表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞血小板衍生生长因子的产生及调节
作者：张建中 郑学毅 马圣清 金子史男
单位：100044 北京医科大学人民医院皮肤科(张建中)；北京医科大学第一医院皮肤科(郑学毅 马圣清)；日本福岛医科大学皮肤科(金子史男)
关键词：角蛋白细胞；成纤维细胞；血小板源生长因子
中华皮肤科杂志/980409 【摘要】 目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)在表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞的产生及其调节因素。方法 培养人角朊细胞和成纤维细胞，用ELISA法测定PDGF多肽分子，用Northern杂交检测PDGF-B链mRNA的表达。结果 人角朊细胞可合成PDGF多肽分子，双羟维生素D3可促进其合成，肉豆寇沸波酯(PMA)可抑制其合成。成纤维细胞不产生PDGF分子，可测到低水平的PDGF-B链mRNA表达。结论 表皮角朊细胞是皮肤中PDGF分子的一个重要产生细胞，成纤维细胞不能产生PDGF可能是由于存在翻译阻抑因素。
, 百拇医药
Production and Regulation of Platelet-Derived Growth Factor inKeratinocytes and Dermal Fibroblasts Zhang Jiangzhong, Zhen Xueyi, MaShengqing, et al. Department of Dermatology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044
【Abstract】 Objective To evaluate the production and regulation of platelet-derived growth factor (PDGF) in the skin. Methods Normal human keratinocytes (NHKs) and human dermal fibroblasts (HDFs) were cultured, PDGFpeptides were measured by ELISA and PDGF-B chain mRNA was detectedby Northern hybridization. Results The results showed that NHKs constitutively producedPDGF molecules, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) inhibited PDGF production, while 1, 25-dihydroxyvitamin D3 enhanced its production. TNF-alpha, interferon-γ and interleukin-1 alpha all failed to affect PDGF production. On the other hand, HDFs produced no PDGF molecule in spite of a low level of PDGF-B chain mRNA expression in Northern hybridization, suggestting a post-transcriptionalblocking of PDGF production in HDFs. Conclusion The results obtained above indicate that epidermal keratinocytes may be the major PDGF-generating cells, whereas dermal fibroblasts the PDGF-responsive cells in the skin.
, 百拇医药
【Key Words】 Keratinocytes Fibroblasts Platelet-derivedgrowth factor
血小板衍生生长因子(PDGF)是一种多功能细胞生长因子，在胚胎发育、创伤愈合、纤维化以及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥作用[1，2]。皮肤是一个极易发生创伤的器官，为探讨在皮肤中PDGF的产生状况，我们利用体外细胞培养体系，研究了PDGF在角朊细胞和真皮成纤维细胞中的产生与调节。
材料和方法
1.细胞培养：正常人角朊细胞培养如文献[3]所述，培养基为角朊细胞无血清培养基(Gibco, USA)，第2～4代细胞用来进行实验；正常人真皮成纤维细胞用10% FBS/DMEM培养，第2～5代细胞用来进行实验。
2.PDGF多肽分子产生及调节：为观察正常人角朊细胞产生PDGF的影响因素，分别用角朊细胞基础培养基(KBM)和角朊细胞生长培养基(KGM)进行培养。在KGM中又分别加入双羟维生素D3(10-6mol/L)、肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、放线菌酮(10μg/ml)、阿维A酯(10-6mol/L)、1.2mmol/L钙离子、肿瘤坏死因子α(TNFα，250U/ml)、γ干扰素(IFN-γ，100U/ml)、白介素1α(IL-1α，2ng/ml)。培养48小时后，分别收集上清液和细胞，置-80℃待测；在正常人真皮成纤维细胞培养中加入肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、前列腺素E1(10-6mol/L)、转化生长因子β1(1ng/ml)、TNFα(250U/ml)、IL-1α(2ng/ml)。培养48小时后，收集上清液和细胞，待测。
