创新发展络病学 推进中医药国际化进程 络病理论指导血管病变防治研究取得系列重要进展——第三届国际络病学大会学术报告及系列研究报道(5)
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在第三届国际络病学大会上,有多项临床试验、体外研究结果公布,其内容主要涉及通心络对人体外周血内皮祖细胞(EPC)存活、增殖、迁移和黏附功能的影响,对通心络胶囊治疗冠心病的随机对照试验的系统评价、治疗稳定型心绞痛的临床疗效及对内皮功能的影响,治疗脑血管病随机对照试验的荟萃分析等。
我们将重点推荐第二军医大学附属长征医院吴宗贵等关于通心络对人体外周血EPC迁移和黏附功能影响的实验研究,广州中山大学何穗智等关于通心络胶囊治疗冠心病随机对照试验的系统评价。
通心络对人体外周血EPC增殖、迁移和黏附功能的影响(一)
自从1997年Asahara等首次发现外周血CD34+单个核细胞中含有血管EPC以来,人们已对EPC进行了大量的研究工作。EPC是血管内皮细胞(EC)的前体,可以动员到外周血中,迁移、归巢到血管新生部位,并在迁移部位增殖、分化为EC,形成新的血管。它们在成体血管新生和受损内膜的再内皮化中发挥着重要作用。有关对EPC的研究成果为缺血性疾病、恶性肿瘤的治疗和组织工程研究打开了新的视角。
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血管内皮功能障碍是发生动脉硬化的启动子,并贯穿于冠心病发生发展的全过程,因此逆转失调的血管内皮功能是心血管疾病治疗的新趋势。
EPC参与人胚胎血管生成与出生后血管新生和内皮损伤的修复。新生血管中约25%的EC由EPC增殖分化而来。冠心病患者循环血EPC数量下降了近50%,且功能受损。增加循环血EPC数量、改善其功能是冠心病防治的一个新策略。
通心络由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤勺和冰片等8种成分组成,具有益气活血、通络止痛之功能,可以增加冠脉血流量,改善冠脉血供,抑制缺血再灌注心肌细胞损伤、缩小梗死面积,恢复冠心病病人受损的血管内皮功能等作用。目前已广泛应用于临床心脑血管疾病的防治。
为探讨通心络防治心脑血管病的疗效是否与其影响人体外周血内皮祖细胞相关,上海第二军医大学长征医院吴宗贵教授领导的课题组,就通心络对人体外周血EPC存活、增殖、迁移和黏附功能的影响及其机制进行了系列研究。
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随着对EPC的更深入研究,人们开始倾向于EPC补充治疗,即移植高增殖活性的EPC,也称“supply side”策略。上海第二军医大学长征医院梁小卫、孙承波、王华、梁春、吴宗贵等观察到,通心络在一定浓度范围内可使人血管EPC的迁移、黏附能力有明显改善,并增加EPC数量。这进一步表明,通心络可能具有促进血管内皮修复的作用,因而其在动脉粥样硬化发生、发展过程中具有改善血管内皮功能的积极作用,可以预防及治疗动脉粥样硬化。
通心络对人体外周血内皮祖细胞迁移和黏附功能影响的实验研究
摘要
目的 研究中药通心络对体外培养的人体外周血内皮祖细胞(EPC)迁移和黏附功能的影响。
方法 采用超声溶解方法制备通心络超微粉溶液,密度梯度离心法从外周血获取单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被培养板,培养7天后,洗去非贴壁细胞。采用激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-I和Dil-acLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC,并进一步通过流式细胞仪检测其表面标志物。贴壁细胞分别加入0、10、20、50、100、150、200 μl的通心络超微粉溶液继续培养0、6、12、24、36 h。通过观察细胞形态及采用transwell小室、黏附能力测定实验等检测通心络对EPC迁移、黏附能力的影响。
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结果 通心络不同浓度组均改善了EPC的迁移和黏附能力,其中100 μl、作用36 h的影响最为显著[迁移能力:100 μl通心络与对照组比较(23.2±1.7)对(15.3±2.0),P<0.01); 黏附能力:100 μl通心络与对照组比较(43.8±4.7)vs(28.5±4.7),P<0.01]。
