免疫胶体金组化技术.ppt
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参见附件(776kb)。
免疫胶体金组化技术
主要内容
一、免疫胶体金技术发展史
二、溶胶的基本概念
三、胶体金的制备方法
四、胶体金探针制备
五、光镜免疫金银组织化学
思考题：
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他
们的过程？
6.免疫金间接法与PAG放大法有何区别？
7.IGS和IGSS技术的优点有哪些？
8.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
9.IGS与IGSS有何区别？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜
下金颗粒的免疫金银染色方法
(Immunogold-silver staining, IGSS)。
6.1986年Fritz等人在IGSS法基础上成功地进
行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金
溶胶的概念：溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系 分散相以小分子或离
子状态存在(分散相粒子小于1nm)。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通
显微镜下看不见。
(3)粗分散体系 指颗粒大于100nm，不稳
定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色 颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色；20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色；60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(3)溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
①少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响 浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求 所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法
胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986)
①取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加
蒸馏水60ml。
②加入1%的HAucl4水溶液0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数 颗粒直径(nm) 正负误差
1 5.6 0.9
2 6.7 0.9
3 7.9 0.9
4 9.8 1.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)
取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，迅速中入4ml 1%柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1%柠檬酸三钠(ml) 直径(nm)
1005.0 10.0
1004.0 15.0
1001.5 25.0
1001.0 50.0
1000.75 60.0
1000.60 70.0
1000.42 98.0
1000.32 147.0
1000.25 160
(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985)
A液：1%氯化金 1ml
蒸馏水 79ml
B液：1%柠檬酸三钠 4ml
1%鞣酸 0.1ml
25mmol/L K2CO3 0.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述A液加温到60℃，然后将B液快速加入到A液中，在10min内煮沸，此时颜色由黑→蓝→亮红。
鞣酸---柠檬酸三钠还原法
B液 A液
直径(nm) 1%柠檬酸钠 0.1M 2%鞣酸 H2O 1% H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml) (ml) HAucl4(ml)(ml)
3.胶体金的质量鉴定
胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜10万倍 ......
免疫胶体金组化技术
主要内容
一、免疫胶体金技术发展史
二、溶胶的基本概念
三、胶体金的制备方法
四、胶体金探针制备
五、光镜免疫金银组织化学
思考题：
1.胶体金的概念，胶体金有哪些特性？
2.影响溶胶稳定性的因素有哪些？
3.制备胶体金的还原剂有哪几种？
4.有哪几种经典的胶体金制备方法？
5.胶体探针的纯化方式有哪二种，请叙述他
们的过程？
6.免疫金间接法与PAG放大法有何区别？
7.IGS和IGSS技术的优点有哪些？
