阿霉素中毒性心肌细胞肌浆网摄钙功能变化
作者：张亚臣 荣烨之 吕宝经 赵美华 杨瑾文
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院心内科
关键词：
中华内科杂志980517 阿霉素对心肌的毒性作用一直是阿霉素临床应用的一大障碍，以往的研究表明，阿霉素中毒性心肌病变与心肌细胞内钙调控障碍密切相关。我们通过测定细胞内游离钙浓度、肌浆网钙摄取功能及肌浆网调钙蛋白基因表达的变化，进一步探索阿霉素心肌毒性的机制，为临床合理用药及防治中毒性心肌病提供理论根据。
一、材料与方法
1.试剂及仪器：45Ca-CaCl2由中国原子能研究所(北京)提供，Fura-2/AM、阿霉素为Sigma公司产品；F-3000型荧光分光光度计为日本日立公司生产，LS 3801型液体闪烁计数仪由美国Beckman公司生产；其余试剂及仪器均由上海复旦大学生化系实验室提供。肌浆网钙泵基因(SERCA2a)、Calsequestrin及Phospholamban(PLB)基因cDNA由加拿大多伦多大学赠送。
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2.体外心肌细胞培养及分组：取1～3天Wistar大鼠心室肌，用0.1%胰蛋白酶消化成单个细胞，贴壁培养1～2小时去除成纤维细胞后，再稀释成1×106个/ml的细胞悬液分装，于37℃密闭培养48小时。分组为：(1)正常对照组；(2)阿霉素组：加入阿霉素使其终浓度分别为0.5，1.0，2.0 mg/L；(3)维拉帕米+阿霉素组：先加入维拉帕米使其终浓度为40 mg/L，而后再加入阿霉素(终浓度为0.5，1.0，2.0 mg/L)。
3.细胞内游离钙：参照文献[1]方法测定。
4.肌浆网(SR)钙摄取功能测定：反应基质液为(mmol/L)：KCl 120，HEPES 20，NaN3 5.0，MgCl2 3.0，Na2-oralate 5.0，45 Ca2+ 0.05，pH 7.2。收集各组心肌细胞，超声破膜后，应用改良Jone LR法提取SR，用考马斯亮蓝G-250染色法测定肌浆网膜的蛋白浓度。将20 μg肌浆网蛋白质与基质液37℃孵育90秒钟后，加入终浓度为3.5 mmol/L的Na2-ATP启动肌浆网对45Ca2+的摄取反应，而后于不同时间加入4℃终止液(mmol/L：KCl 120，Tris 100，NaCl3 2.5，pH 7.2)，快速通过直径0.45 μm的微孔滤膜，用终止液冲洗清除未被肌浆网囊泡摄取的残余钙，加入闪烁液，液体闪烁计数仪测定滤膜的放射活性。
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5.RNA-DNA杂交：采用AGPC法抽提总RNA，参考分子克隆实验指南进行探针制备及斑点杂交，检测心肌SERCA2a、Calsequestrin、PLB mRNA的水平。
6.统计处理：实验数据以表示，两组间比较采用t检验。
二、结果
1.阿霉素对心肌细胞内游离钙浓度的影响：阿霉素作用心肌细胞10分钟时，心肌细胞内游离钙浓度轻度增加(P<0.05)，并且随着作用时间的延长，细胞内钙浓度逐渐增加，当阿霉素作用60分钟时，心肌细胞内游离钙浓度显著增高，与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)；维拉帕米组细胞内钙浓度则明显低于阿霉素组。
2.阿霉素对肌浆网45Ca2+摄取量的影响：在加入ATP的最初2分钟内，肌浆网的钙摄取量与时间成正比，反映了肌浆网摄钙的初速率，在8分钟左右，肌浆网的摄钙量基本达最大饱和。结果显示，阿霉素毒性心肌细胞肌浆网摄钙初速率及总摄钙量均明显下降，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。
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3.SERCA2a、PLB及Calsequestrin基因表达变化：斑点印迹结果显示，心肌细胞在发育过程中SERCA 2a基因表达水平逐渐增加(P<0.05)，PLB基因表达略有增加，而Calsequestrin基因无明显变化。在阿霉素毒性心肌细胞组，SERCA2a基因表达明显下降(P<0.01)，并随中毒程度的加深，下降越发明显；PLB基因表达轻度下降，而Calsequestrin基因无明显变化(P>0.05)。
