酪氨酸酶启动子调控的CD基因治疗恶性黑色素瘤
作者：曹广文 戚中田 潘 欣 张晓琴 高 军 崔 龙△ 孔宪涛▲
单位：
关键词：酪氨酸酶；胞嘧啶脱氨酶；黑色素瘤；基因治疗
摘要 目的摘要 目的： 研究丙肝病毒非结构蛋白基因3(ns3基因)在体外真核细胞中的诱导表达。方法： 以PCR方法从含HCV ns3基因的重组载体pBns3中扩增出ns3基因，并将其插入到克隆载体pGEM-T中，再与表达载体pMSG重组， 以得到重组表达载体pMSG-ns3。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物CHO细胞，经地塞米松(DM)诱导，采用ELISA及Western-blot技术检测NS3蛋白的表达水平。结果： 用所构建的诱导型表达载体pMSG-ns3转染CHO细胞，经DM(3×10-8 mol/L)诱导后可表达NS3蛋白，其浓度与时间呈正相关。结论： 所得到的表达载体在培养细胞中能够有效地表达，为下一步研究丙肝病毒ns3基因在活体内的生物学特性准备了条件。
, http://www.100md.com
中国图书资料分类法分类号 R373.2
Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in cultured cells
Zhang Shuzhong, Liang Jiajing, Qi Zhongtian, Hu Yiping (Department of Cell Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the inducible expression of hepatitis C virus ns3 gene (HCV ns3) in eukaryotic cells. Methods: The ns3 gene was obtained from plasmid pBns3 by polymerase chain reaction and inserted into the cloning vector pGEM-T. Then, the ns3 was subcloned into the vector pMSG to generate dexamethasone (DM)-inducible expression plasmid pMSG-ns3. CHO cells were transfected by pMSG-ns3 by using calcium phosphate precipitated method and cultivated for 12 to 24 h.The transfected cells were induced with DM and the transient expression of NS3 protein was analyzed by using ELISA and Western-blot methods. Results: After treatment with 3×10-8 mol/L DM,the expression of NS3 was observed in the transfected CHO cells. A slightly higher level of NS3 was shown with the delay time of DM treatment. Conclusion: The inducible expressing vector pMSG-ns3 might be helpful for further studies of the characterizations of the ns3 gene in vivo.
, 百拇医药
Key words hepatitis C virus; non-structural gene 3; gene expression
丙肝病毒(HCV)是近年来发现的一种新型RNA病毒，其基因组的核苷酸顺序在不同地域所流行的病毒株中存在一定的差异[1,2]。有研究表明: 该病毒的非结构蛋白3(NS3)具有蛋白酶活性,在HCV前体蛋白的加工过程中起剪切作用[3～5]。为探讨ns3基因产物的蛋白酶活性是否与丙肝病毒的致病作用有关，我们用PCR方法从重组克隆载体pBns3(载有中国人HCV ns3基因)中扩增出ns3基因，构建了ns3基因的诱导型表达载体，并实现了在离体培养细胞中的表达。该研究为进一步观察ns3基因产物在活体动物内的生物学作用打下了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 质粒载体 重组载体pBns3为本校微生物学教研室提供，克隆载体pGEM-T Vector System Kit购自Promega公司，表达载体pMSG由郑文超博士提供。
1.1.2 细胞株 大肠杆菌DH5α, CHO细胞株为本室保存。
1.1.3 PCR引物设计与合成 引物由美国人类基因治疗研究所的王苏鸣博士合成。引物1: 5-GTCGCTAGCCATGGAATTCCCTACG-3中引入了限制性酶切位点NheⅠ(-GCTAGC-)、翻译起始密码ATG和Kozak顺序(-GCCATGG-)。引物2: 5-CGGCGCTCGAGTGGAATTTCATACAA-3中引入了限制性酶切位点 XhoⅠ(-CTCGAG-)。 以重组质粒pBns3为模板， 应扩增出690 bp片段。
