应用BMP治疗骨缺损的过去将来及展望
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参见附件(7kb)。
应用BMP治疗骨缺损的过去将来及展望
2007-1-27 15:30:07 点击：4 次 发表评论
随着现代工农业生产的飞速发展,骨关节创伤的发病率逐年增加并且伤残率较高,因而研究骨关节创伤修复具有非常重要的意义。尽管骨关节创伤在临床治疗方面取得了很大的进展,但仍存在很多难以解决的问题,特别是致伤范围广的损伤或大段骨关缺损,仍然是世界性难题。骨的修复与生长受多种生长因子调控,有多种细胞因子可以促进骨的修复,骨形态发生蛋白(BMP) 是其中最重要的一种,它已被公认为是目前最强的骨诱导因子。如何利用BMP促使骨再生,一直是骨科界研究的热点。
1.应用BMP进行骨修复的研究背景 1965年Urist利用脱钙骨基质在肉内诱发异位成骨。这一实验结果提示在骨基质可能含有一种活性蛋白质,这种活性蛋白质具有使分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞并形成骨织的能力,它就是后来被命名的骨形态发生蛋白(BMP)。Urist实验的成功使骨诱导理论得到证实和确定,成为骨折修复研究发展的里程碑。此后的20多年,骨诱导和BMP的研究日趋活跃,对其理化和生物学特性做了更深入的研究。但由于BMP在骨组织中含量微小(1～2ng/g骨组织),并且一直没有一种纯化和基因的克隆直到本世纪80年代末期才完成随着分子生物学和基因工程的发展,Wozney等人1988年利用重组DNA技术首先克隆得到hBMP-1、BMP-2A(即BMP-2)、BMP-2B(即BMP-4) 、BMP-3的cDNA并在真核细胞和原核细胞中获得表达。1990年Celeste等报道了BMP-5,6,7的克隆化研究,并建议将已克隆的BMP分别命名为BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6BMP-7。同期Ozkaynak报道了骨形成蛋白-1(os teogeneicprotein-1,OP-1)的克隆化研究。比较OP-1与BMP-7的基因和氨基酸序列证明两者是同一多肽。1992年Ozkaynak又报道了OP-2cDNA的克隆化研究。到1996年已发展为BMP-13,并已获得了相应的cDNA克隆。有人认为BMP是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一种,其诱导成骨是和其它成骨因子共同作用的结果,BMP促进其它成骨因子在诱导成骨中的表达,加上其自身促进成骨细胞及成软骨细胞的分化而诱导成骨。BMP是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织形态结构完整时,它处于休眠状态。当骨组织损伤时,BMP迅速出现量的增加及活性的增强。所以骨折端的BMP浓度最高,从而发生有效的骨诱导作用。BMP还广泛存在于骨肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤及梭形细胞瘤中,而软骨肉瘤中却没有探测到BMP的存在，说明软骨细胞不产生BMP。目前大多认为是BMP诱导骨折周围未分化的间充质细胞分化为成软骨细胞及成骨细胞,通过钙盐沉积而形成新骨,从而使骨组织修复,表现为软骨内成骨过程。
