几种限制性内切酶命名原则举例

图23-1 几种限制性内切酶和甲基化的碱基

表23-2 甲基化酶及甲基化的碱基

    

*表示甲基化

三、分子克隆化的另一些酶

(一)DNA聚合酶

(DNA polymerase)的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物(primer)的3’-OH上,释放出一个焦磷酸分子(ppi),如下式表示。

聚合酶主要有以下几种:

1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌DNA聚合酶(E. Coli DNA polymerase)主要有3种作用:①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA,填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。它在切口平移(nick translation)中的应用,将在下面介绍。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段,只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性,失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸,则可使DNA带上同位素标记。当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段,要用被切成平头末端的DNA片段连接时,可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头,然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。

另外还有大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ。前者不能利用单链DNA或poly(dA-dT)为模板。需有镁离子和dNTP时才能表现出酶活性,无自发合成DNA的作用。后者没有5’→3外切酶活性,也不能用单链DNA作为模板。

2.噬菌体DNA聚合酶 这里以T4DNA聚合酶为例。它也具有5’→3聚合酶活性,但它的外切酶活性比大肠杆菌的要高200倍。因此,它也可用来补齐单链末端或标记同位素。

(二)RNA聚合酶

RNA聚合酶(RNA polymerase)的作用是转录RNA。有的RNA聚合酶有比较复杂的亚基结构。如大肠杆菌RNA聚合酶有四条多肽链,另有一个促进新RNA分子合成的σ因子,因此它的组成的是α2ββσ。这种结构称为全酶(holoenzyme),除去了σ因子的酶称为核心酶。噬菌体RNA聚合酶则没有亚基。

真核生物的RNA聚合酶分三类。RNA聚合酶Ⅰ存在于核仁中,转录rRNA顺序。RNA聚合酶Ⅱ存在于核质中,转录大多数基因,需要“TATA”框。RNA聚合酶Ⅲ存在于核质中,转录很少几种基因如tRNA基因如5SrRNA基因。有些重复顺序如Alu顺序可能也由这种酶转录。上面提到的“TATA”框又称Goldberg –Hogness顺序,是RNA聚合酶Ⅱ的接触点,是这种酶的转录单位所特有的。它在真核生物的转录基因的5’端一侧,在转录起点上游20至30个核苷酸之间有一段富含AT的顺序。如以转录起始点为0,则在-33到27个核苷酸与-27至21核苷酸之间,有一个“TATA”框。一般是7个核苷酸。RNA聚合酶Ⅱ转录单位的典型结构如图23-2。原核生物中也类似“TATA”框的结构。RNA聚合酶作用在“TATAAT”(Pribnow)盒和“TTGA-CA”框附近。

图23-2 反转录酶的作用机理

(三)反转录酶

反转录酶(Reverse transcripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA( cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。这种酶需要镁离子或锰离子作为辅助因子,当以mRNA为模板时,先合成单链DNA(ssDNA),再在反转录酶和DNA聚合酶Ⅰ作用下,以单链DNA为模板合成“发夹”型的双链DNA(dsDNA),再由核酸酶S1切成二条单链的双链DNA。因此,反转录酶可用来把任何基因的mRNA反转录成cDNA拷贝,然后可大量扩增插入载体后的cDNA。也可用来标记cDNA作为放射性的分子探针。

(四)核酸外切酶

大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ(exonuclease Ⅲ)是从带3’-OH末端的双链DNA,按3’→5’方向切除5’单核苷酸:

大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ则是从单链DNA的3’端和5’端切除寡核苷酸(两种形式):

(1)(2)

前一种酶需要镁离子作辅助因子才有活性;后一种酶则不需镁离子,因此即使在有螯合剂EDTA的情况下也有活性。另一种从噬菌体λ感染的大肠杆菌中提取的λ核酸外切酶是从带有5’磷酸末端的双链DNA上,逐个切除5’单核苷酸,在反应时需要镁离子:

(五)核酸酶S1

核酸酶S1(nuclease S1)主要是降解单链DNA或单链RNA。对单链DNA的活性更高。它的用途是切除DNA片段的单链末端使之成为平头末端,切开合成dscDNA时形成的“发夹”环以及分析DNA-RNA杂合子的结构。

(六)DNA酶

DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ)是随机水解双链或单链DNA的一种内切酶,使DNA分子降解成带有5’磷酸末端的单核苷酸和寡核苷酸的混合物:

在进行重组DNA研究时,必须注意防止DNA酶的污染,否则制备的DNA样品将会降解。因此器皿或试剂高温处理,样品中加EDTA,或放置冰上以破坏或抑制酶活性。

(七)RNA酶

RNA酶A(ribonuclease A)作用于嘧啶核苷酸的3’磷酸根上,切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。另一种RNA酶T1只作用于鸟嘌呤核苷酸的3’磷酸根,切开与相邻核苷酸连接的5’磷酸键。人体的分泌物如唾液,汗液中都含有RNA酶。因此在操作RNA样品时,必须戴手套,实验用的玻璃器皿都要经250℃烘烤4h(RNA酶耐热),或用RNA酶的抑制剂处理。

(八)连接酶

最常用的是T4DNA连接酶(T4DNA ligase),催化双链DNA中相邻的3’OH与5’磷酸根之间形成磷酸二酯键,它可用来连接具有粘性末端的两个DNA片段,或连接两个平头末端的DNA片段,使之成为一个重组DNA分子。可是这种酶只能连接双链DNA而不能连接单链DNA分子。T4RNA连接酶则可在单链DNA分子或RNA分子的5’磷酸根和3’-OH之间催化生成共价键。

(九)末端转移酶

末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotide transferase)的作用是将脱氧核苷酸加到DNA分子的3’-OH末端。

(十)碱性磷酸酶

从DNA或RNA的三磷酸脱氧核糖核苷酸或三磷酸核糖核苷酸上除5’-磷酸根残基。一般的用途是用这种酶处理DNA或RNA后,在5’端上标记32P。在经限制性内切酶酶切DNA片段后,用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)处理可以阻止酶切的片段自身连接,这在克隆DNA片段时特别有用。

校对:2000/06/05   杨丽华

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