1.1.4 工具酶和主要试剂 各种限制性内切酶、T4连接酶、碱性磷酸酶(CIP)均购自Promega公司；QIAquick gene gel kit为德国QIAgen公司产品，fmol DNA Sequencing System kit, Protoblot Western blot AP System kit购自Promega公司，人抗HCV血清、丙型肝炎病毒抗体酶标免疫检测试剂盒(TMB显色)为我校微生物学教研室提供。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 克隆载体pGEM-ns3及表达载体pMSG-ns3的构建 利用设计的PCR引物从重组质粒pBns3中扩增出690 bp的ns3基因，与克隆载体pGEM-T重组，转染DH5α，经氨苄青霉素抗性及α互补双重选择，挑取白色菌落，抽取DNA酶切鉴定、测序证实确实含有引物掺入的起始密码ATG，且符合ns3编码阅读框架。将克隆载体pGEM-ns3中的ns3进一步与pMSG酶切重组，构建表达载体pMSG-ns3(图1)。
图 1 重组克隆载体pGEM-ns3和表达载体
pMSG-ns3 构建示意图
, 百拇医药 Fig 1 The map showing the construction of
pGEM-ns3 and pMSG-ns3
1.2.2 CHO细胞转染及诱导表达 纯化回收的pMSG-ns3利用磷酸钙沉淀法转染CHO细胞4 h后， 加10%灭菌甘油处理2 min， 换新鲜培养基继续培养24 h； 加地塞米松(DM, 终浓度为3×10-8 mol/L)分别诱导8, 24, 32 h后检测蛋白表达， 未转染质粒组经相同浓度DM处理32 h作为阴性对照。
1.2.3 NS3蛋白的检测 收集经DM诱导后的CHO细胞，用裂解液处理， 离心收集上清，经蛋白定量后用于ELISA及Western-blot测定。
1.2.4 统计学处理 采用配对t检验法(用Duncans Mutiple Range Test软件分析)。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 HCV ns3的PCR扩增 在退火温度为58℃时，PCR扩增产物为均一条带，大小约690 bp，与预期ns3目标片段相符(图2)。
图 2 重组载体pBns3 PCR扩增
Fig 2 The PCR results of pBns3
Lane 1: λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker; Lane 2,3: Negative
controls; Lane 4,5: PCR results from other primers;
, 百拇医药
Lane 6: PCR products of ns3 gene annealing at 58℃;
Lane 7: PCR result from another annealing temperature
2.2 重组载体pGEM-ns3的构建 挑取的8个克隆中，除克隆8外，其余7个克隆均可被NheⅠ及XhoⅠ双酶切为690 bp和3 kb两条片段，与预期结果符合(图3)。克隆1,4,7作进一步核苷酸序列测定，经PCR序列测定结果证实都具有以下特点：(1)ns3基因两端已成功地引入了Kozak顺序、翻译起始密码子ATG、限制性酶切位点NheⅠ和XhoⅠ；(2)各重组载体中含有690 bp的HCV ns3基因序列；(3)本实验中的起始密码负责翻译的阅读框架与HCV ns3 区阅读框相符合。从而确定克隆1,4,7均分别为重组载体pGEM-ns3。
2.3 表达载体pMSG-ns3的构建 挑取的多个克隆中，有4个克隆均可被SacⅠ和HindⅢ分别酶切为4.9,3.5和7.5 kb及740 bp等片段，与预期结果符合(图4)。其中克隆1经序列测定证实已插入ns3基因。
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图 3 重组载体pGEM-ns3由NheⅠ及XhoⅠ双酶切鉴定
Fig 3 pGEM-ns3 digested with NheⅠ and XhoⅠ
Lane 1:λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker; Lane 2～9:
Clone 8～1; Lane 10: PCR marker
2.4 NS3蛋白在哺乳动物细胞中的诱导表达 表达载体pMSG-ns3在CHO细胞中瞬时诱导表达产物的ELISA检测结果， 经配对t检验法分析表明： 各实验组经DM诱导的ELISA检测结果与阴性对照组比较均有显著差异(P<0.05)， 其中以诱导32 h实验组相差最为显著(表1)。 Western-blot检测结果，诱导8,24,32h各组均在近3万处出现一蛋白条带， 并且以诱导32 h实验组该带最为明显(图略)。
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图4 表达载体pMSG-ns3(克隆1)由SacⅠ
及HindⅢ双酶切鉴定
Fig 4 pMSG-ns3 (clone 1) digested with SacⅠ and HindⅢ
Lane 1:λ/HindⅢ marker; Lane 2: Clone 1 digested
with HindⅢ; Lane 3:Clone 1 digested with SacⅠ;
Lane 4:λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker
表 1 表达载体pMSG-ns3在CHO细胞中诱导表达ELISA值
Tab 1 The results of ELISA that CHO cells was transfected by pMSG-ns3 and was induced by DM(n=3,
±s)
