免疫胶体金组化技术.ppt
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免疫胶体金组化技术
主要内容
一、免疫胶体金技术发展史
二、溶胶的基本概念
三、胶体金的制备方法
四、胶体金探针制备
五、光镜免疫金银组织化学
思考题：
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他
们的过程？
6.免疫金间接法与PAG放大法有何区别？
7.IGS和IGSS技术的优点有哪些？
8.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
9.IGS与IGSS有何区别？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜
下金颗粒的免疫金银染色方法
(Immunogold-silver staining, IGSS)。
6.1986年Fritz等人在IGSS法基础上成功地进
行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金
溶胶的概念：溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系分散相以小分子或离
子状态存在(分散相粒子小于1nm)。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系指分散相颗粒在1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通
显微镜下看不见。
(3)粗分散体系指颗粒大于100nm，不稳
定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色；20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色；60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(3)溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
①少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法
胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986)
①取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加
蒸馏水60ml。
②加入1%的HAucl4水溶液0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数颗粒直径(nm)正负误差
1 5.60.9
2 6.70.9
3 7.90.9
4 9.81.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)
取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，迅速中入4ml 1%柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1%柠檬酸三钠(ml) 直径(nm)
1005.0 10.0
1004.0 15.0
1001.5 25.0
1001.050.0
1000.7560.0
1000.6070.0
1000.42 98.0
1000.32147.0
1000.25160
(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985)
A液：1%氯化金1ml
蒸馏水79ml
B液：1%柠檬酸三钠4ml
1%鞣酸0.1ml
25mmol/L K2CO30.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述A液加温到60℃，然后将B液快速加入到A液中，在10min内煮沸，此时颜色由黑→蓝→亮红。
鞣酸---柠檬酸三钠还原法
B液 A液
直径(nm) 1%柠檬酸钠0.1M2%鞣酸H2O 1% H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml)(ml)HAucl4(ml)(ml)
3.胶体金的质量鉴定
胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜10万倍，照片2.5倍，10万×2.5＝250000＝25nm。理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。
(2)胶体金颗均匀度的测定
一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。
(3)影响胶体金颗粒大小的因素
如果总数超过10%以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。其原因如下：
①还原剂不是一次快速加入。
②容器太大或太小及加温至100℃时间
超过15min。
③在室温或4℃保存太久。
④低温保存。
四、胶体金探针制备
1.原理蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，被吸附于胶体金颗粒表面，是根据电荷正负相吸的原理，使其牢固结合，一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。
另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。
2.待标记蛋白质通过透析法除去多余的电解质。长期低温保存的蛋白质，临用前需100000g 4℃离心1h，去除聚合的蛋白质，尤其在浓度高于2mg/ml的情况下。
3.胶体金应用0.1mol/L K2CO3或 0.1NHCL调节pH值在待标记蛋白的等电点或略偏碱。
各种蛋白质、酶的等电点
4.确定胶体金与待标记蛋白质用量
(1)光电比色法
制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml)，分别加入到5ml胶体金中，迅速混均，然后各加入1ml10% Nacl溶液，摇匀，静置5min后测各管，根据金颗粒大小，测OD值(520～580nm)，绘制示意图。
取曲线最先与横轴相接近那一点为蛋白质最稳定量。
(2)目测法
目测法列表说明
(3)估计量：
10ml 15nm胶体金+30μg蛋白质
10ml 3nm胶体金+60μg蛋白质
10ml 8～13nm胶体金+8μg蛋白质
5.胶体金与蛋白质结合
取高度纯化SPA 2ml(含400μg)加入到100ml烧杯中，边搅拌拌边加入98ml 10nm胶体金溶液，10min后，加入一定量的稳定剂聚乙烯乙二醇(终浓度1%)继续搅拌，并测pH。
6.胶体金探针的纯化
(1)初步纯化4000g 4℃ 离心30min，吸取上清，去除沉淀物。
(2)超速离心法纯化根据胶体金颗粒大小不同，其离心力也不完全一致。
③丙烯葡聚糖S-400(Sephacryls-400)装柱后用0.02mol/L pH8.2 TBS平衡层析柱(pH7.4者用于标记的SPA)，平衡好后，吸取上清胶体金液加入层析柱上，加样时不要破坏S-400胶面。
