新疆Kaposi肉瘤组织内人类8型疱疹病毒DNA的PCR检测
作者：普雄明 石得仁 沈大为
单位：830001 乌鲁木齐 新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科(普雄明 石得仁)；新疆医学院第一附属医院皮肤科(沈大为)
关键词：
中华皮肤科杂志980617 近年来人们在Kaposi肉瘤(KS)组织内发现一种新的疱疹病毒——人类8型疱疹病毒(HHV-8)，但国内目前尚未见到有关KS HHV-8的研究报道，因此我们对新疆KS组织进行了HHV-8 DNA的PCR检测，特报道如下。
一、材料和方法
材料：PCR扩增组织标本均为新疆维吾尔自治区医院皮肤科病理室存档蜡块，其中KS组织20块，银屑病组织16块，扁平苔藓组织10块，湿疹皮炎组织10块，尖锐湿疣组织10块，皮肤纤维瘤组织10块，正常皮肤组织10块。标本蜡块总量(含正常皮肤及几种非KS病理组织对照)共86块。每块组织切6μm厚薄片3～5张，放入离心管内，二甲苯脱蜡10分钟，无水乙醇洗脱2次，每次5分钟，双蒸水洗脱3次后备用。PCR引物的设计与合成参照Moore等[1]报道的引物序列，(5′TCCGTGTTGTCTACGTCCAG3′和5′AGCCGAAAGGATTCCACCAT3′)，由美国Cybersyn公司合成，PCR产物片段为233bp。
, http://www.100md.com
方法：1组织内DNA提取采用蛋白酶K消化法，消化液内蛋白酶K终浓度为300μg/ml，每例组织内加消化液100μl，37℃过夜后，95℃加热10分钟，灭活离心后取10μl上清液用于PCR扩增。2PCR扩增大致按Moore等[1]介绍的方法进行，取10μl处理后的模板上清液加入40μl PCR反应液中，40μl反应终体积含10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，2U Taq DNA聚合酶，dNTPs各20μmol/L，加引物Ⅰ(上游引物)和引物Ⅱ(下游引物)各2μmol/L。加入30μl石蜡油封闭后进行PCR循环， 应用PE-480型DNA扩增仪，94℃预变性300秒后，94℃ 60秒，58℃ 60秒，72℃ 90秒，共35个循环后72℃ 300秒延伸。取扩增产物15μl，在含0.5μg/ml溴乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳半小时(80V/cm)，根据扩增电泳带的长度，在紫外灯下参照核酸小分子量标准对照(上海复华实业生物医学工程公司生产)，最终产物为233bp，确定为阳性诊断。
, 百拇医药
二、结果
20例KS病理组织中14例HHV-8 DNA阳性(70%)，10例正常皮肤组织均为阴性，银屑病16例中1例、扁平苔藓10例中1例、纤维瘤10例中2例阳性。
三、讨论
1994年Chang等[1]首先从AIDS相关型KS患者皮损中发现了一种新的疱疹病毒DNA序列，即HHV-8。1995年， Moore等[2]根据Chang等的报道进一步对几种类型KS进行了HHV-8的PCR研究，结果均检出HHV-8 DNA，且阳性率极高，作者同时对这些阳性的PCR产物(KS330233)进行了DNA测序，结果显示三种类型KS的基因组序列均相同，而对照组几乎均为阴性，说明KS330233不是人类基因组部分，而是与外源性基因的插入有关，因此认为HHV-8对KS可能不仅是机会感染，而是KS的可能病因。但也有作者对HHV-8是否就是KS的病原持不同意见，如Rady等[3]曾报道在免疫抑制患者发生的各种不同皮肤肿瘤中检出233bp的产物，因此推测HHV-8可能是一种存在于免疫抑制患者增生性损害内的一种广泛播散的潜伏病毒。我们引用Moore等[2]报道的引物序列，对20例新疆KS患者瘤组织进行了PCR检测，结果14例KS患者瘤组织中检测到HHV-8 DNA，而正常皮肤和几种非KS皮肤病理组织中仅检出4例(6.1%)，说明新疆KS病理组织中存在着较高的HHV-8感染率，但并不是所有组织都能检出，新疆KS的检出率低于Moore等[2]的报道，同时在非KS病理组织中，特别是10例皮肤纤维瘤组织有2例阳性，而这2例患者并未用过任何免疫抑制剂，这一结果很难说明HHV-8感染是新疆KS发生的唯一病因或HHV-8感染仅发生于KS。目前有关HHV-8和KS发病关系的研究主要集中在是否HHV-8和其它疱疹病毒一样在健康人组织内就可能存在及感染HHV-8后都可以发生KS。如1996年有作者应用PCR方法在健康成人的前列腺组织和精液内查到HHV-8 DNA，并推测前列腺组织可能是HHV-8感染后的存留部位[4]，它提示感染HHV-8后并不一定都发生KS。综上我们认为新疆KS的发生无疑与HHV-8有关，但HHV-8不是唯一的病因，我们支持既往的观点，新疆KS的发生可能是遗传因素、种族因素、免疫受损和病毒感染等多种因素共同综合作用的结果[5]。