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Serial dilution
Negative
control
Treatment periods (t/h)
0
8
24
32
1∶ 16
0.08±0.02
0.18±0.01*
0.20±0.01*
, 百拇医药
0.20±0.02*
0.22±0.01*
1∶ 32
0.04±0.02
0.19±0.02*
0.17±0.01*
0.18±0.01*
0.22±0.01*
1∶ 64
0.02±0.00
, 百拇医药
0.14±0.02*
0.15±0.01*
0.14±0.01*
0.20±0.02*
1∶128
0.03±0.02
0.12±0.01*
0.15±0.00*
0.12±0.01*
0.16±0.01*
, 百拇医药
1∶256
0.01±0.01
0.06±0.01*
0.09±0.03*
0.11±0.01*
0.07±0.01*
*P<0.05 vs negative control
3 讨 论
流行病学资料表明， HCV携带者已经超过世界总人口的1%以上， HCV 患者容易转化为慢性感染过程， 最终导致肝硬化， 甚至肝细胞癌[6]。 研究发现许多具有蛋白酶活性的病毒常常对宿主有直接损伤作用， 例如HIV编码的蛋白酶通过降解细胞骨架(细胞骨架参与维持形态、 促进细胞分裂外， 还参与信号传导及基因调控)， 可以引起细胞异常增殖而直接诱发癌症[7,8]。 NS3 蛋白也具有蛋白酶活性， 是否同样存在对宿主细胞骨架的病理损害， 而与HCV患者癌变率高有关是十分值得探讨的问题。
, http://www.100md.com
本研究构建的诱导型表达载体pMSG-ns3中分别引入了翻译起始密码ATG及促进表达的Kozak顺序(-GCCATGG-) 。 在转染的另外几种细胞株实验中， 如Hela, SMMC-7721(人的肝癌细胞)， 发现诱导前后的ELISA结果无显著变化， 分析原因可能为: (1)上述两种细胞均来自人体细胞， 在蛋白表达量低的情况下， 细胞提取物中存在可与检测抗体结合的非特异成分， 从而造成背景增高， 干扰结果； (2)不同细胞中存在某些调控因子， 对同一表达载体中启动子的作用不同， 造成下游靶蛋白表达效率差异。 实验改用中国仓鼠卵巢CHO细胞作为转染宿主， 目的是避免与检测抗体同源而造成的非特异性干扰， 结果转染的CHO细胞经DM诱导后可成功地检测出NS3蛋白(本课题所克隆的ns3 基因长度为690 bp， 编码蛋白相对分子质量近3万)， 而且蛋白表达量随时间推移而稍有增加； 其中诱导前实验组未表达该蛋白(尽管其ELISA检测结果与转染前的阴性对照组相比P<0.05)， 因此判断表达蛋白的相对分子质量大小以及排除ELISA 检测系统中的影响因素, 需进一步作Western-blot分析。 上述实验通过对表达载体pMSG-ns3体外细胞诱导瞬时表达的研究， 为下一步筛选能永久表达NS3蛋白的细胞株提供了前提条件； 对研究NS3的生物学特性及建立转基因小鼠品系打下了基础。
, 百拇医药
参 考 文 献
1 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone hepatitis genome. Science, 1989,244:359
2 戚中田, 潘 卫. 中国人丙型肝炎病毒基因组λgt11 cDNA库的免疫筛选与鉴定. 第二军医大学学报,1992,13(5):401
3 Tomei L, Failla C, Santolini E, et al. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J Virol, 1993,67(7):4017
4 Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 1991, 65(3):1105
, 百拇医药
5 Bartenschlager R, Ludwina AL, Mous J, et al. Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. J Virol, 1993,67(7):3835
6 Plageman PGW. Hepatitis C virus Brief Review. Arch Virol, 1991,120(3/4):165
7 Shoeman RL, Honer B, Mothes E, et al. Potential role of the viral protease in human immunodeficiency virus type 1 associated pathogenesis. Med Hypotheses, 1992,37(3):137
8 汪 宁. 细胞骨架刚性的调控与癌症的抑制. 见:李春海,郭亚军主编. 肿瘤分子生物学研究进展. 北京:军事医学科学出版社, 1996.53～56
(1998-03-12收稿, 1998-06-22修回)
, 百拇医药
单位：
关键词：酪氨酸酶；胞嘧啶脱氨酶；黑色素瘤；基因治疗
摘要 目的摘要 目的： 研究丙肝病毒非结构蛋白基因3(ns3基因)在体外真核细胞中的诱导表达。方法： 以PCR方法从含HCV ns3基因的重组载体pBns3中扩增出ns3基因，并将其插入到克隆载体pGEM-T中，再与表达载体pMSG重组， 以得到重组表达载体pMSG-ns3。然后采用磷酸钙沉淀法将其转染哺乳动物CHO细胞，经地塞米松(DM)诱导，采用ELISA及Western-blot技术检测NS3蛋白的表达水平。结果： 用所构建的诱导型表达载体pMSG-ns3转染CHO细胞，经DM(3×10-8 mol/L)诱导后可表达NS3蛋白，其浓度与时间呈正相关。结论： 所得到的表达载体在培养细胞中能够有效地表达，为下一步研究丙肝病毒ns3基因在活体内的生物学特性准备了条件。