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3.PDGF-AB多肽分子检测：用ELISA法进行，检
本文缩称：PDGF：血小板衍生生长因子，KBM：角朊细胞基础培养基，KGM：角朊细胞生长培养基，TNFα：肿瘤坏死因子α，IFN-γ：γ干扰素
测盒购自R&D System，USA，在96孔板中已交联有抗PDGF-AA抗体。检测时将待测样本200μl加入各孔，室温放置2小时，PBS冲洗后再加入200μl过氧化物酶标记的抗PDGF-BB抗体，室温放置2小时，冲洗后用显色缓冲液显色，2mol/L硫酸中止，于ELISA仪上测定A450值(曾称OD值)，参考波长为550nm。
4.正常人真皮成纤维细胞中PDGF-B链mRNA检测：用Northern杂交法进行。简言之：正常人真皮成纤维细胞培养于10cm大培养皿中，待细胞融合后加入肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、双羟维生素D3或0.1%乙醇(溶剂对照)，培养6小时后用变性液裂解细胞，用异硫氰酸胍/酚法提取细胞总RNA，定量，以30μg/孔加入1%甲醛凝胶中电泳。电泳结束后将凝胶置0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分钟，再改为20×SSC浸泡45分钟，并在该液中将RNA转移至尼龙膜上，高温固化，与32P标记的PDGF-B链(c-cis)探针(Promega, USA)于42℃下杂交24小时，杂交结果用医用X光胶片(Kodak)-80℃放射自显影72小时，显色后杂交条带用紫外扫描仪扫描。
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5.统计学方法：各组间PDGF水平比较用t检验。
结 果
1.角朊细胞PDGF的产生及调节：ELISA检测显示，PDGF多肽分子仅能在上清液中测得，在细胞提取液中测不到，此外不同个体的角朊细胞产生的量也存在差异。表1显示生长于KGM中的正常人角朊细胞较生长于KBM中的正常人角朊细胞产生PDGF要多，蛋白合成抑制剂放线菌酮可完全抑制PDGF产生。双羟维生素D3可促进PDGF产生，而肉豆寇沸波酯则抑制其产生。阿维A酯和钙离子对PDGF产生无明显影响。表2显示TNFα、IFN-γ及IL-1α对角朊细胞PDGF的产生无明显影响。
表1 几种药物及化学物质对角朊细胞PDGF产生
的影响(
±s, n=3) 培养条件
, 百拇医药
PDGF-AB(pg/104细胞)
KBM
1.63±0.44
KGM
5.50±0.42
加1.2mmol/L Ca
6.23±0.97
加放线菌酮
0
加双羟维生素D3
9.85±1.22
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加肉豆寇沸波酯
1.99±0.35
加阿维A酯
5.31±0.42
*与KGM组比较，P<0.01
表2 各种细胞因子对角朊细胞产生PDGF的影响(
±s, n=3) 细胞因子
PDGF-AB(pg/104细胞)
KGM
7.59±0.23
KGM+TNFα
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7.03±0.31
KGM+IFN-γ
8.03±0.24
KGM+IL-1α
8.17±1.78
1、2为无刺激细胞，3、4为双羟维生素D3刺激细胞，5、6为肉豆寇沸波酯刺激细胞，7、8为双羟维生素D3与肉豆寇沸波酯共同刺激细胞
图1 培养人成纤维细胞PDGF-B链mRNA Northern杂交结果
2.成纤维细胞PDGF的产生及调节：在正常人真皮成纤维细胞的上清液及细胞提取液中均未检出PDGF分子，用肉豆寇沸波酯、转化生长因子及前列腺素E1刺激细胞后也未能检出。
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3.成纤维细胞PDGF-B链mRNA表达：Northern杂交显示培养正常人真皮成纤维细胞有低水平PDGF-B链mRNA表达，肉豆寇沸波酯和双羟维生素D3均可增强其表达，但将肉豆寇沸波酯和双羟维生素D3同时加入培养基后，则mRNA表达较在单纯肉豆寇沸波酯时有所降低(图1)。
讨 论
PDGF具有广泛的生物学功能，主要靶细胞为来源于中胚叶的结缔组织细胞，可促进其增殖和功能蛋白的产生。PDGF有三种同形：PDGF-AA、BB、AB，它们具有相似的生物学功能及活性。PDGF通过靶细胞上的受体发挥作用，PDGF受体的细胞内部分具有酪氨酸激酶活性[4]。
1993年Ansel等[5]首先报道除血小板、巨噬细胞外，角朊细胞也是PDGF的产生细胞。通过实验，我们发现仅角朊细胞可产生PDGF分子，而成纤维细胞不能，说明在皮肤PDGF的产生也有细胞特异性。我们还发现处于增殖状态的细胞较处于静止状态的细胞可产生更多的PDGF。双羟维生素D3促进PDGF产生的机理还不十分清楚，已知角朊细胞上有维生素D3受体，而此受体同维A酸受体RXR-α均可与双羟维生素D3结合，活化基因中的“维生素D3反应元件”，从而引起一系列细胞反应[6]。维生素D3促进PDGF产生的机制值得进一步研究。
, 百拇医药
我们的实验证明成纤维细胞不能产生PDGF分子，但有相应mRNA的表达，说明在正常人真皮成纤维细胞中可能存在PDGF的翻译阻抑因素。Winkles等[7]也报道正常人真皮成纤维细胞在无刺激时不表达PDGF基因，即使在有丝分裂原刺激下也只一过性地表达；相反成纤维细胞有PDGF受体，而角朊细胞上则几无表达[8]。这样就提示在皮肤中，可能角朊细胞主要为PDGF产生细胞，而成纤维细胞则主要为PDGF效应细胞，这也和迄今为止发现的PDGF的主要功能相一致。