结论 通心络能显著改善外周血EPC的迁移和黏附能力,在一定浓度范围内呈明显时效与量效关系。
材料与方法
1. 主要实验试剂
淋巴细胞分层液、二苯基四氮唑溴盐(MTT)、M199、血管内皮生长因子(VEGF)、FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-Ⅰ)、人纤连蛋白、Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白 (Dil—acLDL)、transwell小室(孔径8 μm)、胎牛血清、胰蛋白酶、细胞超声粉碎仪,通心络超微粉(石家庄以岭药业股份有限公司)。
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2. 通心络超微粉溶液的制备
用培养基DMEM溶解通心络超微粉,配置成10 mg/ml原始液,室温条件下,充分震荡10分钟,超声溶解1分钟,以1000 g离心20分钟后,除去沉淀物,保留上清用于细胞培养。
3. 细胞培养与鉴定
取健康成人外周血50 ml,用密度梯度离心法分离出单个核细胞,以5×106/cm2密度接种于铺在预先包被有人纤连蛋白六孔板培养皿中,每皿中加入3 ml M199培养基(含20%胎牛血清,青霉素100 U/ml,链霉素100 U/ml,VEGF 10 ng/ml,BFGF 2 ng/ml)。置37℃ 5% CO2饱和湿度培养箱中培养。4 d后,PBS洗脱非贴壁细胞,换培养液继续培养。
7 天后,细胞以0.25%胰酶消化,制成1×106 /ml的单个核细胞悬液,细胞与Dil-acLDL(2.4 μg/ml)37℃孵育1 h以检测EPC对DiLDL的摄取。然后用2%多聚甲醛固定细胞10 min。固定后用PBS浸洗,将FITC-UEA-Ⅰ(10 μg/ml)加于上述标本中,在37℃下孵育1 h。通过激光共聚焦显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性细胞为正在分化的EPC。
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细胞悬液中加入荧光标记的CD34、CD133 10 μl(1 mg/ml),以成熟内皮细胞做对照组,流式细胞仪分析细胞CD34、CD133的表达。
4. 实验分组
细胞培养7天后,无血清培养液M199过夜培养24 h。PBS洗脱非贴壁细胞,贴壁细胞随机分成17个组,1~5组为对照组,为正常培养组,分别培养0、6、12、24、36 h,6~10组为通心络100 μl组分别培养0、6、12、24、36 h,11~17组分别加入通心络超微粉溶液0、10、20、50、100、150、200 μl的条件培养基培养36 h。
5. 形态学观察
普通倒置显微镜下观察不同时期细胞的生长特点及形态。
6. EPC迁移能力测定
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我们将不同处理组处理后的EPC用0.25%胰蛋白酶消化收集贴壁细胞,制备成细胞悬液。于24 孔板中放入transwell小室(孔径8 μm)。下室内加入600 μl含VEGF的M199培养液,将100 μl 1×105 EPC细胞悬液加入上室,培养于37℃ 5% CO2饱和湿度培养箱中24 h。取出transwell小室,PBS淋洗,用棉签擦去微孔膜上层的细胞,将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于4%多聚甲醛10 ′,然后用0.25%结晶紫染色。随机计数6个视野(×200),以确定EPC迁移能力。
(未完待续)
图1 激光共聚焦显微镜下通心络与对照组培养7天的EPC细胞(相关内容见下期)
通过共聚焦显微镜鉴定细胞对DiLDL摄取(红色,激发波长543 nm)与凝集素结合(绿色,激发波长477 nm),双染色阳性细胞(呈黄色)是正在分化的EPC (×400),通心络组(100 μl)较对照组EPC明显增加;通心络组:A1~C1;对照组:A2~C2。, 百拇医药