, http://www.100md.com
参考文献
1 Chang Y, Cesarman E, Pressin MS, et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi′s sarcoma. Science, 1994,266∶1865-1869.
2 Moore PS, Chang Y. Detection of herpesvirus-like DNA sequences in Kaposi′s sarcoma in patients with and those without HIV infection. N Engl J Med, 1995,332∶1181-1185.
3 Rady PL, Yen A, Rollefson JL, et al. Herpesvirus-like DNA sequences in non-Kaposi′s sarcoma skin lesion of fransplant patient. Lancet, 1995,345∶1043-1044.
4 Monini P, Lellis LD, Fabris M, et al. Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus DNA sequences in prostate tissue and human semen. N Engl J Med, 1996,334∶1168-1172.
5 普雄明, 石得仁, 沈大为. 新疆Kaposi肉瘤组织内巨细胞病毒抗原的检测报告. 临床皮肤科杂志, 1994,23∶74-75.
(收稿：1997-11-11 修回：1998-04-28), 百拇医药
单位：830001 乌鲁木齐 新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科(普雄明 石得仁)；新疆医学院第一附属医院皮肤科(沈大为)
关键词：
中华皮肤科杂志980617 近年来人们在Kaposi肉瘤(KS)组织内发现一种新的疱疹病毒——人类8型疱疹病毒(HHV-8)，但国内目前尚未见到有关KS HHV-8的研究报道，因此我们对新疆KS组织进行了HHV-8 DNA的PCR检测，特报道如下。
一、材料和方法
材料：PCR扩增组织标本均为新疆维吾尔自治区医院皮肤科病理室存档蜡块，其中KS组织20块，银屑病组织16块，扁平苔藓组织10块，湿疹皮炎组织10块，尖锐湿疣组织10块，皮肤纤维瘤组织10块，正常皮肤组织10块。标本蜡块总量(含正常皮肤及几种非KS病理组织对照)共86块。每块组织切6μm厚薄片3～5张，放入离心管内，二甲苯脱蜡10分钟，无水乙醇洗脱2次，每次5分钟，双蒸水洗脱3次后备用。PCR引物的设计与合成参照Moore等[1]报道的引物序列，(5′TCCGTGTTGTCTACGTCCAG3′和5′AGCCGAAAGGATTCCACCAT3′)，由美国Cybersyn公司合成，PCR产物片段为233bp。
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方法：1组织内DNA提取采用蛋白酶K消化法，消化液内蛋白酶K终浓度为300μg/ml，每例组织内加消化液100μl，37℃过夜后，95℃加热10分钟，灭活离心后取10μl上清液用于PCR扩增。2PCR扩增大致按Moore等[1]介绍的方法进行，取10μl处理后的模板上清液加入40μl PCR反应液中，40μl反应终体积含10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH9.0)，1.5mmol/L MgCl2，50mmol/L KCl，2U Taq DNA聚合酶，dNTPs各20μmol/L，加引物Ⅰ(上游引物)和引物Ⅱ(下游引物)各2μmol/L。加入30μl石蜡油封闭后进行PCR循环， 应用PE-480型DNA扩增仪，94℃预变性300秒后，94℃ 60秒，58℃ 60秒，72℃ 90秒，共35个循环后72℃ 300秒延伸。取扩增产物15μl，在含0.5μg/ml溴乙锭的2.5%琼脂糖凝胶中电泳半小时(80V/cm)，根据扩增电泳带的长度，在紫外灯下参照核酸小分子量标准对照(上海复华实业生物医学工程公司生产)，最终产物为233bp，确定为阳性诊断。