参 考 文 献
1 Ross R. Platelet-derived growth factor. Lancet, 1989,333∶1179-1182.
2 William LT. Stimulation of paracrine and autocrine pathways of cell proliferation by platelet-derived growth factor. Clin Res, 1988,36∶5-10.
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3 张建中, 丸山幸治, 金子史男. 前列腺素E1对角朊细胞和真皮纤维母细胞增殖及细胞因子产生的影响. 中华皮肤科杂志, 1996,29∶27-30.
4 William LT. Signal transduction by the platelet-derived growth factorreceptor. Science, 1989,243∶1564-1570.
5 Ansel JC. Tiesman JP, Olerud JE, et al. Human keratinocytes are the major source of cutaneous platelet-derived growth factor. J Clin Invest, 1933,92∶671-679.
6 Carlberg C, Bendik I, Wyss A, et al. Two signalling pathways for vitamin D. Nature, 1993,361∶657-660.
, http://www.100md.com
7 Winkles J, O′Connor ML, Friesel R. Altered regulation of platelet-derived growth factor A-chain and c-fos gene expression in senescent progeria fibroblasts. J Cell Physiol, 1990,144∶313-325.
8 Hart CE, Bowen-Pope DF. Platelet-derived growth factor receptor: current views of the two-subunit model. J Invest Dermatol, 1990,94∶53s-57s.
(收稿：1997-06-02 修回：1998-01-19), http://www.100md.com
单位：100044 北京医科大学人民医院皮肤科(张建中)；北京医科大学第一医院皮肤科(郑学毅 马圣清)；日本福岛医科大学皮肤科(金子史男)
关键词：角蛋白细胞；成纤维细胞；血小板源生长因子
中华皮肤科杂志/980409 【摘要】 目的 探讨血小板衍生生长因子(PDGF)在表皮角朊细胞和真皮成纤维细胞的产生及其调节因素。方法 培养人角朊细胞和成纤维细胞，用ELISA法测定PDGF多肽分子，用Northern杂交检测PDGF-B链mRNA的表达。结果 人角朊细胞可合成PDGF多肽分子，双羟维生素D3可促进其合成，肉豆寇沸波酯(PMA)可抑制其合成。成纤维细胞不产生PDGF分子，可测到低水平的PDGF-B链mRNA表达。结论 表皮角朊细胞是皮肤中PDGF分子的一个重要产生细胞，成纤维细胞不能产生PDGF可能是由于存在翻译阻抑因素。
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Production and Regulation of Platelet-Derived Growth Factor inKeratinocytes and Dermal Fibroblasts Zhang Jiangzhong, Zhen Xueyi, MaShengqing, et al. Department of Dermatology, People′s Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100044
【Abstract】 Objective To evaluate the production and regulation of platelet-derived growth factor (PDGF) in the skin. Methods Normal human keratinocytes (NHKs) and human dermal fibroblasts (HDFs) were cultured, PDGFpeptides were measured by ELISA and PDGF-B chain mRNA was detectedby Northern hybridization. Results The results showed that NHKs constitutively producedPDGF molecules, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) inhibited PDGF production, while 1, 25-dihydroxyvitamin D3 enhanced its production. TNF-alpha, interferon-γ and interleukin-1 alpha all failed to affect PDGF production. On the other hand, HDFs produced no PDGF molecule in spite of a low level of PDGF-B chain mRNA expression in Northern hybridization, suggestting a post-transcriptionalblocking of PDGF production in HDFs. Conclusion The results obtained above indicate that epidermal keratinocytes may be the major PDGF-generating cells, whereas dermal fibroblasts the PDGF-responsive cells in the skin.
