第11章 肿瘤的分子诊断 .doc
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第十一章 肿瘤的分子诊断
第一节分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用
一、肿瘤易感基因的检测
明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有
Rbl(视网膜母细胞瘤)、WTl(肾母细胞瘤)、p53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NFl(神经纤维瘤病)、VHL(Von Hippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)、BRCAl(乳腺癌)等。
二、肿瘤的分类
* 判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，常规病理组织学方法不易区分的
* 如使用限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因的重排情况，则可进行鉴别诊断。
* B细胞起源的淋巴瘤常有Ig?链或?链的基因重排，而T细胞起源的淋巴瘤则常有TCR?链或?链的基因重排，这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。
三、肿瘤的早期诊断
K-Ras基因突变是一种在胰腺癌、结肠癌和肺癌中发生率较高的分子病变事件，应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌，检出率达100%。应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变，其检出率与肿瘤组织中的检测丰相似
四、肿瘤的预后判断
* 肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关
* 如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后相关，* 肿瘤转移抑制基因nm23的状态则与肿瘤转移相关。
* 如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了肠癌癌变和演进的致癌模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征
五、肿瘤的个体化和预见性治疗
* 肿瘤的发生是多基因累积、多步骤、多阶段的过程，在肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式
* 基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义，可提高肿瘤临床治疗的效果。
* 如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺痛存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放疗敏感性。
六、肿瘤的预后监测
应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。
分子诊断的高敏感性有助于及时采取适当的治疗措施和治疗方案。
肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、RNA和DNA水平进行判断。
第二节肿瘤基因过表达及其检测
一、基因过表达的形式
* 癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要的形式之一。
* 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，这种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。
* p53基因，由于其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后，不仅起到癌基因的作用，其产物突变型的p53蛋白半衰期也延长，应用一定的方法可在肿瘤细胞内检测到过表达的p53蛋白。
二、基因过表达的检测
(一)表达产物的检测
* 无论癌基因或抑癌基因，其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，应用免疫组织化学、ELISA、Westernblot方法，检测肿瘤细胞或血清中的蛋白产物。
* 流式细胞仪(flowcytometry)测试法，首先标记荧光于相应的抗体蛋白，标记有荧光的抗体蛋白与含有特异抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞进行分类、测试。
* 影像细胞测试法则可应用特定波长的光密度进行积分，从而得到特定蛋白质的含量。
* 乳腺癌组织中c-ErBb-2表达阳性率可达50%左右
* p53基因表达产物在大多数肿瘤中都有过表达
(二)基因扩增的检测
* 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典的方法为核酸分子杂交，包括原位杂交(in situ hybridization, ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、Southern blot(DNA杂交)、Northern blot(RNA杂交)、原位PCR、反转录P CR等。
* 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属于固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。
* 荧光原位杂交(FISH)是将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。
* 比较基因组杂交(comparative genome hybridization)，即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。
* 原位PCR(in situ polymerase chain reaction)原位PCR技术就是PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。原位PCR可用于DNA和RNA(RT-PCR)的检测。原位PCR作为形态学和细胞分子生物学前沿交叉的产物，对学科前沿研究和交叉学科的发展起着巨大的作用，Anderson曾于1994年生动指出"原位PCR使光学显磁镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。
* Southern杂交是1975年由Southern提出并以其名宇命名的一种DNA特定序列定位技术。基本原理为：从组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性的DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。
* Southern方法出现后不久，1977年Alwine等提出一种类似于Southern的方法，用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，为与Southern相对应而命名为Northem杂交。Northern杂交的基本程序与Southern杂交相似，提取组织或细咆中的RNA，但不需酶切而直接采用变性电泳。Northem杂交的操作过程要严格控制RNase的污染。RNA只与双链DNA探针中的一条链互补，因此杂交时所需双链DNA探针的量相应加大，如采用单链探针，无论是DNA抑或RNA探针，或是寡核苷酸探针，均需确定所用探针能与目标RNA互补。