④流速为8ml/h，待胶体金全部进入界面后，再加缓冲液，大约几小时后，可见先滤出液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质，待红色出现可收集，最后肉眼可见黄色终止收集。
7.胶体金探针的质量鉴定
(1)电镜下测定金颗粒大小，均匀程度。
(2)纸膜试验
(3)IGSS或免疫电镜IGS法
8.胶体金探针的保存
(1)SPA金标探针因易形成凝集物，不能冷冻贮存。
(2)用0.01%NaN3 PBS溶液混悬复合物，在4℃中，可稳定数月。
(3)用柠檬酸三钠制作的SPA金标探针可保存一年以上。
(4)用白磷制备的SPA金标探针最多稳定4周。
五、光镜免疫金银组织化学
(一)免疫金染色
1.概述：1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了免疫金法(Immunogold staining,IGS)，IGS法的特点是染色程序简便，不要显色，染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。
2.IGS步骤
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。
(3)1%卵蛋白(EA) 15min 37℃。
(4)适当稀释一抗 37℃ 1h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(5)1%卵蛋白 15min 37℃。
(6)SPA金标探针1:5 37℃ 1h，PBS洗。
(7)双重蒸馏水洗5min×3。
(8)1%戊二醛10min。
(9)双重蒸馏水洗5min×3。
(10)用苏木素衬染核30秒，常规封片。
(11)结果：在光镜下可见部分暗红色点状物
(阳性物质)
3.SPA金标(PAG)放大法
该方法是在IGS间接法的基础上，通过抗SPA抗体上的Fab段和Fc段与PAG上的A蛋白结合，再用PAG，使它在抗原抗体结合部位聚集更多的胶体金颗粒，其敏感性大大提高。
操作步骤如下：
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。
(3)1%卵蛋白(EA) 15min，37℃。
(4)适当稀释一抗(在间接法基础上100倍稀释)
4℃过夜，PBS洗3×3min，1%EA 37℃
15min。
(5)PAG 1:40-1:5037℃1h ，PBS洗3×3min。
(6)1%EA15min 37℃。
(7)抗SPA抗体1:20037℃40min，PBS洗
3×3min。
(8)PAG 1:60 37℃45min，PBS洗
(9)蒸馏水洗5min×2。
(10)1%戊二醛固定10min。
(11)蒸馏水洗5min×2。
(12)0.01%伊文氏蓝衬染2min，常规或甘油
封片。
PAG放大的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性；③背景干净。
(二)免疫金银法(Immunoglold sliver staining, IGSS)
1.基本原理通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag+)还原成银原子(Ag0)。
被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个"银壳"，" 银壳"一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使" 银壳"越变越大，最终抗原位置得以清楚放大。
2.操作流程
(1)石蜡切片脱蜡至水，0.05mol/L pH7.6
TBS洗5min×2。
(2)消化或抗原修复 TBS洗5min×2。
(3)1%卵蛋白 15min。
(4)特异性一抗适当稀释(在EnVision法基
础上1:100-1:1000)4℃过夜或室 温4h或......（后略) ......
免疫胶体金组化技术
主要内容
一、免疫胶体金技术发展史
二、溶胶的基本概念
三、胶体金的制备方法
四、胶体金探针制备
五、光镜免疫金银组织化学
思考题：
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他
们的过程？
6.免疫金间接法与PAG放大法有何区别？
7.IGS和IGSS技术的优点有哪些？
8.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
9.IGS与IGSS有何区别？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜
下金颗粒的免疫金银染色方法
(Immunogold-silver staining, IGSS)。
6.1986年Fritz等人在IGSS法基础上成功地进
行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金
溶胶的概念：溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系分散相以小分子或离
子状态存在(分散相粒子小于1nm)。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系指分散相颗粒在1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通
显微镜下看不见。
(3)粗分散体系指颗粒大于100nm，不稳
定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色；20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色；60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(3)溶胶的聚沉现象胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
①少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法
胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986)
①取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加
蒸馏水60ml。
②加入1%的HAucl4水溶液0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数颗粒直径(nm)正负误差
1 5.60.9
2 6.70.9
3 7.90.9
4 9.81.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)
取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，迅速中入4ml 1%柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1%柠檬酸三钠(ml) 直径(nm)
1005.0 10.0
1004.0 15.0
1001.5 25.0
1001.050.0
1000.7560.0
1000.6070.0
1000.42 98.0
1000.32147.0
1000.25160
(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985)