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中国图书资料分类法分类号 R373.2
Cloning of the non-structural gene 3 of hepatitis C virus and its inducible expression in cultured cells
Zhang Shuzhong, Liang Jiajing, Qi Zhongtian, Hu Yiping (Department of Cell Biology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University, Shanghai, 200433)
Abstract Objective: To study the inducible expression of hepatitis C virus ns3 gene (HCV ns3) in eukaryotic cells. Methods: The ns3 gene was obtained from plasmid pBns3 by polymerase chain reaction and inserted into the cloning vector pGEM-T. Then, the ns3 was subcloned into the vector pMSG to generate dexamethasone (DM)-inducible expression plasmid pMSG-ns3. CHO cells were transfected by pMSG-ns3 by using calcium phosphate precipitated method and cultivated for 12 to 24 h.The transfected cells were induced with DM and the transient expression of NS3 protein was analyzed by using ELISA and Western-blot methods. Results: After treatment with 3×10-8 mol/L DM,the expression of NS3 was observed in the transfected CHO cells. A slightly higher level of NS3 was shown with the delay time of DM treatment. Conclusion: The inducible expressing vector pMSG-ns3 might be helpful for further studies of the characterizations of the ns3 gene in vivo.
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Key words hepatitis C virus; non-structural gene 3; gene expression
丙肝病毒(HCV)是近年来发现的一种新型RNA病毒，其基因组的核苷酸顺序在不同地域所流行的病毒株中存在一定的差异[1,2]。有研究表明: 该病毒的非结构蛋白3(NS3)具有蛋白酶活性,在HCV前体蛋白的加工过程中起剪切作用[3～5]。为探讨ns3基因产物的蛋白酶活性是否与丙肝病毒的致病作用有关，我们用PCR方法从重组克隆载体pBns3(载有中国人HCV ns3基因)中扩增出ns3基因，构建了ns3基因的诱导型表达载体，并实现了在离体培养细胞中的表达。该研究为进一步观察ns3基因产物在活体动物内的生物学作用打下了基础。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 质粒载体 重组载体pBns3为本校微生物学教研室提供，克隆载体pGEM-T Vector System Kit购自Promega公司，表达载体pMSG由郑文超博士提供。
1.1.2 细胞株 大肠杆菌DH5α, CHO细胞株为本室保存。
1.1.3 PCR引物设计与合成 引物由美国人类基因治疗研究所的王苏鸣博士合成。引物1: 5-GTCGCTAGCCATGGAATTCCCTACG-3中引入了限制性酶切位点NheⅠ(-GCTAGC-)、翻译起始密码ATG和Kozak顺序(-GCCATGG-)。引物2: 5-CGGCGCTCGAGTGGAATTTCATACAA-3中引入了限制性酶切位点 XhoⅠ(-CTCGAG-)。 以重组质粒pBns3为模板， 应扩增出690 bp片段。
1.1.4 工具酶和主要试剂 各种限制性内切酶、T4连接酶、碱性磷酸酶(CIP)均购自Promega公司；QIAquick gene gel kit为德国QIAgen公司产品，fmol DNA Sequencing System kit, Protoblot Western blot AP System kit购自Promega公司，人抗HCV血清、丙型肝炎病毒抗体酶标免疫检测试剂盒(TMB显色)为我校微生物学教研室提供。
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1.2 方法