第三节基因突变及其检测
一、基因突变的形式
在DNA和染色体水平上，基因突变主要有下列几种形式。
(一)点突变
* 点突变(point mutation)指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能
* 点突变可以表现为错义突变(missence)、无义突变(nonsence)、终止码突变(stop codon)和移码突变(frame shift)等多种形式。
(二)基因缺失
* 基因片段的缺失(gene loss)可使该基因激活、转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。
* 基因缺失中较为频发的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因杂合型或纯合型丢失
(三)基因易位或重排
* 某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或重排(gene translocation and rearrangement)。
* 易位与重排易使癌基因被激活，或使抑痛基因失活，从而使细胞恶变。
* 染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因与正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下
(四)其它类型的基因突变
* 基因突变还可以插入、甲基化、染色体非组蛋白改变等导致基因结构异常，致使癌基因激活或抑癌基因失活
* 癌基因或抑癌基因甲基化(methylation)状态改变与肿瘤发生存在密切的关系，在Ras、Myc、p16、p53等基因均发现存在甲基化状态改变。
* 在人类肿瘤细胞中最重要的甲基化碱基是二核苷酸胞嘧啶(CpG)。正常组织细胞DNA甲基化模式的维持对稳定细胞的表型起重要作用，甲基化模式改变，可导致细胞基因表达异常，最终使细胞表型恶性转化。
一、 基因突变的检测方法
(一)PCR-SSCP法
* PCR-SSCP法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。
* 其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使存在有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出现不同的迁移率。
* 由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
(二)杂台双链分析法
* 杂合双链分析(HA)法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。
* 由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率。
* 该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA
* 也只适合于小片段的分析。
(三)突变体富集PCR法
* 突变体富集PCR(mutant-enrich PCR)法的基本原理是利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在已知的限制性内切酶位点，用连续两次的巢式PCR来扩增DNA片段
* 在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。
(四)变性梯度凝胶电泳法
变性梯度凝胶电泳法(DGGE)基本原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的疑胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，则因影响电泳速度变化的程度从而被分离。
(五)化学切割错配法
化学切割错配法(chemical cleavage of mismatch，CCM)。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。
(六)等位基因特异性寡核苷酸分析法
* 等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele，specific oligonucleotide，ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。
* 以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。
* 可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。
(七)DNA芯片技术
* DNA芯片技术(DNAchip)集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。
* 在基因突变检测方面，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测二种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。
(八)连接酶链反应
* 连接酶链反应(ligase chain reaction)与其它核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，* LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5'-磷酸与另一相邻链3'-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与棋板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下.使相邻两引物的5'-磷酸与3，-羟基形成磷酸二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。
(九)等位基因特异性扩增法
* 等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification，ASA)也称扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutattion system，ARMS)，等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等，用于对已知突变基因进行检测。
* 该法通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，-个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个下行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸井得到PGR扩增产物。
* 如果错配位于引物的3'端则导致PCR不能延伸，称为ARMS。
* ARMS和ASPCR均为借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。......（后略) ......