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【Key Words】 Keratinocytes Fibroblasts Platelet-derivedgrowth factor
血小板衍生生长因子(PDGF)是一种多功能细胞生长因子，在胚胎发育、创伤愈合、纤维化以及肿瘤发生等多种生物学过程中发挥作用[1，2]。皮肤是一个极易发生创伤的器官，为探讨在皮肤中PDGF的产生状况，我们利用体外细胞培养体系，研究了PDGF在角朊细胞和真皮成纤维细胞中的产生与调节。
材料和方法
1.细胞培养：正常人角朊细胞培养如文献[3]所述，培养基为角朊细胞无血清培养基(Gibco, USA)，第2～4代细胞用来进行实验；正常人真皮成纤维细胞用10% FBS/DMEM培养，第2～5代细胞用来进行实验。
2.PDGF多肽分子产生及调节：为观察正常人角朊细胞产生PDGF的影响因素，分别用角朊细胞基础培养基(KBM)和角朊细胞生长培养基(KGM)进行培养。在KGM中又分别加入双羟维生素D3(10-6mol/L)、肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、放线菌酮(10μg/ml)、阿维A酯(10-6mol/L)、1.2mmol/L钙离子、肿瘤坏死因子α(TNFα，250U/ml)、γ干扰素(IFN-γ，100U/ml)、白介素1α(IL-1α，2ng/ml)。培养48小时后，分别收集上清液和细胞，置-80℃待测；在正常人真皮成纤维细胞培养中加入肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、前列腺素E1(10-6mol/L)、转化生长因子β1(1ng/ml)、TNFα(250U/ml)、IL-1α(2ng/ml)。培养48小时后，收集上清液和细胞，待测。
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3.PDGF-AB多肽分子检测：用ELISA法进行，检
本文缩称：PDGF：血小板衍生生长因子，KBM：角朊细胞基础培养基，KGM：角朊细胞生长培养基，TNFα：肿瘤坏死因子α，IFN-γ：γ干扰素
测盒购自R&D System，USA，在96孔板中已交联有抗PDGF-AA抗体。检测时将待测样本200μl加入各孔，室温放置2小时，PBS冲洗后再加入200μl过氧化物酶标记的抗PDGF-BB抗体，室温放置2小时，冲洗后用显色缓冲液显色，2mol/L硫酸中止，于ELISA仪上测定A450值(曾称OD值)，参考波长为550nm。
4.正常人真皮成纤维细胞中PDGF-B链mRNA检测：用Northern杂交法进行。简言之：正常人真皮成纤维细胞培养于10cm大培养皿中，待细胞融合后加入肉豆寇沸波酯(10nmol/L)、双羟维生素D3或0.1%乙醇(溶剂对照)，培养6小时后用变性液裂解细胞，用异硫氰酸胍/酚法提取细胞总RNA，定量，以30μg/孔加入1%甲醛凝胶中电泳。电泳结束后将凝胶置0.05mol/L NaOH溶液中浸泡20分钟，再改为20×SSC浸泡45分钟，并在该液中将RNA转移至尼龙膜上，高温固化，与32P标记的PDGF-B链(c-cis)探针(Promega, USA)于42℃下杂交24小时，杂交结果用医用X光胶片(Kodak)-80℃放射自显影72小时，显色后杂交条带用紫外扫描仪扫描。
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5.统计学方法：各组间PDGF水平比较用t检验。
结 果
1.角朊细胞PDGF的产生及调节：ELISA检测显示，PDGF多肽分子仅能在上清液中测得，在细胞提取液中测不到，此外不同个体的角朊细胞产生的量也存在差异。表1显示生长于KGM中的正常人角朊细胞较生长于KBM中的正常人角朊细胞产生PDGF要多，蛋白合成抑制剂放线菌酮可完全抑制PDGF产生。双羟维生素D3可促进PDGF产生，而肉豆寇沸波酯则抑制其产生。阿维A酯和钙离子对PDGF产生无明显影响。表2显示TNFα、IFN-γ及IL-1α对角朊细胞PDGF的产生无明显影响。
表1 几种药物及化学物质对角朊细胞PDGF产生
的影响(
±s, n=3) 培养条件, 百拇医药
PDGF-AB(pg/104细胞)
KBM
1.63±0.44
KGM
5.50±0.42
加1.2mmol/L Ca
6.23±0.97
加放线菌酮
0
加双羟维生素D3
9.85±1.22
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加肉豆寇沸波酯
1.99±0.35
加阿维A酯
5.31±0.42
*与KGM组比较，P<0.01
表2 各种细胞因子对角朊细胞产生PDGF的影响(
±s, n=3) 细胞因子PDGF-AB(pg/104细胞)
KGM
7.59±0.23
KGM+TNFα
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7.03±0.31
KGM+IFN-γ
8.03±0.24
KGM+IL-1α
8.17±1.78
