丙种球蛋白防治川崎病并发冠状动脉病变的机理探讨
作者：王宏伟 程佩萱 王华
单位：
关键词：粘膜皮肤淋巴结综合征；丙种球蛋白类；血小板源生长因子；脱噬作用
中华儿科杂志/980610 【摘要】 目的 观察丙种球蛋白对川崎病患儿血清诱导人单核细胞表达血小板源生长因子(PDGF)B链蛋白(PDGF-B)的影响；观察丙种球蛋白作用后的单核细胞条件培养基(MCM)对内皮细胞凋亡的影响。方法 应用免疫细胞化学和流式细胞术方法。结果 川崎病患儿血清能强烈诱导单核细胞表达PDGF-B，川崎病患儿血清作用后的MCM则能显著促进内皮细胞凋亡。川崎病患儿血清的上述作用能够被丙种球蛋白和丙种球蛋白作用后的MCM所抑制。结论 单核细胞表达PDGF增多及单核细胞介导的内皮细胞凋亡，可能参与了川崎病患儿冠状动脉并发症的形成；丙种球蛋白防治川崎病患儿冠状动脉并发症的机理，可能与抑制单核细胞表达PDGF和减少内皮细胞凋亡有关。
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Inhibition of PDGF expression in monocyte and apoptosis of endothelial cells by γ-globulin in children with Kawasaki disease
Wang Hongwei, Cheng Peixuan，Wang Hua.
Department of pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To examine the effects of γ-globulin on platelet-derived growth factor B chain protein (PDGF-B) expresion in monocyte and on apoptosis of endothelial cells induced by monocyte conditioned media (MCM) treated with serum from cases of Kawasaki disease. Methods The immunocytochemical and flow cytometry were used. Results The serum from children with Kawasaki disease significantly induced the expression of PDGF-B in monocyte. Apoptosis of endothelial cells were markedly promoted by the MCM. The effects of serum from cases of Kawasaki disease were inhibited by γ-globulin as well as by the MCM treaed with γ-globulin.Conclusion The increase in PDGF-B expression in monocyte and apoptosis of endothelial cells indiated by monocyte may take part in the coronary artery complication of Kawaski disease; the inhibitory effects of γ-globulin on PDGF expression in monocyte and on apoptosis of endothelial cells may be involved in the mechanism by which γ-globulin prvents against coronary artery complication of Kawasaki disease.
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【Key words】 Apoptosis Platelet-derived growth factor Mucocutaneous lymph node syndrome Apoptosis Gamma globulins
我们应用细胞学方法观察川崎病急性期患儿血清对体外培养人单核细胞表达血小板源生长因子(platelet-derivde growth factor,PDGF)B链蛋白(PDGF-B)的影响及丙种球蛋白作用后的单核细胞条件培养基(monocyte conditioned media,MCM)对内皮细胞凋亡的影响，并观察丙种球蛋白对上述过程的作用，以期探讨丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的可能机理。
材料和方法
一、试剂来源
PDGF单克隆抗体由日本Mochida制药有限公司Sugihara博士惠赠。LSAB法免疫细胞化学试剂盒购自Zymed公司。 丙种球蛋白为卫生部成都生物制品研究所产品。人脐静脉内皮细胞(ECV304),购自武汉大学生物系。
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二、川崎病患儿血清的制备