第十一章 肿瘤的分子诊断
第一节分子诊断在肿瘤研究中的意义和应用
一、肿瘤易感基因的检测
明确的肿瘤易感基因及其相关肿瘤有
Rbl(视网膜母细胞瘤)、WTl(肾母细胞瘤)、p53(Li-Fraumeni综合征)、APC(家族性腺瘤性息肉病)、HNPCC(遗传性非息肉病性结肠癌)、NFl(神经纤维瘤病)、VHL(Von Hippel-Lindau综合征)、PTEN(Bannayan-Riley-Ruvalcaba综合征和Cowden综合征)、BRCAl(乳腺癌)等。
二、肿瘤的分类
* 判断淋巴细胞增生与淋巴细胞性肿瘤及其克隆起源，常规病理组织学方法不易区分的
* 如使用限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析免疫球蛋白(Ig)或T细胞受体(TCR)基因的重排情况，则可进行鉴别诊断。
* B细胞起源的淋巴瘤常有Ig?链或?链的基因重排，而T细胞起源的淋巴瘤则常有TCR?链或?链的基因重排，这种分子病理分型比免疫学分型更为准确。
三、肿瘤的早期诊断
K-Ras基因突变是一种在胰腺癌、结肠癌和肺癌中发生率较高的分子病变事件，应用细针穿刺活检材料检测胰腺癌，检出率达100%。应用PCR-RFLP方法检测结肠癌患者粪便中Ras基因突变，其检出率与肿瘤组织中的检测丰相似
四、肿瘤的预后判断
* 肿瘤相关基因的突变、扩增及过表达等改变常与肿瘤的预后密切相关
* 如p53基因突变与乳腺癌、肝癌、结肠癌等多种肿瘤预后相关，* 肿瘤转移抑制基因nm23的状态则与肿瘤转移相关。
* 如Vogelstein根据结肠癌相关基因的变化，提出了肠癌癌变和演进的致癌模型，阐述了癌基因激活、抑癌基因失活与肠上皮细胞增生、癌前状态、癌变和转移各阶段基因变化的特征
五、肿瘤的个体化和预见性治疗
* 肿瘤的发生是多基因累积、多步骤、多阶段的过程，在肿瘤发生、发展的不同时期，可能涉及不同的基因和不同的变化形式
* 基因的变化和基因间的信号传递与肿瘤临床治疗的敏感性密切关联，如能在分子水平上对肿瘤基因变化提供指标，则对肿瘤的个体化和预见性治疗具有指导意义，可提高肿瘤临床治疗的效果。
* 如在90%的胰腺癌、50%的结肠癌、30%的非小细胞肺痛存在Ras基因的激活，对放疗具有抵抗性，如能从基因水平上改变异常基因的状态，则可提高放疗敏感性。
六、肿瘤的预后监测
应用PCR技术检测周围血中的肿瘤细胞，可提高对肿瘤转移监测的准确性。
分子诊断的高敏感性有助于及时采取适当的治疗措施和治疗方案。
肿瘤的分子诊断主要集中于对癌基因、抑癌基因及相关基因的检测，分别在蛋白质、RNA和DNA水平进行判断。
第二节肿瘤基因过表达及其检测
一、基因过表达的形式
* 癌基因的激活有多种表现形式，其中基因产物过表达为重要的形式之一。
* 癌基因一般为单拷贝基因，有其编码的蛋白质，在肿瘤细胞内的一些癌基因在DNA复制过程中形成多个拷贝，形成双微粒染色体和均染区，这种基因的扩增常产生基因产物过表达，表现为mRNA和蛋白质量的增加。
* p53基因，由于其野生型基因产物半衰期短而不易检测到，但突变后，不仅起到癌基因的作用，其产物突变型的p53蛋白半衰期也延长，应用一定的方法可在肿瘤细胞内检测到过表达的p53蛋白。
二、基因过表达的检测
(一)表达产物的检测
* 无论癌基因或抑癌基因，其蛋白产物的过表达可以应用相应的抗体，应用免疫组织化学、ELISA、Westernblot方法，检测肿瘤细胞或血清中的蛋白产物。
* 流式细胞仪(flowcytometry)测试法，首先标记荧光于相应的抗体蛋白，标记有荧光的抗体蛋白与含有特异抗原的细胞结合后，用流式细胞仪对含不同荧光信号的细胞进行分类、测试。
* 影像细胞测试法则可应用特定波长的光密度进行积分，从而得到特定蛋白质的含量。
* 乳腺癌组织中c-ErBb-2表达阳性率可达50%左右
* p53基因表达产物在大多数肿瘤中都有过表达
(二)基因扩增的检测
* 肿瘤基因的扩增可产生过量的表达蛋白，此外，还可表现为基因拷贝数的增加和转录产物mRNA的增加，经典的方法为核酸分子杂交，包括原位杂交(in situ hybridization, ISH)和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)、Southern blot(DNA杂交)、Northern blot(RNA杂交)、原位PCR、反转录P CR等。
* 原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一项技术，属于固相核酸分子杂交范围，它用标记的DNA或RNA为探针在原位检测组织细胞内特定的DNA或RNA序列。
* 荧光原位杂交(FISH)是将荧光素标记克隆的DNA片段与染色体或细胞间期染色质杂交，以测定该特定的DNA片段是否有缺失或扩增。
* 比较基因组杂交(comparative genome hybridization)，即将荧光素分别标记在去除了重复序列的肿瘤及正常细胞基因组DNA上，然后分别与正常染色体进行原位杂交，对该二种不同探针与各个染色体杂交后的信号进行比较，以了解该肿瘤中细胞在不同染色体上缺失或扩增的状态。
