抗血管内皮生长因子165抗体轻重链可变区基因的克隆与序列分析
作者：冉宇靓 杨治华 王贵齐 董志伟
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所， 北京 100021
关键词：血管内皮生长因子165；可变区基因；RT-聚合酶链反应；核苷酸序列分析
摘要 目的 获得抗血管内皮生长因子165 摘要 目的 获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)抗体的轻重链可变区基因。方法 从分泌具有中和抗血管内皮生长因子165活性的单抗杂交瘤细胞株VmD11中提取总RNA，经RT-PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析。结果 抗体的轻链可变区基因321 bp，属于小鼠第Ⅴ亚群；重链可变区基因354 bp,属于小鼠第Ⅱ(B)亚群。结论 所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因。
中图号 Q58
, 百拇医药
血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管形成因子，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能[1，2]，在肿瘤的发展和转移、创伤愈合、胚胎期血管形成等[3]方面均起着重要的作用。VEGF在体内存在4种形式：VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206[4]，其中最重要的是VEGF165。本室制备的抗人VEGF165单抗VmD11,能与VEGF165结合。体内促血管渗漏试验和促鸡胚尿囊膜血管形成试验结果均显示，该单抗可完全阻断VEGF165增加血管通透性的活性并可部分阻断其促鸡胚尿囊膜血管形成的活性。抑制肿瘤转移的动物实验表明，该单抗抑制肿瘤转移率达70.2%[5]。这些资料表明，VmD11单抗在治疗肿瘤转移中具有重要的应用前景。本室采用基因工程抗体技术开展单抗VmD11的人源化抗体研究，以期使其更适用于临床治疗。为此，首先克隆抗VEGF165单抗VmD11的轻、重链可变区基因，并作核苷酸序列分析，为VmD11的人源化基因工程抗体研究完成了关键性的第一步。
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1 材料和方法
质粒、菌种、细胞株和引物 含有一个抗体重链可变区基因的质粒pRUWH和含有一个抗体轻链可变区基因的质粒pRGWL由本室构建。 大肠杆菌菌株DH5α为本室保存。杂交瘤细胞株VmD11由本室研制。 选用Winter等[6]设计，合成的扩增轻重链可变区基因的引物如下：轻链5′端引物5′-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3′，轻链3′端引物5′-GTTA-GATCTCCAGCTTGGTCCC-3′；重链5′端引物 5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′ (S=C/G,M=A/C,R=A/G,W=A/T)，重链3′端引物5′-TGAGGAGACGGTGACCGT-GGTCCCTTGGCCCCAG-3′(中国科学院微生物研究所合成)。
细胞总RNA的提取 收集杂交瘤细胞株VmD11细胞，采用一步法提取总RNA，按TRIzolTM试剂(Gibco BRL公司)说明书进行。提取的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳定量。
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cDNA第一条链的合成 以10 μg总RNA为模板，采用轻、重链的3′端引物，按M-MLV反转录酶(Gibco BRL公司)说明书进行。
PCR反应 以cDNA第一条链为模板，50 μl的反应体积内含有以下成分：5 μl模板，各25 pmol轻链或重链可变区的5′及3′端引物，200 μmol/L的dNTP，5 μl的10×反应缓冲液，2.5 U的Taq DNA聚合酶(华美公司)。反应条件：93℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30次循环。扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
可变区基因的克隆 以限制性内切酶PstⅠ和BstEⅡ(内切酶均为Boehringer Mennheim公司产品)对质粒pRUWH及重链扩增产物进行完全酶解，以PvuⅡ和BglⅡ对质粒pRGWL及轻链扩增产物进行完全酶解。采用Glass Milk法回收相应片段。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mennheim公司)分别连接重链片段和pRUWH、轻链片段和pRGWL,并转化经CaCl2处理处于感受态的DH5α菌。采用含80 μg/ml 氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选转化菌，在对克隆进行质粒小量快提后分别加以酶切鉴定。
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核苷酸序列测定 采用荧光标记双脱氧末端链终止法，使用载体克隆位点两端的测序引物，按DyeDeoxyTM Terminator DNA测序试剂盒(Perkin Elmer公司)说明书进行。
2 结果
