结核病有关新进展.ppt
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结核病有关新进展
西南医院呼吸科胡建林
结核病一直是发展中国家较严重的传染病，1985年以来艾滋病的流行、结核感染者的涌入等原因便美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核病耐药问题使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每
年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万;我国的结核病疫情也相当严重，2000年第四次全国结核病流行病学调查结果表明我国有结核病人500万，每年死亡人数约23.8万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第十一位，在传染病中
居第一位。1993年世界卫生组织(WHO)采用特别步骤宣布结核病全球告急。面对这种严峻的形势，结核病的预防和治疗已引起国内外学者的高度重视。
简述：
结核病DNA疫苗
结核病诊断分型
诊断方法进展
抗结核药物进展
结核病耐药问题
结核病DNA疫苗
目前用于结核病预防的疫苗是卡介苗(BCG)，它自1921年以来就一直被用于人类结核病的预防，但经过半个多世纪的临床对照试验研究，BCG对肺结核的免疫保护力是0～80%，差异很大，1995年WHO总结出BCG不是预防肺结核的有效疫苗。
此外，对于免疫功能缺陷的病人，BCG接种有可能导致全身播散。因此，有必要研制新疫苗。
1990年Wolff等在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨酪肌细胞中表达蛋白至少2个月。1992年Tang等报道人生长激素编码基因的重组质粒接种小鼠后，可诱发机体产生抗人生长激素抗体。1993年Ulmer等首先
报道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不仅可表达蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，还可保护小鼠抵抗异株流感病毒的攻击。至此，产生了核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine)或基因疫苗(Genetic Vaccine )、基因免疫(Genetic immunization)、核酸免疫
(Nucleic Acid Immuniztion)的全新概念，开创了免疫学和疫苗学的新领域。
核酸疫苗(Nucleic Acid Immuniztion)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成，它被注入机体后，通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和
体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。由于RNA疫苗不稳定，在体内存在时间短，表达短暂，生产、贮存、运输比DNA疫苗要求高, 因此，目前研究最多的是DNA疫苗，其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(Naked DNA Vaccine)。几个流感、艾滋病、乙型肝炎、疟疾、结肠癌、T细胞淋巴瘤等DNA疫苗在美国和欧洲已进入Ⅰ或Ⅱ期临床试验。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
一、结核病DNA疫苗的研究现状
DNA疫苗可诱导全面的免疫反应，尤其是特异性CTL可识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体，这对于消除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义。结核病DNA疫苗的研究正日益深入。
(一)结核病预防性DNA疫苗