取3例川崎病急性期患儿和3例正常儿童静脉血各4 ml,常规方法分离血清,置-40℃冻存。实验前将血清溶化,分组合并,微孔滤器除菌。
三、人单核细胞培养及分组
按文献方法分离人血单核细胞并原代培养[1]。按以下设计分组:(1)正常血清组：RPMI-1640培养基+10%正常血清;(2)川崎病血清组：RPMI-1640+10%川崎病血清;(3)丙种球蛋白+川崎病血清组：RPMI-1640+10%川崎病血清+丙种球蛋白4 mg/ml。培养24小时,弃去各组培养基，PBS洗涤,各组分别加入RPMI-1640培养基继续培养24小时,收集各组MCM备用。加冷丙酮固定10分钟,取出盖玻片,置-20℃保存。
四、免疫细胞化学染色
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按LSAB试剂盒操作说明进行单核细胞免疫细胞化学染色。PDGF-B单克隆抗体工作浓度为1∶500。用TJTV-300型自动图像分析仪测定各组PDGF-B 表达强度的平均吸光度A(曾称光密度OD)值。
五、内皮细胞培养
复苏ECV-304内皮细胞株, 按文献方法进行传代培养[2]。当第3代内皮细胞生长达亚融合时弃去培养基，加入无血清培养基RPMI-1640培养24小时，再弃去培养基,分为正常血清-MCM组、川崎病血清-MCM组和丙种球蛋白+川崎病血清-MCM组。在各组细胞培养瓶内,分别加入上述正常血清组MCM、川崎病血清组MCM和丙种球蛋白+川崎病血清组MCM，继续培养10小时，收集细胞，用70%乙醇固定，用于流式细胞分析。
六、流式细胞术检测内皮细胞凋亡[3]
调整各组内皮细胞密度为106/ml，用碘化丙啶染色，应用流式细胞仪(DGS-800,美国)测定各组内皮细胞的凋亡率。
, 百拇医药
结果
免疫细胞化学染色显示,各组体外培养的人单核细胞PDGF-B染色均呈阳性。 阳性信号为棕黄色细密颗粒。正常血清组PDGF-B表达较弱;川崎病血清组PDGF-B 表达明显增强;丙种球蛋白组与川崎病血清组比较,PDGF-B表达则显著受到抑制。
各组单核细胞PDGF-B表达强度的平均吸光度值见表1。
丙种球蛋白+川崎病血清组与正常血清组比较仍略高，t=2.33，P<0.05。
表1 各组单核细胞表达PDGF-B的吸光度A值(±s) 组 别
细胞数
PDGF-B
与川崎病血
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清组比较t值
正常血清组
川崎病血清组
丙种球蛋白+
川崎病血清组
30
30
30
0.187±0.021
0.301±0.018
0.199±0.020
24.061*
, 百拇医药
24.061*
* P<0.01 流式细胞仪检测显示，川崎病患儿血清可诱导内皮细胞凋亡，增加凋亡发生率；同时加入丙种球蛋白，则可抑制内皮细胞凋亡，减少凋亡发生率(表2)。表2 各组内皮细胞凋亡的流式细胞术检测结果 组 别
细胞数
凋亡发生率
(%)
与川崎病血清
组比较u值
正常血清-MCM组
川崎病血清-MCM组
丙种球蛋白+川崎病
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血清-MCM组
10 000
10 000
10 000
1.22
4.56
1.67
14.10*
11.76*
* P<0.01；丙种球蛋白+川崎病血清-MeM组凋亡发生率仍略高于正常组，u=2.71，P<0.01
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讨论
免疫系统活化及广泛的血管炎是川崎病的两大主要特征。未知致病因子所介导的血管壁免疫损伤，引起过度的炎症性纤维增生反应，是导致冠状动脉内膜增厚、管腔狭窄的病理基础。作为免疫递呈细胞的单核巨噬细胞，在免疫系统活化过程中起重要作用。已有学者研究表明，在川崎病患儿的急性期，其末梢血单核细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1 )明显增多[4]。这些炎性介质与血管内皮损伤密切相关。PDGF在血管损伤分子调节中居中心地位[5] 。本研究表明，川崎病急性期患儿的血清能够强烈诱导人外周血单核细胞表达PDGF-B。因此认为，单核细胞表达PDGF，可能是其介导川崎病血管免疫损伤，继之引起动脉管腔瘢痕狭窄的主要机制之一。
细胞凋亡是细胞死亡的主要形式之一。川崎病血管炎病理中，首先是内皮损伤死亡，血管屏障遭受破坏，血液中的免疫细胞和免疫介质才能弥散到血管壁，引起血管壁免疫炎性损伤，导致受损血管壁水肿、坏死、弹力纤维断裂、动脉瘤形成及血管壁的狭窄增生性反应。本研究证明，川崎病血清作用后的MCM 能够促进血管内皮细胞凋亡，增加凋亡发生率。故认为内皮细胞凋亡可能是川崎病血管炎致动脉狭窄、闭塞的主要病理基础；而内皮细胞凋亡与川崎病患儿血循环中单核细胞释放的细胞因子(包括PDGF)可能有关。
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本研究发现，丙种球蛋白能够显著抑制川崎病患儿血清所诱导的单核细胞表达PDGF-B，并且丙种球蛋白与川崎病血清共同作用后的MCM，亦能够减少内皮细胞的凋亡发生率。因此表明，丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的机理可能与抑制单核细胞表达PDGF和减少内皮细胞凋亡有关。