VmD11单抗轻重链可变区基因的扩增和鉴定 以从杂交瘤株VmD11合成的cDNA第一条链为模板，经30个PCR循环，轻链引物扩增出320 bp左右的片段，重链引物扩增出360 bp左右的片段，未加模板的空白对照无扩增带。此结果与一般抗体轻重链可变区基因的大小相符。
VmD11单抗轻重链可变区基因的克隆和鉴定 将VmD11单抗的轻重链可变区基因分别克隆入载体pRGWL和pRUWH。轻链共得50个转化菌落，随机挑取4个克隆进行EcoRⅠ、 HindⅢ单酶切及PvuⅡ、BglⅡ双酶切鉴定，其中3个克隆为重组克隆。重链共得189个转化菌落，随机挑取4个克隆进行HindⅢ、Sau3AⅠ单酶切及PstⅠ、BstEⅡ双酶切鉴定，其中3个克隆为重组克隆。
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VmD11单抗轻重链可变区基因核苷酸序列 采用荧光标记Sanger双脱氧末端终止法对2个轻链可变区基因的重组克隆和2个重链可变区基因的重组克隆进行核苷酸序列测定。结果2个轻链可变区基因的重组克隆的序列完全相同(图1)。2个重链可变区基因的重组克隆的序列仅在第21位核苷酸有所不同，但不影响其氨基酸序列的一致(图2)。
图 1 VmD11 Vκ基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Fig 1 The nucleotide sequence of VmD11 Vκ gene and its amino acid sequence
The complementarity-determining regions (CDRs) are indicated with lines
图 2 VmD11 VH 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
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Fig 2 The nucleotide sequence of VmD11 VH gene and its amino acid sequence
R=A or T. The complementarity-determining regions (CDRs) are indicated with lines
3 讨论
从杂交瘤中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出单抗的可变区基因，克隆入质粒载体中进行测序并确定可变区基因的亚群已成为获得单抗可变区基因的一条通用、快速、有效的方法。为此已根据鼠单抗可变区基因两侧的序列设计出了多种PCR扩增引物。虽然并非每一种引物均适用于所有的单抗，但在绝大多数情况下，只要选用合适的引物，总能扩增出单抗的可变区基因。
VEGF是一种促血管形成的内皮细胞特异的生长因子，已有大量证据表明它在肿瘤的发展、转移中起着重要的作用[7]。近年来许多研究均显示具有中和活性的VEGF抗体可在动物体内抑制原发瘤的生长并抑制转移灶的形成和生长[8]，具有潜在的临床治疗肿瘤的应用价值。
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本室研制的VEGF165鼠单抗VmD11具有中和VEGF165的活性，属小鼠IgG2a亚类[5]，在动物体内实验中显示出一定的抑制原发瘤生长及转移灶形成和生长的能力。故而笔者根据VmD11的IgG亚类选用相应的引物，以RT-PCR的方法扩增并克隆VmD11的轻、重链可变区基因，并进行核苷酸序列分析。轻链可变区基因推导出氨基酸序列后与小鼠κ轻链可变区亚群共有序列[9]比较，确定其属于第Ⅴ亚群，氨基酸序列同源性达72.9%，并确定该重链可变区基因属于VJκ5重排。重链可变区基因推导出氨基酸序列后与小鼠重链可变区亚群的共有序列[9]比较，确定其属于第Ⅱ(B)亚群，氨基酸序列同源性达80.5%，并确定该重链可变区基因属于VDJH2重排，其中D片段为小鼠的DSP2.7。
进一步将VmD11应用于临床治疗肿瘤，必须克服鼠单抗在人体内引起的人抗鼠抗体(HAMA)反应，为此已开展了VmD11人源化基因工程抗体的研究。VmD11的轻、重链可变区基因的克隆和测序为此项研究奠定了必要的基础。
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参 考 文 献
1 Keck PJ, Hauser SD, Krivi G,et al. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science, 1989, 246:1309～1311
2 Leung DW, Cachiances G, Kuang WJ, et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science, 1989, 246:1306～1309
3 Breler G, Albrecht U, Sterrer S, et al. Expression of vascular endothelial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell differentiation. Development, 1992, 114:521～526
, 百拇医药
4 Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991, 266:26031～26038
5 杨治华，石瑜琳，冉宇靓，等.抗人VEGF单抗的研制及对肿瘤生长及转移的抑制作用.中华微生物免疫学杂志，1998， 待发表