讨论 小剂量阿霉素可一过性提高心肌细胞膜对钙的通透性，触发细胞内的肌浆网钙释放。本研究结果发现，阿霉素作用早期细胞内使钙浓度轻度增高，促进肌浆网的钙释放，但随着作用时间延长及剂量加大则抑制肌浆网的钙摄取，导致心肌细胞内钙离子明显过负荷。由此推测，小剂量阿霉素作用早期具有潜在的正性肌力作用，随着剂量及作用时间增加，最终导致细胞内钙离子过负荷。因而，肌浆网摄钙障碍可能是阿霉素中毒心肌病心肌细胞钙过负荷的又一机制。
本研究结果显示乳鼠心肌细胞的SERCA2a基因表达水平随着乳鼠心肌细胞的发育而逐渐增加，PLB基因表达水平有增加趋势，而肌集钙蛋白在整个发育过程中无明显变化，与既往观察结果一致[2]。在对中毒性心肌病细胞模型的研究中发现，SERCA2a基因表达水平随着中毒的加深而逐渐下降，PLB基因表达水平略有下降，而Calsequestrin mRNA水平无明显变化。这一结果与扩张型心肌病、肥厚型心肌病、先天性心脏病等病因所致的心衰研究结果相似[3]，可部分解释中毒心肌肌浆网摄钙功能下降及细胞内钙离子过负荷现象。有关基因表达调控的研究有待于进一步探索。
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参考文献
1 Malgaroli A, Milam D, Meldolesi J, et al. Fura-2 measerement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. J Cell Biol, 1987,105：2145-2155.
2 Lompre AM, Lambert F, Lakatta EG, et al. Expression of sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase and calsequestrin genes in rat heart during ontogenic development and aging. Circ Res, 1991,69：1380-1388.
3 Takahashi T, Allen PD, Izumo S. Expression of A-, B-, and C-type natriuretic peptide genes in failing and developing human ventricles. Circ Res, 1992,71：9-17.
(收稿：1997-10-15 修回：1998-01-04), 百拇医药
单位：200092 上海第二医科大学附属新华医院心内科
关键词：
中华内科杂志980517 阿霉素对心肌的毒性作用一直是阿霉素临床应用的一大障碍，以往的研究表明，阿霉素中毒性心肌病变与心肌细胞内钙调控障碍密切相关。我们通过测定细胞内游离钙浓度、肌浆网钙摄取功能及肌浆网调钙蛋白基因表达的变化，进一步探索阿霉素心肌毒性的机制，为临床合理用药及防治中毒性心肌病提供理论根据。
一、材料与方法
1.试剂及仪器：45Ca-CaCl2由中国原子能研究所(北京)提供，Fura-2/AM、阿霉素为Sigma公司产品；F-3000型荧光分光光度计为日本日立公司生产，LS 3801型液体闪烁计数仪由美国Beckman公司生产；其余试剂及仪器均由上海复旦大学生化系实验室提供。肌浆网钙泵基因(SERCA2a)、Calsequestrin及Phospholamban(PLB)基因cDNA由加拿大多伦多大学赠送。
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2.体外心肌细胞培养及分组：取1～3天Wistar大鼠心室肌，用0.1%胰蛋白酶消化成单个细胞，贴壁培养1～2小时去除成纤维细胞后，再稀释成1×106个/ml的细胞悬液分装，于37℃密闭培养48小时。分组为：(1)正常对照组；(2)阿霉素组：加入阿霉素使其终浓度分别为0.5，1.0，2.0 mg/L；(3)维拉帕米+阿霉素组：先加入维拉帕米使其终浓度为40 mg/L，而后再加入阿霉素(终浓度为0.5，1.0，2.0 mg/L)。
3.细胞内游离钙：参照文献[1]方法测定。
4.肌浆网(SR)钙摄取功能测定：反应基质液为(mmol/L)：KCl 120，HEPES 20，NaN3 5.0，MgCl2 3.0，Na2-oralate 5.0，45 Ca2+ 0.05，pH 7.2。收集各组心肌细胞，超声破膜后，应用改良Jone LR法提取SR，用考马斯亮蓝G-250染色法测定肌浆网膜的蛋白浓度。将20 μg肌浆网蛋白质与基质液37℃孵育90秒钟后，加入终浓度为3.5 mmol/L的Na2-ATP启动肌浆网对45Ca2+的摄取反应，而后于不同时间加入4℃终止液(mmol/L：KCl 120，Tris 100，NaCl3 2.5，pH 7.2)，快速通过直径0.45 μm的微孔滤膜，用终止液冲洗清除未被肌浆网囊泡摄取的残余钙，加入闪烁液，液体闪烁计数仪测定滤膜的放射活性。