2.应用BMP基因治疗思路的形成 Liberian应用Exvivo基因转移的方法,把人BMP-2腺病毒表达载体转染短期培养的大鼠骨髓基质细胞,用于修复自体股骨的基准大小节段性缺损,结果表明,腺病毒转染的骨髓细胞分泌了足够的BMP蛋白来修复该节段性缺损,取得了良好的效果。该腺病毒表达载体还在免疫缺陷动物四头肌内异位成骨。Paul应用鼠BMP-7构建了腺病毒Ad-CMVBMP-7真核表达载体。转染人牙龈成纤维细胞和鼠皮肤成纤维细胞,移植到免疫抑制鼠,这些非骨组织形成了骨。这个模型说明可采用如牙龈、皮肤等容易取得并能再生的组织进行基因治疗Brewitbart等应用人BMP-7构建了反转录病毒表达质粒LNCX-BMP-7和LNβ-actin-BMP-7,用于转染新西兰白兔骨膜细胞。前者由于含有作用强大的CMV启动子,过多地产生了羟基磷灰石,对骨膜细胞产生了毒害;而后者应用了较温和β-actin启动子,转染骨膜细胞效果理想。转染的骨膜细胞通过Northern杂交和酶联免疫反应,证实有BMP-7mRNA和蛋白分泌。Yasunori等应用人BMP-2基因构建了复制缺陷腺病毒表达载体AxCAOBMP-2,并在体外转染C2C12成肌细胞系,转染的C2C12细胞证实有大量BMP-2表达,该细胞在细胞内产生了碱性磷酸酶,在培养基质中产生和分泌骨钙蛋白。说明BMP-2基因在体外转染C2C12细胞可以使成肌细胞转化为成骨细胞。Juenren等应用人BMP-2基因构建了腺病毒表达载体,在体外转染C3H10T1/2间充质前体细胞,该细胞分泌了成熟的BMP-2蛋白。细胞的增殖依赖于表达载体的浓度,转染的细胞表现出碱性磷酸酶活性,意味着向成骨细胞表型转化。实验结果表明腺病毒介导的转基因方法用于骨修复是可行的。另一种基因治疗的方法是直接把含有BMP基因的病毒表达载体或质粒注射入骨缺损。Fang等把鼠全长BMP-4cDNA及人甲状旁腺素cDNA插入pcDNA3表达载体,并包被在胶原中,直接植入骨缺损中。结果BMP-4质粒诱导合成了足够的BMP-4蛋白来加速骨缺损的愈合。该方法的优点是没有应用病毒颗粒,比较安全,并且不需要重新植入细胞,方法简单。胶原支架可以促进细胞移行,还可以保护质粒,起到缓释质粒的作用。简单的方法使作者考虑能否同时转导第二个基因来进一步促进骨缺损的修复,于是把BMP-4表达质粒和甲状旁腺素表达质粒共同植入骨缺损,取得了更为理想的修复效果。Franceschi等参照Hardy的方法应用BMP-构建了腺病毒AsdCMVBMP-7真核表达载体,体外转染COS7细胞产生了BMP-7,转染C2C12细胞使之向成骨细胞表型转化 ......
应用BMP治疗骨缺损的过去将来及展望
2007-1-27 15:30:07 点击：4 次 发表评论
随着现代工农业生产的飞速发展,骨关节创伤的发病率逐年增加并且伤残率较高,因而研究骨关节创伤修复具有非常重要的意义。尽管骨关节创伤在临床治疗方面取得了很大的进展,但仍存在很多难以解决的问题,特别是致伤范围广的损伤或大段骨关缺损,仍然是世界性难题。骨的修复与生长受多种生长因子调控,有多种细胞因子可以促进骨的修复,骨形态发生蛋白(BMP) 是其中最重要的一种,它已被公认为是目前最强的骨诱导因子。如何利用BMP促使骨再生,一直是骨科界研究的热点。
1.应用BMP进行骨修复的研究背景 1965年Urist利用脱钙骨基质在肉内诱发异位成骨。这一实验结果提示在骨基质可能含有一种活性蛋白质,这种活性蛋白质具有使分化的间充质细胞定向分化为成骨细胞并形成骨织的能力,它就是后来被命名的骨形态发生蛋白(BMP)。Urist实验的成功使骨诱导理论得到证实和确定,成为骨折修复研究发展的里程碑。此后的20多年,骨诱导和BMP的研究日趋活跃,对其理化和生物学特性做了更深入的研究。但由于BMP在骨组织中含量微小(1～2ng/g骨组织),并且一直没有一种纯化和基因的克隆直到本世纪80年代末期才完成随着分子生物学和基因工程的发展,Wozney等人1988年利用重组DNA技术首先克隆得到hBMP-1、BMP-2A(即BMP-2)、BMP-2B(即BMP-4) 、BMP-3的cDNA并在真核细胞和原核细胞中获得表达。1990年Celeste等报道了BMP-5,6,7的克隆化研究,并建议将已克隆的BMP分别命名为BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6BMP-7。