迄今大约有以下结核病预防性DNA疫苗在动物实验中获得了较理想的效果。
1.Ag85复合物编码基因；2.Pst S编码基因；
3.ESAT6编码基因和MPT64编码基因；
4.65kDa热休克蛋白(hsp60)编码基因；5.Hsp70编码基因；
6.36kDa编码基因；7.19kDa或ahpC编码基因;8.22kDa编码基因;
9.HsplO编码基因;
(二)结核病治疗性DNA疫苗
目前用于结核病治疗的免疫调节剂主要有二类:一类是非特异性的如IFN-Y、IL-2、IL-l2等细胞因子;另一类是特异性的母牛分支杆菌菌苗(商品名维卡菌苗)，是由母牛分支杆菌经高温灭活后冻千制成的。由于前者半衰期短，费用高;而后者
是死菌只能诱导体液免疫和Thl型细胞应答;不能诱导特异性CTL应答。DNA疫苗在细胞内生成内生性抗原，不仅能诱导体液免疫和Thl型细胞应答，还能诱导特异性CTL应答。因此，结核病DNA疫苗不仅有可能成为结核病预防性疫苗，还可能成为治疗性疫苗。
1999年Lowrie等首次将hsp6O、hsp7O和ESAT6质粒DNA疫苗用于小鼠结核病模型的治疗，以BCG质粒载体和生理盐水为对照，hsp6O和hsp7ODNA疫苗诱导产生的IFN-7水平显著高于BCG、质粒载体和生理盐水对照组，并使免疫小鼠脾、肺菌落计数显
著低于其它各组;但ESAT-6DNA疫苗的治疗效果不是很明显。hsp6ODNA疫苗还可使结核病化疗后体内残余的菌数显著减少。该研究结果证明了某些结核病DNA疫苗作为特异性免疫调节剂的可能性。但IL-l2的表达质粒与hsp60DNA疫苗联合注射未
能观察到协同效应，其肺和脾菌落计数均比它们单独免疫的高。
目前关于结核病治疗性DNA疫苗的研究报道还不多，由于采用的小鼠模型不同，而且小鼠对结核分支杆菌不敏感，因此，各研究结果也不尽相同。
(三)制备抗血清
DNA疫苗免疫后可激起机体产生体液免疫应答，产生高效价的特异性多克隆抗体，从而为抗血清的制备开辟了一条简便、快速的新途径。
(四)DNA疫苗可能的免疫学机理
DNA疫苗的免疫学机理尚不十分清楚。结核病DNA疫苗被导人宿主骨酪肌细胞内，并在细胞内表达结核菌蛋白抗原，加工后形成多肽抗原，与宿主细胞MHC I类和MHC Ⅱ类分子结合，被呈递给宿主的免疫识别系统，从而引发特异性细胞和
体液免疫应答。一般认为激活Thl辅助T细胞和CD8+CTL是机体建立结核病保护性免疫所必需的。
DNA转入肌肉细胞后引起免疫应答的机理目前有二种假说:(1)外源性DNA在肌细胞中表达，肌细胞分泌或死亡后释放所表达的蛋白，进入血液循环后刺激抗体产生。(2)骨髓来源的抗原提呈细胞(APC)摄入肌细胞局部释放的抗原，而后通过
MHCI类分子提呈给T淋巴细胞，诱导出CTL反应。即使有了活跃的CTL存在，多数表达抗原肌细胞因其表达的MHCI类分子水平很低，不被CTL溶解破坏，从而长期表达抗原，持续刺激免疫系统。这可能是DNA疫苗肌肉注射后能长时间维持免疫的原因。
DNA疫苗具有较长的免疫记忆能力，其机制尚不清楚，可能是因为它在体内相当于抗原的储存库，不仅刺激免疫记忆，本身就有免疫记忆能力。Kamath等的研究表明DNA疫苗免疫后，可使分泌γ干扰素的T细胞较早出现，并使其反应增强。
(二)DNA疫苗的安全性
DNA疫苗的安全性还存在一定争议。虽然目前所有动物模型研究均己证明DNA疫苗安全有效，但没有足够的依据能排除理论上可能的危险性，还需进一步建立合适的方法检测、排除下列危险性的存在。
1.可能整合人宿主细胞基因组。通过甲基化分析，酶切分析和PCR技术等研究表明，进入骨酪肌细胞的DNA分子独立存在于细胞质中，未发现复制或整合。
2.可能引起免疫系统功能紊乱：(l)诱导产生抗自身DNA或抗自身组织细胞的抗体，引起自身免疫性疾病。，(2)少量表达的抗原可与诱导产生的抗体形成复合物，引起免疫抑制。(3)诱导机体产生特异免疫耐受。
结核病诊断分型
(1999年结核病分类标准)
1.原发型肺结核:为原发结核感染所致的临床病症，包括原发综合征及胸内淋巴结结核。
2.血行播散型肺结核:包括急性血行播散型肺结核(急性粟粒型肺结核)及亚急性、慢性血行播散型肺结核。
3.继发型肺结核:是肺结核中的一个主要类型，包括浸润性、纤维空洞及千酪性肺炎等。