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5.RNA-DNA杂交：采用AGPC法抽提总RNA，参考分子克隆实验指南进行探针制备及斑点杂交，检测心肌SERCA2a、Calsequestrin、PLB mRNA的水平。
6.统计处理：实验数据以表示，两组间比较采用t检验。
二、结果
1.阿霉素对心肌细胞内游离钙浓度的影响：阿霉素作用心肌细胞10分钟时，心肌细胞内游离钙浓度轻度增加(P<0.05)，并且随着作用时间的延长，细胞内钙浓度逐渐增加，当阿霉素作用60分钟时，心肌细胞内游离钙浓度显著增高，与对照组比较差异有非常显著性(P<0.01)；维拉帕米组细胞内钙浓度则明显低于阿霉素组。
2.阿霉素对肌浆网45Ca2+摄取量的影响：在加入ATP的最初2分钟内，肌浆网的钙摄取量与时间成正比，反映了肌浆网摄钙的初速率，在8分钟左右，肌浆网的摄钙量基本达最大饱和。结果显示，阿霉素毒性心肌细胞肌浆网摄钙初速率及总摄钙量均明显下降，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。
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3.SERCA2a、PLB及Calsequestrin基因表达变化：斑点印迹结果显示，心肌细胞在发育过程中SERCA 2a基因表达水平逐渐增加(P<0.05)，PLB基因表达略有增加，而Calsequestrin基因无明显变化。在阿霉素毒性心肌细胞组，SERCA2a基因表达明显下降(P<0.01)，并随中毒程度的加深，下降越发明显；PLB基因表达轻度下降，而Calsequestrin基因无明显变化(P>0.05)。
讨论 小剂量阿霉素可一过性提高心肌细胞膜对钙的通透性，触发细胞内的肌浆网钙释放。本研究结果发现，阿霉素作用早期细胞内使钙浓度轻度增高，促进肌浆网的钙释放，但随着作用时间延长及剂量加大则抑制肌浆网的钙摄取，导致心肌细胞内钙离子明显过负荷。由此推测，小剂量阿霉素作用早期具有潜在的正性肌力作用，随着剂量及作用时间增加，最终导致细胞内钙离子过负荷。因而，肌浆网摄钙障碍可能是阿霉素中毒心肌病心肌细胞钙过负荷的又一机制。
本研究结果显示乳鼠心肌细胞的SERCA2a基因表达水平随着乳鼠心肌细胞的发育而逐渐增加，PLB基因表达水平有增加趋势，而肌集钙蛋白在整个发育过程中无明显变化，与既往观察结果一致[2]。在对中毒性心肌病细胞模型的研究中发现，SERCA2a基因表达水平随着中毒的加深而逐渐下降，PLB基因表达水平略有下降，而Calsequestrin mRNA水平无明显变化。这一结果与扩张型心肌病、肥厚型心肌病、先天性心脏病等病因所致的心衰研究结果相似[3]，可部分解释中毒心肌肌浆网摄钙功能下降及细胞内钙离子过负荷现象。有关基因表达调控的研究有待于进一步探索。
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参考文献
1 Malgaroli A, Milam D, Meldolesi J, et al. Fura-2 measerement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. J Cell Biol, 1987,105：2145-2155.
2 Lompre AM, Lambert F, Lakatta EG, et al. Expression of sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase and calsequestrin genes in rat heart during ontogenic development and aging. Circ Res, 1991,69：1380-1388.
3 Takahashi T, Allen PD, Izumo S. Expression of A-, B-, and C-type natriuretic peptide genes in failing and developing human ventricles. Circ Res, 1992,71：9-17.
(收稿：1997-10-15 修回：1998-01-04), 百拇医药