8.IGSS技术存在的问题和克服的办法有哪些？
9.IGS与IGSS有何区别？
一、免疫胶体金技术发展史
1.1939年Kausche和Ruska把烟草叶病毒吸附在金颗粒上，电镜下观察呈高电子密度细颗粒状。
2.1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门菌抗血清与胶体金颗粒结合，用直接IHC检测沙门菌的表面抗原。
3.1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人IgG上，实现了间接免疫金染色法。
同年Bauer等报道将胶体金标记在凝集素上的应用。
4.1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B
淋巴细胞表面抗原。
5.1981年Danscher建立了银显影液增强光镜
下金颗粒的免疫金银染色方法
(Immunogold-silver staining, IGSS)。
6.1986年Fritz等人在IGSS法基础上成功地进
行了彩色IGSS法,使得结果更加鲜艳夺目。
二、溶胶的基本概念
1.胶体金
溶胶的概念：溶胶是指一种物质以或大或小的微小粒子分散在另一种物质中所形成的体系。被分散的物质叫分散相，容纳分散相的另一种物质称为分散介质。按分散相质点的大小不同，分三类。
(1)离子分散体系 分散相以小分子或离
子状态存在(分散相粒子小于1nm)。
具有高度的稳定性。
(2)胶体金分散体系 指分散相颗粒在1～
100nm之间，外观透明不浑浊，在普通
显微镜下看不见。
(3)粗分散体系 指颗粒大于100nm，不稳
定，显微镜下可见。
2.胶体金的一般性状
(1)胶体金的颜色 颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈红葡萄酒色；20～40nm之间吸收波长530nm，呈深红色；60nm的金溶液主要吸收波长600nm为橙黄色光，液体呈蓝紫色。
(3)溶胶的聚沉现象 胶粒之间存在吸引力与排斥力这对矛盾，一旦平衡打破，胶粒便聚结发生聚沉。引起溶胶聚沉的原因有：
①少量电解质对溶胶的作用；
②温度对溶胶稳定性的影响：当温度升高时，吸附能力减少，溶剂化程度降低，溶剂化层变薄，胶粒聚结，不稳定性增加；
③浓度对溶胶的稳定性的影响 浓度增大时，粒子间距离缩小，引力增加，容易聚结而发生聚沉。
三、胶体金的制备
1.制备前的准备
(1)玻璃器皿的清洁 制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。
其清洁流程如下：清洁液泡24h，自流水洗净，洗洁剂洗3～4次，流水冲洗干净，蒸馏水洗4～5次，烤箱烤干备用。如果条件允许，可将器皿进行硅化。
(2)试剂的配制要求 所有配制试剂的容器均按上述要求清洗，配制试剂用双蒸馏水或去离子水。
2.胶体金制备的方法
胶体金的制备方法很多，其中应用较为广泛的方法是化学还原法。这一方法的基本原理是在氯化金水溶液中加入一定的还原剂，使金离子还原成金原子。可用于制备胶体金的还原剂有50余种，但常用的还原剂仅以下三种：即白磷、柠檬酸三钠以及鞣酸。
(1)改良的白磷还原法(Henegouwen,1986)
①取20%饱和度白磷乙醚溶液0.5ml，加
蒸馏水60ml。
②加入1%的HAucl4水溶液0.75ml，加
0.1mol/L K2CO3 0.6ml，振荡变成棕色。
③加热煮沸，至透明红色。
胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系
还原次数 颗粒直径(nm) 正负误差
1 5.6 0.9
2 6.7 0.9
3 7.9 0.9
4 9.8 1.3
5 12 1.0
(2)柠檬酸三钠还原法(Frens 1973)
取0.01%氯化金溶液100ml加热至沸腾，迅速中入4ml 1%柠檬酸三钠水溶液，可见溶液很快变蓝至橙红色。
柠檬酸三钠与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAucl4 1%柠檬酸三钠(ml) 直径(nm)
1005.0 10.0
1004.0 15.0
1001.5 25.0
1001.0 50.0
1000.75 60.0
1000.60 70.0
1000.42 98.0
1000.32 147.0
1000.25 160
(3)鞣酸---柠檬酸三钠还原法(slot 1985)
A液：1%氯化金 1ml
蒸馏水 79ml
B液：1%柠檬酸三钠 4ml
1%鞣酸 0.1ml
25mmol/L K2CO3 0.1ml
蒸馏水 15.8ml
将上述A液加温到60℃，然后将B液快速加入到A液中，在10min内煮沸，此时颜色由黑→蓝→亮红。
鞣酸---柠檬酸三钠还原法
B液 A液
直径(nm) 1%柠檬酸钠 0.1M 2%鞣酸 H2O 1% H2O
(ml) K2CO3(ml) (ml) (ml) HAucl4(ml)(ml)
3.胶体金的质量鉴定
胶体金制备好后，应进行颗粒直径的测定，金颗粒间大小的均匀度鉴定。
(1)胶体金颗粒直径测定
用预先处理好的覆有Formvar膜的300目镍网浸入胶体金溶液内，取出放在空气中干燥或37℃内烤干。于透射电镜下观察其颗粒大小及均匀度，计算平均直径。如电镜10万倍 ......
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