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二、结果
20例KS病理组织中14例HHV-8 DNA阳性(70%)，10例正常皮肤组织均为阴性，银屑病16例中1例、扁平苔藓10例中1例、纤维瘤10例中2例阳性。
三、讨论
1994年Chang等[1]首先从AIDS相关型KS患者皮损中发现了一种新的疱疹病毒DNA序列，即HHV-8。1995年， Moore等[2]根据Chang等的报道进一步对几种类型KS进行了HHV-8的PCR研究，结果均检出HHV-8 DNA，且阳性率极高，作者同时对这些阳性的PCR产物(KS330233)进行了DNA测序，结果显示三种类型KS的基因组序列均相同，而对照组几乎均为阴性，说明KS330233不是人类基因组部分，而是与外源性基因的插入有关，因此认为HHV-8对KS可能不仅是机会感染，而是KS的可能病因。但也有作者对HHV-8是否就是KS的病原持不同意见，如Rady等[3]曾报道在免疫抑制患者发生的各种不同皮肤肿瘤中检出233bp的产物，因此推测HHV-8可能是一种存在于免疫抑制患者增生性损害内的一种广泛播散的潜伏病毒。我们引用Moore等[2]报道的引物序列，对20例新疆KS患者瘤组织进行了PCR检测，结果14例KS患者瘤组织中检测到HHV-8 DNA，而正常皮肤和几种非KS皮肤病理组织中仅检出4例(6.1%)，说明新疆KS病理组织中存在着较高的HHV-8感染率，但并不是所有组织都能检出，新疆KS的检出率低于Moore等[2]的报道，同时在非KS病理组织中，特别是10例皮肤纤维瘤组织有2例阳性，而这2例患者并未用过任何免疫抑制剂，这一结果很难说明HHV-8感染是新疆KS发生的唯一病因或HHV-8感染仅发生于KS。目前有关HHV-8和KS发病关系的研究主要集中在是否HHV-8和其它疱疹病毒一样在健康人组织内就可能存在及感染HHV-8后都可以发生KS。如1996年有作者应用PCR方法在健康成人的前列腺组织和精液内查到HHV-8 DNA，并推测前列腺组织可能是HHV-8感染后的存留部位[4]，它提示感染HHV-8后并不一定都发生KS。综上我们认为新疆KS的发生无疑与HHV-8有关，但HHV-8不是唯一的病因，我们支持既往的观点，新疆KS的发生可能是遗传因素、种族因素、免疫受损和病毒感染等多种因素共同综合作用的结果[5]。
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参考文献
1 Chang Y, Cesarman E, Pressin MS, et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi′s sarcoma. Science, 1994,266∶1865-1869.
2 Moore PS, Chang Y. Detection of herpesvirus-like DNA sequences in Kaposi′s sarcoma in patients with and those without HIV infection. N Engl J Med, 1995,332∶1181-1185.
3 Rady PL, Yen A, Rollefson JL, et al. Herpesvirus-like DNA sequences in non-Kaposi′s sarcoma skin lesion of fransplant patient. Lancet, 1995,345∶1043-1044.
4 Monini P, Lellis LD, Fabris M, et al. Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus DNA sequences in prostate tissue and human semen. N Engl J Med, 1996,334∶1168-1172.
5 普雄明, 石得仁, 沈大为. 新疆Kaposi肉瘤组织内巨细胞病毒抗原的检测报告. 临床皮肤科杂志, 1994,23∶74-75.
(收稿：1997-11-11 修回：1998-04-28), 百拇医药