参考文献
1 阮秋蓉，邓仲端，徐增绶，等. 培养人静脉内皮细胞产生单核细胞趋化因子的观察. 中华病理学杂志，1991, 20:205-208.
2 熊一力,赵华月,付良武,等.穿心莲成分API0134 和阿司匹林对内皮细胞抗血栓功 能的影响.中华血液学杂志,1993, 14:530-533.
3 Li X, Gong J, Feldman E, et al. Apoptotic cell death during treatment of leukemias. Leukemia and Lymphoma, 1994, 13:55-58.
4 Furukawa S, Mafsubara T, Umezawa, et al. Serum levels of P60 soluble tumor necrosis factor receptor during acute kawasaki disease. J Pediatra, 1994, 124:721-725.
5 Schoff Rj, Morrow LA. Growth factors and angiogenesis. Cardiovascular Research, 1993, 27:1155-1161., 百拇医药
单位：
关键词：粘膜皮肤淋巴结综合征；丙种球蛋白类；血小板源生长因子；脱噬作用
中华儿科杂志/980610 【摘要】 目的 观察丙种球蛋白对川崎病患儿血清诱导人单核细胞表达血小板源生长因子(PDGF)B链蛋白(PDGF-B)的影响；观察丙种球蛋白作用后的单核细胞条件培养基(MCM)对内皮细胞凋亡的影响。方法 应用免疫细胞化学和流式细胞术方法。结果 川崎病患儿血清能强烈诱导单核细胞表达PDGF-B，川崎病患儿血清作用后的MCM则能显著促进内皮细胞凋亡。川崎病患儿血清的上述作用能够被丙种球蛋白和丙种球蛋白作用后的MCM所抑制。结论 单核细胞表达PDGF增多及单核细胞介导的内皮细胞凋亡，可能参与了川崎病患儿冠状动脉并发症的形成；丙种球蛋白防治川崎病患儿冠状动脉并发症的机理，可能与抑制单核细胞表达PDGF和减少内皮细胞凋亡有关。
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Inhibition of PDGF expression in monocyte and apoptosis of endothelial cells by γ-globulin in children with Kawasaki disease
Wang Hongwei, Cheng Peixuan，Wang Hua.
Department of pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
【Abstract】 Objective To examine the effects of γ-globulin on platelet-derived growth factor B chain protein (PDGF-B) expresion in monocyte and on apoptosis of endothelial cells induced by monocyte conditioned media (MCM) treated with serum from cases of Kawasaki disease. Methods The immunocytochemical and flow cytometry were used. Results The serum from children with Kawasaki disease significantly induced the expression of PDGF-B in monocyte. Apoptosis of endothelial cells were markedly promoted by the MCM. The effects of serum from cases of Kawasaki disease were inhibited by γ-globulin as well as by the MCM treaed with γ-globulin.Conclusion The increase in PDGF-B expression in monocyte and apoptosis of endothelial cells indiated by monocyte may take part in the coronary artery complication of Kawaski disease; the inhibitory effects of γ-globulin on PDGF expression in monocyte and on apoptosis of endothelial cells may be involved in the mechanism by which γ-globulin prvents against coronary artery complication of Kawasaki disease.