4.结核性胸膜炎:临床上己排除其它原因引起的胸膜炎。包括结核性干性胸膜炎、结核性渗出性胸膜炎、结核性脓胸。
5.其它肺外结核:按部位及脏器命名，如骨关节结核、结核性脑膜炎、肾结核、肠结核等。
诊断方法进展：
噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌
分支杆菌噬菌体在1947年首次分离，至今已分离出250余种。近20年来，分支杆菌噬菌体广泛用于DNA重组技术中，近年来在分支杆菌快速鉴定及药物敏感性试验中得以广泛应用。该方法的基本原理是分支杆菌噬菌体只能感染相应的活的分
支杆菌，如待检标本中无相应的分支杆菌，则噬菌体被随后加入的杀毒剂全部杀死，故随后加入的指示细胞因未受噬菌体感染，因此能在培养皿中生长繁殖，无噬菌斑出现;如待检标本中含有相应的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，免遭杀毒剂破坏，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体，释放出来的噬菌体即可感染指示细胞，并使指示细胞裂解出现噬菌斑。因此，根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分支杆菌。另外，由
于所用指示细胞生长繁殖速度快，18～24h即可观察结果，因此本法具有快速诊断价值。
国外报道，200-300cfu/ml MTB即可以该法检出，国内报道1000cfu/mlMTB可被检出，因此具有较高的灵敏度。特异性试验结果表明，只有结核分支杆菌复合群才出现阳性结果，而常见NTM和常见呼吸道感染细菌检测结果均为阴性。
分组 样本数 阳性数(%)
涂阳培阳20 19(95)
涂阴培阳21 15(71)
涂阴培阴19 5(26)
总之，本法快速、简便，又有很高的特异性和较高的敏感性，不失为结核病快速诊断的有效实验方法之一。
尽管本法将有可能成为结核病快速诊断的有效手段，但下列因素应予注意，以免影响结果。(1)每次实验必须设各种对照，以保证结果的可靠性;(2)加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以
杀死全部噬菌体;(3)浇注平板的琼脂温度不要太高，以免灭活噬菌体；(4)避免操作污染。
结核病有关新进展
西南医院呼吸科胡建林
结核病一直是发展中国家较严重的传染病，1985年以来艾滋病的流行、结核感染者的涌入等原因便美国等欧美发达国家结核病发病率呈回升趋势，尤其是结核病耐药问题使结核病治疗更是雪上加霜。目前全世界有结核病人约2000万，每
年新增结核病人800～1000万，每年死亡人数约300万;我国的结核病疫情也相当严重，2000年第四次全国结核病流行病学调查结果表明我国有结核病人500万，每年死亡人数约23.8万，结核病死亡在我国各种死亡原因中居第十一位，在传染病中
居第一位。1993年世界卫生组织(WHO)采用特别步骤宣布结核病全球告急。面对这种严峻的形势，结核病的预防和治疗已引起国内外学者的高度重视。
简述：
结核病DNA疫苗
结核病诊断分型
诊断方法进展
抗结核药物进展
结核病耐药问题
结核病DNA疫苗
目前用于结核病预防的疫苗是卡介苗(BCG)，它自1921年以来就一直被用于人类结核病的预防，但经过半个多世纪的临床对照试验研究，BCG对肺结核的免疫保护力是0～80%，差异很大，1995年WHO总结出BCG不是预防肺结核的有效疫苗。
此外，对于免疫功能缺陷的病人，BCG接种有可能导致全身播散。因此，有必要研制新疫苗。
1990年Wolff等在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨酪肌细胞中表达蛋白至少2个月。1992年Tang等报道人生长激素编码基因的重组质粒接种小鼠后，可诱发机体产生抗人生长激素抗体。1993年Ulmer等首先
报道用甲型流感病毒基因免疫小鼠，不仅可表达蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，还可保护小鼠抵抗异株流感病毒的攻击。至此，产生了核酸疫苗(Nucleic Acid Vaccine)或基因疫苗(Genetic Vaccine )、基因免疫(Genetic immunization)、核酸免疫
