及时排查问题 确保分析质量 ——生物样品分析中存在的准确性问题和改进措施
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——生物样品分析中存在的准确性问题和改进措施
□ 文/魏敏吉 张玉琥 张哲峰 图/本报记者 董笑非
生物样品分析是进行药代动力学(PK)、生物利用度(BA)、生物等效性(BE)研究及药代动力学/药效动力学(PD)分析的基础，是指对来自动物或临床的生物样本中的药物、代谢物、生物标志物的分析。本文针对目前新药申报资料中生物样品分析准确性方面存在的问题，分析探讨其产生的原因及改进措施，以期提高生物样品分析的质量。探讨的问题主要涉及来自临床的血、尿样品的分析，这些问题同样也适用于实验研究中的动物血、尿样品，以及来自动物和人体的其他样品，如粪便、组织、细胞等。
数据准确是根本
在药品审评过程中，审评员经常会发现不符合常理的事情，如按照目前指导原则进行审评，在真实性、方法学、测试批方面均不存在问题的前提下，就AUC(药时曲线下面积)均值而言，同一企业的药品作为参比制剂(批号不同)在同一试验单位测试，前后获得的数据最大会相差6倍；同一企业的试验药品，同一批号、同一剂量，在两个单位按照相同条件分别试验和测试，提供的AUC均值数据相差近2倍。
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以上情况反映的是数据准确性问题。究竟是那些因素导致了这些问题？解开这个谜团的最直接的方法是对出现问题的样品重新进行分析，但实际上，重复测定存在着很多困难，提交资料的单位有时早期并不知道数据的差异，待审评中心发现这个问题时，时间已经过去很久，保存的样品不能确定是否还稳定，因此再分析就失去了意义；另外，还涉及到经费、方法重现等问题。因此，目前大多无法知道上述问题发生的确切原因。
药代动力学、生物等效性研究的指导原则已经颁布多年，被国内单位所广泛接受。该指导原则要求在进行生物样品测定时，首先应建立分析方法，并按照要求进行方法学考核，只有考核通过时，才能进行样品测试。进行方法学考核时要求考察专属性、线性、最低定量限、回收率、稀释完整性(必要时)、基质效应、稳定性等。但要注意，在考核过程中，如果标准品纯度有误或未加校正、配制的母液浓度错误、天平或容器计量不准、使用与测试基质不同的空白生物样品基质(如以临床上用的成分血浆做方法学考核的空白基质)、线性和质控样配制不规范等，这些问题虽然不会影响方法学考核的通过和样品测试结果批符合要求，但均可以造成准确度的巨大差异。
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准确的数据是一切分析的基础，不准确的数据会产生严重的误导作用，造成时间、金钱的浪费，甚至导致本可以上市的药物被拒批。
系统提高研究质量
提高研究数据质量必须注意以下问题：
仪器状态 生物样品分析需要极高的灵敏度和准确度，涉及的仪器必须处于最佳状态，且多数仪器需要计量认证，必要时还要进行3Q认证(IQ/OQ/PQ)。
对照品(标准品) 首选国家对照品(标准品)；对于从试剂公司购买、自制的对照品要保证批次之间的一致性，并提供分析证书；一般情况下，不用自身制剂作为对照品。用对照品计算储备液的浓度时，除含量折算外，还应注意是否需要扣去盐基、水分。
计量容器的准确性 试验中使用的各种计量容器要定期校准、专人专用，如开展一个新的试验时，可以将要使用的计量容器全部重新校准一遍。称量时要考虑天平的感量。
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考核用的生物基质应与样品基质一致 对生物样品的分析必须考虑生物基质的影响。不同基质其离子化效率差别很大，需要在研究中保持生物基质的来源和含量一致，如成分血、动物血不能用来代替临床受试者的血样进行方法学考察，血清和血浆也不能互相替代，也不能用稀释后的血浆代替正常人血浆。在不同来源血浆(清)的专属性、基质效应等考察中要清楚地标明其来源。
线性和质控样配制的规范化 这方面目前问题比较多，也可能是影响数据准确度的一个非常重要的因素。方法学考核的目的是用含药的血浆(清)来模拟实际样品的情况，因此，模拟样和待测样的基质种类及其含量要严格一致。目前申报资料中，制备模拟样主要有四种方法：①将一定体积的工作液加入到生物基质中，之后用生物基质进行稀释获得不同浓度的模拟样，然后等份；②将贮备液稀释成不同的浓度工作液，临用时取同样体积的工作液加入到生物基质中制备成不同浓度的线性和质控模拟样，没有等份；③将不同浓度的工作液加入到试管中吹干，然后再加入固定体积的生物基质，振摇使残渣溶解；④将贮备液稀释成不同浓度的工作液，取同样体积的工作液加入到同样体积的生物基质中制备成不同浓度的模拟样，然后等份。
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以上几种方法均有其优缺点，方法①需要注意加入溶剂的体积比例，第一个点一般应控制在5%以下，且不同浓度的模拟样含有溶剂的比例是不一样的，第一个点稀释时溶剂含量最大。方法②、③均需要注意所制备的贮备液的稳定性。用同一个贮备液制备的线性和质控样，即使贮备液的浓度发生很大变化，其线性和质控数据是不受影响的。方法④为比较规范的线性和质控样品制备方法，注意控制溶剂含量在5%以内。另外还应注意，加入质控样的目的是保证所建立的方法的可靠性，目前的指导原则只是推荐由不同人制备，从提高数据质量来看，应要求由不同人从称量开始进行质控样配制，这其中包括定量下限(LLOQ)样本的配制。配制的质控样的浓度尽量与线性样有区别，以提高质控样的质控作用。配制的质控浓度QCL应在3倍的LLOQ浓度以内，石英晶体徽天平(QCM)应在线性范围的几何或算术平均值的40%~60%。质控样一次配制可以适当多些，不同批次的质控样有时还需要在一个分析批内测定，以比较其浓度是否有明显差异。