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【Key words】 Apoptosis Platelet-derived growth factor Mucocutaneous lymph node syndrome Apoptosis Gamma globulins
我们应用细胞学方法观察川崎病急性期患儿血清对体外培养人单核细胞表达血小板源生长因子(platelet-derivde growth factor,PDGF)B链蛋白(PDGF-B)的影响及丙种球蛋白作用后的单核细胞条件培养基(monocyte conditioned media,MCM)对内皮细胞凋亡的影响，并观察丙种球蛋白对上述过程的作用，以期探讨丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的可能机理。
材料和方法
一、试剂来源
PDGF单克隆抗体由日本Mochida制药有限公司Sugihara博士惠赠。LSAB法免疫细胞化学试剂盒购自Zymed公司。 丙种球蛋白为卫生部成都生物制品研究所产品。人脐静脉内皮细胞(ECV304),购自武汉大学生物系。
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二、川崎病患儿血清的制备
取3例川崎病急性期患儿和3例正常儿童静脉血各4 ml,常规方法分离血清,置-40℃冻存。实验前将血清溶化,分组合并,微孔滤器除菌。
三、人单核细胞培养及分组
按文献方法分离人血单核细胞并原代培养[1]。按以下设计分组:(1)正常血清组：RPMI-1640培养基+10%正常血清;(2)川崎病血清组：RPMI-1640+10%川崎病血清;(3)丙种球蛋白+川崎病血清组：RPMI-1640+10%川崎病血清+丙种球蛋白4 mg/ml。培养24小时,弃去各组培养基，PBS洗涤,各组分别加入RPMI-1640培养基继续培养24小时,收集各组MCM备用。加冷丙酮固定10分钟,取出盖玻片,置-20℃保存。
四、免疫细胞化学染色
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按LSAB试剂盒操作说明进行单核细胞免疫细胞化学染色。PDGF-B单克隆抗体工作浓度为1∶500。用TJTV-300型自动图像分析仪测定各组PDGF-B 表达强度的平均吸光度A(曾称光密度OD)值。
五、内皮细胞培养
复苏ECV-304内皮细胞株, 按文献方法进行传代培养[2]。当第3代内皮细胞生长达亚融合时弃去培养基，加入无血清培养基RPMI-1640培养24小时，再弃去培养基,分为正常血清-MCM组、川崎病血清-MCM组和丙种球蛋白+川崎病血清-MCM组。在各组细胞培养瓶内,分别加入上述正常血清组MCM、川崎病血清组MCM和丙种球蛋白+川崎病血清组MCM，继续培养10小时，收集细胞，用70%乙醇固定，用于流式细胞分析。
六、流式细胞术检测内皮细胞凋亡[3]
调整各组内皮细胞密度为106/ml，用碘化丙啶染色，应用流式细胞仪(DGS-800,美国)测定各组内皮细胞的凋亡率。
, 百拇医药
结果
免疫细胞化学染色显示,各组体外培养的人单核细胞PDGF-B染色均呈阳性。 阳性信号为棕黄色细密颗粒。正常血清组PDGF-B表达较弱;川崎病血清组PDGF-B 表达明显增强;丙种球蛋白组与川崎病血清组比较,PDGF-B表达则显著受到抑制。
各组单核细胞PDGF-B表达强度的平均吸光度值见表1。
丙种球蛋白+川崎病血清组与正常血清组比较仍略高，t=2.33，P<0.05。
表1 各组单核细胞表达PDGF-B的吸光度A值(±s) 组 别
细胞数
PDGF-B
与川崎病血
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清组比较t值
正常血清组
川崎病血清组
丙种球蛋白+
川崎病血清组
30
30
30
0.187±0.021
0.301±0.018
0.199±0.020
24.061*