1、2为无刺激细胞，3、4为双羟维生素D3刺激细胞，5、6为肉豆寇沸波酯刺激细胞，7、8为双羟维生素D3与肉豆寇沸波酯共同刺激细胞
图1 培养人成纤维细胞PDGF-B链mRNA Northern杂交结果
2.成纤维细胞PDGF的产生及调节：在正常人真皮成纤维细胞的上清液及细胞提取液中均未检出PDGF分子，用肉豆寇沸波酯、转化生长因子及前列腺素E1刺激细胞后也未能检出。
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3.成纤维细胞PDGF-B链mRNA表达：Northern杂交显示培养正常人真皮成纤维细胞有低水平PDGF-B链mRNA表达，肉豆寇沸波酯和双羟维生素D3均可增强其表达，但将肉豆寇沸波酯和双羟维生素D3同时加入培养基后，则mRNA表达较在单纯肉豆寇沸波酯时有所降低(图1)。
讨 论
PDGF具有广泛的生物学功能，主要靶细胞为来源于中胚叶的结缔组织细胞，可促进其增殖和功能蛋白的产生。PDGF有三种同形：PDGF-AA、BB、AB，它们具有相似的生物学功能及活性。PDGF通过靶细胞上的受体发挥作用，PDGF受体的细胞内部分具有酪氨酸激酶活性[4]。
1993年Ansel等[5]首先报道除血小板、巨噬细胞外，角朊细胞也是PDGF的产生细胞。通过实验，我们发现仅角朊细胞可产生PDGF分子，而成纤维细胞不能，说明在皮肤PDGF的产生也有细胞特异性。我们还发现处于增殖状态的细胞较处于静止状态的细胞可产生更多的PDGF。双羟维生素D3促进PDGF产生的机理还不十分清楚，已知角朊细胞上有维生素D3受体，而此受体同维A酸受体RXR-α均可与双羟维生素D3结合，活化基因中的“维生素D3反应元件”，从而引起一系列细胞反应[6]。维生素D3促进PDGF产生的机制值得进一步研究。
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我们的实验证明成纤维细胞不能产生PDGF分子，但有相应mRNA的表达，说明在正常人真皮成纤维细胞中可能存在PDGF的翻译阻抑因素。Winkles等[7]也报道正常人真皮成纤维细胞在无刺激时不表达PDGF基因，即使在有丝分裂原刺激下也只一过性地表达；相反成纤维细胞有PDGF受体，而角朊细胞上则几无表达[8]。这样就提示在皮肤中，可能角朊细胞主要为PDGF产生细胞，而成纤维细胞则主要为PDGF效应细胞，这也和迄今为止发现的PDGF的主要功能相一致。
参 考 文 献
1 Ross R. Platelet-derived growth factor. Lancet, 1989,333∶1179-1182.
2 William LT. Stimulation of paracrine and autocrine pathways of cell proliferation by platelet-derived growth factor. Clin Res, 1988,36∶5-10.
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3 张建中, 丸山幸治, 金子史男. 前列腺素E1对角朊细胞和真皮纤维母细胞增殖及细胞因子产生的影响. 中华皮肤科杂志, 1996,29∶27-30.
4 William LT. Signal transduction by the platelet-derived growth factorreceptor. Science, 1989,243∶1564-1570.
5 Ansel JC. Tiesman JP, Olerud JE, et al. Human keratinocytes are the major source of cutaneous platelet-derived growth factor. J Clin Invest, 1933,92∶671-679.
6 Carlberg C, Bendik I, Wyss A, et al. Two signalling pathways for vitamin D. Nature, 1993,361∶657-660.
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7 Winkles J, O′Connor ML, Friesel R. Altered regulation of platelet-derived growth factor A-chain and c-fos gene expression in senescent progeria fibroblasts. J Cell Physiol, 1990,144∶313-325.
8 Hart CE, Bowen-Pope DF. Platelet-derived growth factor receptor: current views of the two-subunit model. J Invest Dermatol, 1990,94∶53s-57s.
(收稿：1997-06-02 修回：1998-01-19), http://www.100md.com