A液：1%氯化金1ml
蒸馏水79ml
B液：1%柠檬酸三钠4ml
1%鞣酸0.1ml
25mmol/L K2CO30.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述A液加温到60℃，然后将B液快速加入到A液中，在10min内煮沸，此时颜色由黑→蓝→亮红。
鞣酸---柠檬酸三钠还原法
B液 A液
直径(nm) 1%柠檬酸钠0.1M2%鞣酸H2O 1% H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml)(ml)HAucl4(ml)(ml)
3.胶体金的质量鉴定
胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜10万倍，照片2.5倍，10万×2.5＝250000＝25nm。理想的金颗粒大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。
(2)胶体金颗均匀度的测定
一般需测量100个以上的胶体金颗粒，然后用统计学处理，计算胶体金颗粒的平均直径及标准差。
(3)影响胶体金颗粒大小的因素
如果总数超过10%以上大小不等的金颗粒及椭圆形、三角形金颗存在应重新制备。其原因如下：
①还原剂不是一次快速加入。
②容器太大或太小及加温至100℃时间
超过15min。
③在室温或4℃保存太久。
④低温保存。
四、胶体金探针制备
1.原理蛋白质在等电点或稍偏碱的情况下，被吸附于胶体金颗粒表面，是根据电荷正负相吸的原理，使其牢固结合，一般胶体金颗粒表面带负电，与蛋白质所带的正电荷基团间靠静电引力作用相结合。
另外，由于蛋白质分子牢固地结合在金颗粒表面，形成一个蛋白层，从而阻止了胶体金颗粒的相互接触，使标记蛋白质的金探针较为稳定。
2.待标记蛋白质通过透析法除去多余的电解质。长期低温保存的蛋白质，临用前需100000g 4℃离心1h，去除聚合的蛋白质，尤其在浓度高于2mg/ml的情况下。
3.胶体金应用0.1mol/L K2CO3或 0.1NHCL调节pH值在待标记蛋白的等电点或略偏碱。
各种蛋白质、酶的等电点
4.确定胶体金与待标记蛋白质用量
(1)光电比色法
制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液(1ml)，分别加入到5ml胶体金中，迅速混均，然后各加入1ml10% Nacl溶液，摇匀，静置5min后测各管，根据金颗粒大小，测OD值(520～580nm)，绘制示意图。
取曲线最先与横轴相接近那一点为蛋白质最稳定量。
(2)目测法
目测法列表说明
(3)估计量：
10ml 15nm胶体金+30μg蛋白质
10ml 3nm胶体金+60μg蛋白质
10ml 8～13nm胶体金+8μg蛋白质
5.胶体金与蛋白质结合
取高度纯化SPA 2ml(含400μg)加入到100ml烧杯中，边搅拌拌边加入98ml 10nm胶体金溶液，10min后，加入一定量的稳定剂聚乙烯乙二醇(终浓度1%)继续搅拌，并测pH。
6.胶体金探针的纯化
(1)初步纯化4000g 4℃ 离心30min，吸取上清，去除沉淀物。
(2)超速离心法纯化根据胶体金颗粒大小不同，其离心力也不完全一致。
③丙烯葡聚糖S-400(Sephacryls-400)装柱后用0.02mol/L pH8.2 TBS平衡层析柱(pH7.4者用于标记的SPA)，平衡好后，吸取上清胶体金液加入层析柱上，加样时不要破坏S-400胶面。
④流速为8ml/h，待胶体金全部进入界面后，再加缓冲液，大约几小时后，可见先滤出液体呈微黄色，有时略浊，内含大颗粒聚合物等杂质，待红色出现可收集，最后肉眼可见黄色终止收集。
7.胶体金探针的质量鉴定
(1)电镜下测定金颗粒大小，均匀程度。
(2)纸膜试验
(3)IGSS或免疫电镜IGS法
8.胶体金探针的保存
(1)SPA金标探针因易形成凝集物，不能冷冻贮存。
(2)用0.01%NaN3 PBS溶液混悬复合物，在4℃中，可稳定数月。
(3)用柠檬酸三钠制作的SPA金标探针可保存一年以上。
(4)用白磷制备的SPA金标探针最多稳定4周。
五、光镜免疫金银组织化学
(一)免疫金染色
1.概述：1978年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了免疫金法(Immunogold staining,IGS)，IGS法的特点是染色程序简便，不要显色，染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。
2.IGS步骤
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。
(3)1%卵蛋白(EA) 15min 37℃。
(4)适当稀释一抗 37℃ 1h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
(5)1%卵蛋白 15min 37℃。
(6)SPA金标探针1:5 37℃ 1h，PBS洗。
(7)双重蒸馏水洗5min×3。
(8)1%戊二醛10min。
(9)双重蒸馏水洗5min×3。
(10)用苏木素衬染核30秒，常规封片。
(11)结果：在光镜下可见部分暗红色点状物
(阳性物质)
3.SPA金标(PAG)放大法
该方法是在IGS间接法的基础上，通过抗SPA抗体上的Fab段和Fc段与PAG上的A蛋白结合，再用PAG，使它在抗原抗体结合部位聚集更多的胶体金颗粒，其敏感性大大提高。
操作步骤如下：
(1)石蜡切片脱蜡至水。
(2)消化或抗原修复，PBS洗3×3min。
(3)1%卵蛋白(EA) 15min，37℃。
(4)适当稀释一抗(在间接法基础上100倍稀释)
4℃过夜，PBS洗3×3min，1%EA 37℃
15min。
(5)PAG 1:40-1:5037℃1h ，PBS洗3×3min。
(6)1%EA15min 37℃。
(7)抗SPA抗体1:20037℃40min，PBS洗
3×3min。
(8)PAG 1:60 37℃45min，PBS洗
(9)蒸馏水洗5min×2。
(10)1%戊二醛固定10min。
(11)蒸馏水洗5min×2。
(12)0.01%伊文氏蓝衬染2min，常规或甘油
封片。
PAG放大的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性；③背景干净。
(二)免疫金银法(Immunoglold sliver staining, IGSS)
1.基本原理通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子(Ag+)还原成银原子(Ag0)。
被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个"银壳"，" 银壳"一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使" 银壳"越变越大，最终抗原位置得以清楚放大。
2.操作流程
(1)石蜡切片脱蜡至水，0.05mol/L pH7.6
TBS洗5min×2。
(2)消化或抗原修复 TBS洗5min×2。
(3)1%卵蛋白 15min。
(4)特异性一抗适当稀释(在EnVision法基
础上1:100-1:1000)4℃过夜或室 温4h或......（后略) ......
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