(Nucleic Acid Immuniztion)的全新概念，开创了免疫学和疫苗学的新领域。
核酸疫苗(Nucleic Acid Immuniztion)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成，它被注入机体后，通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原，诱导宿主产生细胞免疫应答和
体液免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的。由于RNA疫苗不稳定，在体内存在时间短，表达短暂，生产、贮存、运输比DNA疫苗要求高, 因此，目前研究最多的是DNA疫苗，其不需要任何化学载体，故又称为裸DNA疫苗(Naked DNA Vaccine)。几个流感、艾滋病、乙型肝炎、疟疾、结肠癌、T细胞淋巴瘤等DNA疫苗在美国和欧洲已进入Ⅰ或Ⅱ期临床试验。1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一。
一、结核病DNA疫苗的研究现状
DNA疫苗可诱导全面的免疫反应，尤其是特异性CTL可识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体，这对于消除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义。结核病DNA疫苗的研究正日益深入。
(一)结核病预防性DNA疫苗
迄今大约有以下结核病预防性DNA疫苗在动物实验中获得了较理想的效果。
1.Ag85复合物编码基因；2.Pst S编码基因；
3.ESAT6编码基因和MPT64编码基因；
4.65kDa热休克蛋白(hsp60)编码基因；5.Hsp70编码基因；
6.36kDa编码基因；7.19kDa或ahpC编码基因;8.22kDa编码基因;
9.HsplO编码基因;
(二)结核病治疗性DNA疫苗
目前用于结核病治疗的免疫调节剂主要有二类:一类是非特异性的如IFN-Y、IL-2、IL-l2等细胞因子;另一类是特异性的母牛分支杆菌菌苗(商品名维卡菌苗)，是由母牛分支杆菌经高温灭活后冻千制成的。由于前者半衰期短，费用高;而后者
是死菌只能诱导体液免疫和Thl型细胞应答;不能诱导特异性CTL应答。DNA疫苗在细胞内生成内生性抗原，不仅能诱导体液免疫和Thl型细胞应答，还能诱导特异性CTL应答。因此，结核病DNA疫苗不仅有可能成为结核病预防性疫苗，还可能成为治疗性疫苗。
1999年Lowrie等首次将hsp6O、hsp7O和ESAT6质粒DNA疫苗用于小鼠结核病模型的治疗，以BCG质粒载体和生理盐水为对照，hsp6O和hsp7ODNA疫苗诱导产生的IFN-7水平显著高于BCG、质粒载体和生理盐水对照组，并使免疫小鼠脾、肺菌落计数显
著低于其它各组;但ESAT-6DNA疫苗的治疗效果不是很明显。hsp6ODNA疫苗还可使结核病化疗后体内残余的菌数显著减少。该研究结果证明了某些结核病DNA疫苗作为特异性免疫调节剂的可能性。但IL-l2的表达质粒与hsp60DNA疫苗联合注射未
能观察到协同效应，其肺和脾菌落计数均比它们单独免疫的高。
目前关于结核病治疗性DNA疫苗的研究报道还不多，由于采用的小鼠模型不同，而且小鼠对结核分支杆菌不敏感，因此，各研究结果也不尽相同。
(三)制备抗血清
DNA疫苗免疫后可激起机体产生体液免疫应答，产生高效价的特异性多克隆抗体，从而为抗血清的制备开辟了一条简便、快速的新途径。
(四)DNA疫苗可能的免疫学机理
DNA疫苗的免疫学机理尚不十分清楚。结核病DNA疫苗被导人宿主骨酪肌细胞内，并在细胞内表达结核菌蛋白抗原，加工后形成多肽抗原，与宿主细胞MHC I类和MHC Ⅱ类分子结合，被呈递给宿主的免疫识别系统，从而引发特异性细胞和
体液免疫应答。一般认为激活Thl辅助T细胞和CD8+CTL是机体建立结核病保护性免疫所必需的。