内标和最低定量限 内标的浓度要兼顾待测物的含量高低，不能太高和太低，太高时造成峰面积比值很小，易受有效数字的影响；太低时易受基线噪音的影响，应保证S/N>20。进行专属性考察时，不同来源生物样品的干扰峰面积应小于LLOQ样峰面积的20%。交叉干扰峰面积也应小于LLOQ样峰面积的20%。在进行最低定量限确定时，应考虑仪器使用过程中灵敏度下降的因素，S/N应留有一定的冗余度，以便即使灵敏度下降后其S/N值仍能够符合要求。内标选择时，液质联用方法推荐选择高纯度的稳定同位素标记的内标。
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系统适应性和研究者能力考核 每一批分析前推荐使用不同的样品溶液进行系统适用性试验。有的研究使用不含生物基质的LLOQ溶液；有的使用LLOQ、ULOQ、空白样。主要目的是考核仪器的灵敏度、分离度、峰形、信噪比、噪音水平、交叉污染情况等。另外，对参加样品分析的研究者，还应进行研究能力的考核。
转移样品的稳定性 目前开展的许多BE、PK试验，样品采集和测试在不同的单位进行。由于生物样品的特殊性，在常温下，有些成分会迅速降解，导致测试数据失真。在此种情况下，除了制定质保措施外，还需要用数据说明整个样品在转移过程中是稳定的。
分析批序列 进样之间的交叉污染，需要在方法学考核和测试中时刻进行控制，可以在分析批运行前和运行中进行考核。正确的做法应是将不同浓度的质控样品交叉进样，从而在交叉污染存在的情况下，比较各个质控浓度点测试的准确度和精密度。必要时在方法学中进行残留试验考察，即在测试中，线性高浓度点进样后，接着进一个空白样，根据空白样图谱中残留的大小确定所建方法的交叉污染是否合适。
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注重复测和比对
样品复测 除了在一些规定的情况下对已分析的样品进行复测外，有时要在分析计划中做出规定，专门进行一定量的样品复测。
分析方法转移后的再现、实验室间比对 目前的新药研发项目，测试部分往往安排在几个单位进行，此时，有必要进行分析方法转移后的再现考核。有时还需要进行实验室间比对试验，保证后一个实验室的结果与前一个实验室的结果的一致性，这是目前临床试验中亟须加强的一项任务。
交叉考核 当涉及两种或以上方法进行测试时，有必要进行交叉考核，确保两种方法测试数据的一致性。
样品采集 生物样品测定结果不准确的问题还可能来自样品采集过程，涉及到试验过程是否规范(尽量避免采血前受试者刚刚用完餐或大量饮水)、采样时间是否准确、留置针采样时是否去除了残留血样的污染、血浆或血清离心是否及时、有无溶血、是否避光操作、获得的生物样品是否及时冻存等；尿液涉及时间段和体积记录是否准确、留样前混合是否均匀、长时间段的尿样是否冷藏保存等。
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参加实验室之间考核 根据承担的测试项目不同，一定时期内参加权威机构的盲样测试，以评价该实验室的测试水平，是一种较好的提高测试准确性的方法。但目前国内还缺乏此类机构，希望有关单位予以重视。
(作者单位：国家食品药品监管局药品审评中心)
研究数据不够准确的原因是多方面的，有的原因已知，有的原因未知，因此采取的对策可以是针对性的，也可以是预防性的。其中包括：
1.参照药物临床试验生物样本分析实验室管理指南(试行)的要求，对比本单位的不足并加以改进；建立和健全独立运行的质保体系，使之真正地在试验前、中、后发挥作用，而不是走过场。
2.生物样品测试承担单位应积极分析数据差异的原因，获得的数据要与原研企业、国内外文献、本单位以往获得的结果等进行多方面对比，如出现了较大的差异，应积极分析其原因，避免在今后的试验中差异再次发生。
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3.测试人员应相对固定，对人员流动比较大的单位，如一些高校、合同研究单位，承担样品分析的负责人要采取措施保证一个分析项目中测试人员相对稳定，且对加入的新人需要经过培训、能力测试等方可以安排其承担测试任务。
4.当样品采集与测试不在一地进行或样品转移时间比较长时，申办者或研究单位应有相应措施保证样品在转移过程的稳定并用数据说明。
5.当样品分析跨度时间比较长或多个相关试验同时或先后进行时，申办者应采取措施保证不同时间、不同地点的试验结果的一致性。一般情况下，不建议频繁更换样品测试单位。确实需要更换时，应进行实验室比对试验(样品互测)，确保试验数据的一致性。使用不同的方法进行测定时，建议进行交叉验证。
6.由于测试单位提供的数据可以作为支持新药上市的依据，承担测试的试验单位应确保当试验数据与申办者利益出现冲突时能够处在公正立场，为数据质量负责，而不是为试验结果负责，杜绝造假事件和提供虚假数据的发生。
(魏敏吉)
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