1.2.1 克隆载体pGEM-ns3及表达载体pMSG-ns3的构建 利用设计的PCR引物从重组质粒pBns3中扩增出690 bp的ns3基因，与克隆载体pGEM-T重组，转染DH5α，经氨苄青霉素抗性及α互补双重选择，挑取白色菌落，抽取DNA酶切鉴定、测序证实确实含有引物掺入的起始密码ATG，且符合ns3编码阅读框架。将克隆载体pGEM-ns3中的ns3进一步与pMSG酶切重组，构建表达载体pMSG-ns3(图1)。
图 1 重组克隆载体pGEM-ns3和表达载体
pMSG-ns3 构建示意图
, 百拇医药 Fig 1 The map showing the construction of
pGEM-ns3 and pMSG-ns3
1.2.2 CHO细胞转染及诱导表达 纯化回收的pMSG-ns3利用磷酸钙沉淀法转染CHO细胞4 h后， 加10%灭菌甘油处理2 min， 换新鲜培养基继续培养24 h； 加地塞米松(DM, 终浓度为3×10-8 mol/L)分别诱导8, 24, 32 h后检测蛋白表达， 未转染质粒组经相同浓度DM处理32 h作为阴性对照。
1.2.3 NS3蛋白的检测 收集经DM诱导后的CHO细胞，用裂解液处理， 离心收集上清，经蛋白定量后用于ELISA及Western-blot测定。
1.2.4 统计学处理 采用配对t检验法(用Duncans Mutiple Range Test软件分析)。
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2 结 果
2.1 HCV ns3的PCR扩增 在退火温度为58℃时，PCR扩增产物为均一条带，大小约690 bp，与预期ns3目标片段相符(图2)。
图 2 重组载体pBns3 PCR扩增
Fig 2 The PCR results of pBns3
Lane 1: λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker; Lane 2,3: Negative
controls; Lane 4,5: PCR results from other primers;
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Lane 6: PCR products of ns3 gene annealing at 58℃;
Lane 7: PCR result from another annealing temperature
2.2 重组载体pGEM-ns3的构建 挑取的8个克隆中，除克隆8外，其余7个克隆均可被NheⅠ及XhoⅠ双酶切为690 bp和3 kb两条片段，与预期结果符合(图3)。克隆1,4,7作进一步核苷酸序列测定，经PCR序列测定结果证实都具有以下特点：(1)ns3基因两端已成功地引入了Kozak顺序、翻译起始密码子ATG、限制性酶切位点NheⅠ和XhoⅠ；(2)各重组载体中含有690 bp的HCV ns3基因序列；(3)本实验中的起始密码负责翻译的阅读框架与HCV ns3 区阅读框相符合。从而确定克隆1,4,7均分别为重组载体pGEM-ns3。
2.3 表达载体pMSG-ns3的构建 挑取的多个克隆中，有4个克隆均可被SacⅠ和HindⅢ分别酶切为4.9,3.5和7.5 kb及740 bp等片段，与预期结果符合(图4)。其中克隆1经序列测定证实已插入ns3基因。
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图 3 重组载体pGEM-ns3由NheⅠ及XhoⅠ双酶切鉴定
Fig 3 pGEM-ns3 digested with NheⅠ and XhoⅠ
Lane 1:λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker; Lane 2～9:
Clone 8～1; Lane 10: PCR marker
2.4 NS3蛋白在哺乳动物细胞中的诱导表达 表达载体pMSG-ns3在CHO细胞中瞬时诱导表达产物的ELISA检测结果， 经配对t检验法分析表明： 各实验组经DM诱导的ELISA检测结果与阴性对照组比较均有显著差异(P<0.05)， 其中以诱导32 h实验组相差最为显著(表1)。 Western-blot检测结果，诱导8,24,32h各组均在近3万处出现一蛋白条带， 并且以诱导32 h实验组该带最为明显(图略)。
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图4 表达载体pMSG-ns3(克隆1)由SacⅠ
及HindⅢ双酶切鉴定
Fig 4 pMSG-ns3 (clone 1) digested with SacⅠ and HindⅢ
Lane 1:λ/HindⅢ marker; Lane 2: Clone 1 digested
with HindⅢ; Lane 3:Clone 1 digested with SacⅠ;
Lane 4:λ/EcoRⅠ+HindⅢ marker
表 1 表达载体pMSG-ns3在CHO细胞中诱导表达ELISA值
Tab 1 The results of ELISA that CHO cells was transfected by pMSG-ns3 and was induced by DM(n=3,
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Serial dilution
Negative
control
Treatment periods (t/h)
0
8
24
32
1∶ 16
0.08±0.02
0.18±0.01*
0.20±0.01*
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0.20±0.02*