DNA转入肌肉细胞后引起免疫应答的机理目前有二种假说:(1)外源性DNA在肌细胞中表达，肌细胞分泌或死亡后释放所表达的蛋白，进入血液循环后刺激抗体产生。(2)骨髓来源的抗原提呈细胞(APC)摄入肌细胞局部释放的抗原，而后通过
MHCI类分子提呈给T淋巴细胞，诱导出CTL反应。即使有了活跃的CTL存在，多数表达抗原肌细胞因其表达的MHCI类分子水平很低，不被CTL溶解破坏，从而长期表达抗原，持续刺激免疫系统。这可能是DNA疫苗肌肉注射后能长时间维持免疫的原因。
DNA疫苗具有较长的免疫记忆能力，其机制尚不清楚，可能是因为它在体内相当于抗原的储存库，不仅刺激免疫记忆，本身就有免疫记忆能力。Kamath等的研究表明DNA疫苗免疫后，可使分泌γ干扰素的T细胞较早出现，并使其反应增强。
(二)DNA疫苗的安全性
DNA疫苗的安全性还存在一定争议。虽然目前所有动物模型研究均己证明DNA疫苗安全有效，但没有足够的依据能排除理论上可能的危险性，还需进一步建立合适的方法检测、排除下列危险性的存在。
1.可能整合人宿主细胞基因组。通过甲基化分析，酶切分析和PCR技术等研究表明，进入骨酪肌细胞的DNA分子独立存在于细胞质中，未发现复制或整合。
2.可能引起免疫系统功能紊乱：(l)诱导产生抗自身DNA或抗自身组织细胞的抗体，引起自身免疫性疾病。，(2)少量表达的抗原可与诱导产生的抗体形成复合物，引起免疫抑制。(3)诱导机体产生特异免疫耐受。
结核病诊断分型
(1999年结核病分类标准)
1.原发型肺结核:为原发结核感染所致的临床病症，包括原发综合征及胸内淋巴结结核。
2.血行播散型肺结核:包括急性血行播散型肺结核(急性粟粒型肺结核)及亚急性、慢性血行播散型肺结核。
3.继发型肺结核:是肺结核中的一个主要类型，包括浸润性、纤维空洞及千酪性肺炎等。
4.结核性胸膜炎:临床上己排除其它原因引起的胸膜炎。包括结核性干性胸膜炎、结核性渗出性胸膜炎、结核性脓胸。
5.其它肺外结核:按部位及脏器命名，如骨关节结核、结核性脑膜炎、肾结核、肠结核等。
诊断方法进展：
噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌
分支杆菌噬菌体在1947年首次分离，至今已分离出250余种。近20年来，分支杆菌噬菌体广泛用于DNA重组技术中，近年来在分支杆菌快速鉴定及药物敏感性试验中得以广泛应用。该方法的基本原理是分支杆菌噬菌体只能感染相应的活的分
支杆菌，如待检标本中无相应的分支杆菌，则噬菌体被随后加入的杀毒剂全部杀死，故随后加入的指示细胞因未受噬菌体感染，因此能在培养皿中生长繁殖，无噬菌斑出现;如待检标本中含有相应的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，免遭杀毒剂破坏，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体，释放出来的噬菌体即可感染指示细胞，并使指示细胞裂解出现噬菌斑。因此，根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分支杆菌。另外，由
于所用指示细胞生长繁殖速度快，18～24h即可观察结果，因此本法具有快速诊断价值。
国外报道，200-300cfu/ml MTB即可以该法检出，国内报道1000cfu/mlMTB可被检出，因此具有较高的灵敏度。特异性试验结果表明，只有结核分支杆菌复合群才出现阳性结果，而常见NTM和常见呼吸道感染细菌检测结果均为阴性。
分组 样本数 阳性数(%)
涂阳培阳20 19(95)
涂阴培阳21 15(71)
涂阴培阴19 5(26)
总之，本法快速、简便，又有很高的特异性和较高的敏感性，不失为结核病快速诊断的有效实验方法之一。
尽管本法将有可能成为结核病快速诊断的有效手段，但下列因素应予注意，以免影响结果。(1)每次实验必须设各种对照，以保证结果的可靠性;(2)加入杀毒剂后一定要彻底摇匀，以
杀死全部噬菌体;(3)浇注平板的琼脂温度不要太高，以免灭活噬菌体；(4)避免操作污染。
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