同期Ozkaynak报道了骨形成蛋白-1(os teogeneicprotein-1,OP-1)的克隆化研究。比较OP-1与BMP-7的基因和氨基酸序列证明两者是同一多肽。1992年Ozkaynak又报道了OP-2cDNA的克隆化研究。到1996年已发展为BMP-13,并已获得了相应的cDNA克隆。有人认为BMP是转化生长因子β(TGF-β)超家族的一种,其诱导成骨是和其它成骨因子共同作用的结果,BMP促进其它成骨因子在诱导成骨中的表达,加上其自身促进成骨细胞及成软骨细胞的分化而诱导成骨。BMP是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织形态结构完整时,它处于休眠状态。当骨组织损伤时,BMP迅速出现量的增加及活性的增强。所以骨折端的BMP浓度最高,从而发生有效的骨诱导作用。BMP还广泛存在于骨肉瘤,恶性纤维组织细胞瘤及梭形细胞瘤中,而软骨肉瘤中却没有探测到BMP的存在，说明软骨细胞不产生BMP。目前大多认为是BMP诱导骨折周围未分化的间充质细胞分化为成软骨细胞及成骨细胞,通过钙盐沉积而形成新骨,从而使骨组织修复,表现为软骨内成骨过程。
2.应用BMP基因治疗思路的形成 Liberian应用Exvivo基因转移的方法,把人BMP-2腺病毒表达载体转染短期培养的大鼠骨髓基质细胞,用于修复自体股骨的基准大小节段性缺损,结果表明,腺病毒转染的骨髓细胞分泌了足够的BMP蛋白来修复该节段性缺损,取得了良好的效果。该腺病毒表达载体还在免疫缺陷动物四头肌内异位成骨。Paul应用鼠BMP-7构建了腺病毒Ad-CMVBMP-7真核表达载体。转染人牙龈成纤维细胞和鼠皮肤成纤维细胞,移植到免疫抑制鼠,这些非骨组织形成了骨。这个模型说明可采用如牙龈、皮肤等容易取得并能再生的组织进行基因治疗Brewitbart等应用人BMP-7构建了反转录病毒表达质粒LNCX-BMP-7和LNβ-actin-BMP-7,用于转染新西兰白兔骨膜细胞。前者由于含有作用强大的CMV启动子,过多地产生了羟基磷灰石,对骨膜细胞产生了毒害;而后者应用了较温和β-actin启动子,转染骨膜细胞效果理想。转染的骨膜细胞通过Northern杂交和酶联免疫反应,证实有BMP-7mRNA和蛋白分泌。Yasunori等应用人BMP-2基因构建了复制缺陷腺病毒表达载体AxCAOBMP-2,并在体外转染C2C12成肌细胞系,转染的C2C12细胞证实有大量BMP-2表达,该细胞在细胞内产生了碱性磷酸酶,在培养基质中产生和分泌骨钙蛋白。说明BMP-2基因在体外转染C2C12细胞可以使成肌细胞转化为成骨细胞。Juenren等应用人BMP-2基因构建了腺病毒表达载体,在体外转染C3H10T1/2间充质前体细胞,该细胞分泌了成熟的BMP-2蛋白。细胞的增殖依赖于表达载体的浓度,转染的细胞表现出碱性磷酸酶活性,意味着向成骨细胞表型转化。实验结果表明腺病毒介导的转基因方法用于骨修复是可行的。另一种基因治疗的方法是直接把含有BMP基因的病毒表达载体或质粒注射入骨缺损。Fang等把鼠全长BMP-4cDNA及人甲状旁腺素cDNA插入pcDNA3表达载体,并包被在胶原中,直接植入骨缺损中。结果BMP-4质粒诱导合成了足够的BMP-4蛋白来加速骨缺损的愈合。该方法的优点是没有应用病毒颗粒,比较安全,并且不需要重新植入细胞,方法简单。胶原支架可以促进细胞移行,还可以保护质粒,起到缓释质粒的作用。简单的方法使作者考虑能否同时转导第二个基因来进一步促进骨缺损的修复,于是把BMP-4表达质粒和甲状旁腺素表达质粒共同植入骨缺损,取得了更为理想的修复效果。Franceschi等参照Hardy的方法应用BMP-构建了腺病毒AsdCMVBMP-7真核表达载体,体外转染COS7细胞产生了BMP-7,转染C2C12细胞使之向成骨细胞表型转化 ......
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