0.22±0.01*
1∶ 32
0.04±0.02
0.19±0.02*
0.17±0.01*
0.18±0.01*
0.22±0.01*
1∶ 64
0.02±0.00
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0.14±0.02*
0.15±0.01*
0.14±0.01*
0.20±0.02*
1∶128
0.03±0.02
0.12±0.01*
0.15±0.00*
0.12±0.01*
0.16±0.01*
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1∶256
0.01±0.01
0.06±0.01*
0.09±0.03*
0.11±0.01*
0.07±0.01*
*P<0.05 vs negative control
3 讨 论
流行病学资料表明， HCV携带者已经超过世界总人口的1%以上， HCV 患者容易转化为慢性感染过程， 最终导致肝硬化， 甚至肝细胞癌[6]。 研究发现许多具有蛋白酶活性的病毒常常对宿主有直接损伤作用， 例如HIV编码的蛋白酶通过降解细胞骨架(细胞骨架参与维持形态、 促进细胞分裂外， 还参与信号传导及基因调控)， 可以引起细胞异常增殖而直接诱发癌症[7,8]。 NS3 蛋白也具有蛋白酶活性， 是否同样存在对宿主细胞骨架的病理损害， 而与HCV患者癌变率高有关是十分值得探讨的问题。
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本研究构建的诱导型表达载体pMSG-ns3中分别引入了翻译起始密码ATG及促进表达的Kozak顺序(-GCCATGG-) 。 在转染的另外几种细胞株实验中， 如Hela, SMMC-7721(人的肝癌细胞)， 发现诱导前后的ELISA结果无显著变化， 分析原因可能为: (1)上述两种细胞均来自人体细胞， 在蛋白表达量低的情况下， 细胞提取物中存在可与检测抗体结合的非特异成分， 从而造成背景增高， 干扰结果； (2)不同细胞中存在某些调控因子， 对同一表达载体中启动子的作用不同， 造成下游靶蛋白表达效率差异。 实验改用中国仓鼠卵巢CHO细胞作为转染宿主， 目的是避免与检测抗体同源而造成的非特异性干扰， 结果转染的CHO细胞经DM诱导后可成功地检测出NS3蛋白(本课题所克隆的ns3 基因长度为690 bp， 编码蛋白相对分子质量近3万)， 而且蛋白表达量随时间推移而稍有增加； 其中诱导前实验组未表达该蛋白(尽管其ELISA检测结果与转染前的阴性对照组相比P<0.05)， 因此判断表达蛋白的相对分子质量大小以及排除ELISA 检测系统中的影响因素, 需进一步作Western-blot分析。 上述实验通过对表达载体pMSG-ns3体外细胞诱导瞬时表达的研究， 为下一步筛选能永久表达NS3蛋白的细胞株提供了前提条件； 对研究NS3的生物学特性及建立转基因小鼠品系打下了基础。
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参 考 文 献
1 Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, et al. Isolation of a cDNA clone hepatitis genome. Science, 1989,244:359
2 戚中田, 潘 卫. 中国人丙型肝炎病毒基因组λgt11 cDNA库的免疫筛选与鉴定. 第二军医大学学报,1992,13(5):401
3 Tomei L, Failla C, Santolini E, et al. NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein. J Virol, 1993,67(7):4017
4 Takamizawa A, Mori C, Fuke I, et al. Structure and organization of the hepatitis C virus genome isolated from human carriers. J Virol, 1991, 65(3):1105
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5 Bartenschlager R, Ludwina AL, Mous J, et al. Nonstructural protein 3 of the hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions. J Virol, 1993,67(7):3835
6 Plageman PGW. Hepatitis C virus Brief Review. Arch Virol, 1991,120(3/4):165
7 Shoeman RL, Honer B, Mothes E, et al. Potential role of the viral protease in human immunodeficiency virus type 1 associated pathogenesis. Med Hypotheses, 1992,37(3):137
8 汪 宁. 细胞骨架刚性的调控与癌症的抑制. 见:李春海,郭亚军主编. 肿瘤分子生物学研究进展. 北京:军事医学科学出版社, 1996.53～56
(1998-03-12收稿, 1998-06-22修回)
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