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24.061*
* P<0.01 流式细胞仪检测显示，川崎病患儿血清可诱导内皮细胞凋亡，增加凋亡发生率；同时加入丙种球蛋白，则可抑制内皮细胞凋亡，减少凋亡发生率(表2)。表2 各组内皮细胞凋亡的流式细胞术检测结果 组 别
细胞数
凋亡发生率
(%)
与川崎病血清
组比较u值
正常血清-MCM组
川崎病血清-MCM组
丙种球蛋白+川崎病
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血清-MCM组
10 000
10 000
10 000
1.22
4.56
1.67
14.10*
11.76*
* P<0.01；丙种球蛋白+川崎病血清-MeM组凋亡发生率仍略高于正常组，u=2.71，P<0.01
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讨论
免疫系统活化及广泛的血管炎是川崎病的两大主要特征。未知致病因子所介导的血管壁免疫损伤，引起过度的炎症性纤维增生反应，是导致冠状动脉内膜增厚、管腔狭窄的病理基础。作为免疫递呈细胞的单核巨噬细胞，在免疫系统活化过程中起重要作用。已有学者研究表明，在川崎病患儿的急性期，其末梢血单核细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1 )明显增多[4]。这些炎性介质与血管内皮损伤密切相关。PDGF在血管损伤分子调节中居中心地位[5] 。本研究表明，川崎病急性期患儿的血清能够强烈诱导人外周血单核细胞表达PDGF-B。因此认为，单核细胞表达PDGF，可能是其介导川崎病血管免疫损伤，继之引起动脉管腔瘢痕狭窄的主要机制之一。
细胞凋亡是细胞死亡的主要形式之一。川崎病血管炎病理中，首先是内皮损伤死亡，血管屏障遭受破坏，血液中的免疫细胞和免疫介质才能弥散到血管壁，引起血管壁免疫炎性损伤，导致受损血管壁水肿、坏死、弹力纤维断裂、动脉瘤形成及血管壁的狭窄增生性反应。本研究证明，川崎病血清作用后的MCM 能够促进血管内皮细胞凋亡，增加凋亡发生率。故认为内皮细胞凋亡可能是川崎病血管炎致动脉狭窄、闭塞的主要病理基础；而内皮细胞凋亡与川崎病患儿血循环中单核细胞释放的细胞因子(包括PDGF)可能有关。
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本研究发现，丙种球蛋白能够显著抑制川崎病患儿血清所诱导的单核细胞表达PDGF-B，并且丙种球蛋白与川崎病血清共同作用后的MCM，亦能够减少内皮细胞的凋亡发生率。因此表明，丙种球蛋白防治川崎病冠状动脉并发症的机理可能与抑制单核细胞表达PDGF和减少内皮细胞凋亡有关。
参考文献
1 阮秋蓉，邓仲端，徐增绶，等. 培养人静脉内皮细胞产生单核细胞趋化因子的观察. 中华病理学杂志，1991, 20:205-208.
2 熊一力,赵华月,付良武,等.穿心莲成分API0134 和阿司匹林对内皮细胞抗血栓功 能的影响.中华血液学杂志,1993, 14:530-533.
3 Li X, Gong J, Feldman E, et al. Apoptotic cell death during treatment of leukemias. Leukemia and Lymphoma, 1994, 13:55-58.
4 Furukawa S, Mafsubara T, Umezawa, et al. Serum levels of P60 soluble tumor necrosis factor receptor during acute kawasaki disease. J Pediatra, 1994, 124:721-725.
5 Schoff Rj, Morrow LA. Growth factors and angiogenesis. Cardiovascular Research, 1993, 27:1155-1161., 百拇医药