* 原位PCR(in situ polymerase chain reaction)原位PCR技术就是PCR扩增技术和原位杂交技术相结合，通过PCR技术对靶核苷酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使基因拷贝数放大，再通过原位杂交方法检测，以达到对靶核苷酸进行定性、定位、定量分析。原位PCR可用于DNA和RNA(RT-PCR)的检测。原位PCR作为形态学和细胞分子生物学前沿交叉的产物，对学科前沿研究和交叉学科的发展起着巨大的作用，Anderson曾于1994年生动指出"原位PCR使光学显磁镜超过电子显微镜在向生物化学和遗传学领域延伸。
* Southern杂交是1975年由Southern提出并以其名宇命名的一种DNA特定序列定位技术。基本原理为：从组织或细胞中获取基因组DNA，用一种或多种限制性内切酶酶切，通过电泳、转印、原位变性固定于一固相支持物，用已标记的特异性的DNA或RNA的探针与固定有DNA的固相支持膜杂交，经放射自显影或化学发光自显影，对显影条带进行分析。
* Southern方法出现后不久，1977年Alwine等提出一种类似于Southern的方法，用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，为与Southern相对应而命名为Northem杂交。Northern杂交的基本程序与Southern杂交相似，提取组织或细咆中的RNA，但不需酶切而直接采用变性电泳。Northem杂交的操作过程要严格控制RNase的污染。RNA只与双链DNA探针中的一条链互补，因此杂交时所需双链DNA探针的量相应加大，如采用单链探针，无论是DNA抑或RNA探针，或是寡核苷酸探针，均需确定所用探针能与目标RNA互补。
第三节基因突变及其检测
一、基因突变的形式
在DNA和染色体水平上，基因突变主要有下列几种形式。
(一)点突变
* 点突变(point mutation)指基因在特定位置发生一个核苷酸的改变，使相应蛋白质的一个氨基酸改变，继而改变了蛋白质的空间构型和生物学功能
* 点突变可以表现为错义突变(missence)、无义突变(nonsence)、终止码突变(stop codon)和移码突变(frame shift)等多种形式。
(二)基因缺失
* 基因片段的缺失(gene loss)可使该基因激活、转录异常，使基因正常的生物学功能丧失。
* 基因缺失中较为频发的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因杂合型或纯合型丢失
(三)基因易位或重排
* 某一基因在肿瘤细胞中从染色体的正常位置转移到其它染色体的某个位置上称为易位或重排(gene translocation and rearrangement)。
* 易位与重排易使癌基因被激活，或使抑痛基因失活，从而使细胞恶变。
* 染色体出现易位、重排等改变时，可使细胞癌基因与正常的抑制子分开而被置于活化DNA序列的控制之下
(四)其它类型的基因突变
* 基因突变还可以插入、甲基化、染色体非组蛋白改变等导致基因结构异常，致使癌基因激活或抑癌基因失活
* 癌基因或抑癌基因甲基化(methylation)状态改变与肿瘤发生存在密切的关系，在Ras、Myc、p16、p53等基因均发现存在甲基化状态改变。
* 在人类肿瘤细胞中最重要的甲基化碱基是二核苷酸胞嘧啶(CpG)。正常组织细胞DNA甲基化模式的维持对稳定细胞的表型起重要作用，甲基化模式改变，可导致细胞基因表达异常，最终使细胞表型恶性转化。
一、 基因突变的检测方法
(一)PCR-SSCP法
* PCR-SSCP法是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链DNA和RNA分子依其碱基序列不同而形成不同构象，一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变。
* 其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构，这种二级结构依赖于其碱基组成，即使存在有一个碱基的不同，也会形成不同的二级结构而出现不同的迁移率。
* 由于该法简单快速，因而被广泛用于未知基因突变的检测。
(二)杂台双链分析法
* 杂合双链分析(HA)法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。
* 由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成突起，在非变性凝胶中电泳时，会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率。
* 该法与SSCP相似，所不同的是SSCP分离的是单链DNA，HA法分离的是双链DNA
* 也只适合于小片段的分析。
(三)突变体富集PCR法
* 突变体富集PCR(mutant-enrich PCR)法的基本原理是利用癌基因或抑癌基因某个编码子部位存在已知的限制性内切酶位点，用连续两次的巢式PCR来扩增DNA片段
* 在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段，野生型因被酶切而不能进入第二次PCR扩增，而突变型则能完整进入第二次PCR扩增并得到产物的富集。
(四)变性梯度凝胶电泳法
变性梯度凝胶电泳法(DGGE)基本原理：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度一致的疑胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，则因影响电泳速度变化的程度从而被分离。
(五)化学切割错配法
化学切割错配法(chemical cleavage of mismatch，CCM)。其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混合变性杂交，在异源杂合的双链核酸分子中，错配的C能被羟胺或哌啶切割，错配的T能被四氧化锇切割，经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变。
(六)等位基因特异性寡核苷酸分析法
* 等位基因特异性寡核苷酸分析法(allele，specific oligonucleotide，ASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术。
* 以PCR和ASO相结合，设计一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了发生突变的部位，以此为探针，与固定在膜上的经PCR扩增的样品DNA杂交。
* 可以用各种突变类型的寡核苷酸探针，同时以野生型探针为对照，如出现阳性杂交带，则表示样品中存在与该ASO探针相应的点突变。
(七)DNA芯片技术
* DNA芯片技术(DNAchip)集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术。
* 在基因突变检测方面，其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸DNA排列在一块集成电路板上，彼此之间重叠一个碱基，并覆盖全部所需检测的基因，将荧光标记的正常DNA和突变DNA分别与两块DNA芯片杂交，由于至少存在一个碱基的差异，正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱，经过共聚焦显微镜分别检测二种DNA分子产生的荧光信号，即可确定是否存在突变。
(八)连接酶链反应
* 连接酶链反应(ligase chain reaction)与其它核酸扩增技术比较，其最大特点为可准确区分基因序列中单个基因突变，* LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5'-磷酸与另一相邻链3'-羟基连接为基础，应用两对互补的引物，双链DNA经加热变性后，两对引物分别与棋板复性，若完全互补，则在连接酶的作用下.使相邻两引物的5'-磷酸与3，-羟基形成磷酸二酯键而连接，前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板，如果配对的碱基存在突变则不能连接和扩增。
(九)等位基因特异性扩增法
* 等位基因特异性扩增法(allele-specific amplification，ASA)也称扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutattion system，ARMS)，等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)等，用于对已知突变基因进行检测。
* 该法通过设计两个5'端引物，一个与正常DNA互补，-个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3'端引物进行两个下行PCR，只有与突变DNA完全互补的引物才可延伸井得到PGR扩增产物。
* 如果错配位于引物的3'端则导致PCR不能延伸，称为ARMS。
* ARMS和ASPCR均为借鉴多重PCR原理，可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点。......（后略) ......
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- 美国临床医学问答—血液肿瘤学(pdg).rar
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