6 Orlandi R, Gssow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3833～3839
, http://www.100md.com
7 Hlatky L, Tsionou C, Hahnfeldt P, et al. Mammary fibroblast may influence breast tumor angiogenesis via hypoxia-induced vascular endothelial growth factor up-regulation and protein expression. Cancer Res, 1994, 54:6038～6042
8 Asano M, Yukita A, Matsumoto T, et al. Inhibition of tumor growth and metastasis by an immunoneutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor 121. Cancer Res, 1995, 55:5296～5302
, http://www.100md.com
9 Kabat EA, Wu TT, Reid-Miler M, et al. Sequences of proteins of immunological interest. 4th ed. Washington DC: US Dept Health and Human Services, US Government Printing offices, 1991. 78～239
Cloning and Sequencing of the VL and VH Genes from the Anti-vascular Endothelial Growth Factor McAb Hybridoma Cell Line
Ran Yuliang Yang Zhihua Wang Guiqi Dong Zhiwei
(Cancer Institute, CAMS and PUMC, Beijing 100021)
, 百拇医药
Objective The light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) genes from the anti-VEGF165 McAb hybridoma cell line were cloned for construction of it′s chimeric antibody. Methods The VL and VH genes were amplified from the total RNA of the VmD11 hybridoma with RT-PCR and cloned into vectors, and then analyzed by sequencing. Results The 320 bp VL gene belong to mouse kappa light chain subgroup V, the 354 bp VH gene belong to mouse heavy chains subgroup Ⅱ(B). Conclusions The nucleotide sequence analysis indicated that the cloned genes coded the light and heavy chain variable region of mouse respectively.
Key words vascular endothelial growth factor 165; variable region genes; polymerase chain reaction; nucleotide sequence analyses
(1998-03-12 收稿), 百拇医药
单位：中国医学科学院 中国协和医科大学 肿瘤研究所， 北京 100021
关键词：血管内皮生长因子165；可变区基因；RT-聚合酶链反应；核苷酸序列分析
摘要 目的 获得抗血管内皮生长因子165 摘要 目的 获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)抗体的轻重链可变区基因。方法 从分泌具有中和抗血管内皮生长因子165活性的单抗杂交瘤细胞株VmD11中提取总RNA，经RT-PCR扩增并克隆该单抗的轻、重链可变区基因并进行序列分析。结果 抗体的轻链可变区基因321 bp，属于小鼠第Ⅴ亚群；重链可变区基因354 bp,属于小鼠第Ⅱ(B)亚群。结论 所克隆的基因经核苷酸序列分析分别为抗体的轻、重链可变区基因。
中图号 Q58
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血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管形成因子，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能[1，2]，在肿瘤的发展和转移、创伤愈合、胚胎期血管形成等[3]方面均起着重要的作用。VEGF在体内存在4种形式：VEGF121、VEGF165、VEGF189和VEGF206[4]，其中最重要的是VEGF165。本室制备的抗人VEGF165单抗VmD11,能与VEGF165结合。体内促血管渗漏试验和促鸡胚尿囊膜血管形成试验结果均显示，该单抗可完全阻断VEGF165增加血管通透性的活性并可部分阻断其促鸡胚尿囊膜血管形成的活性。抑制肿瘤转移的动物实验表明，该单抗抑制肿瘤转移率达70.2%[5]。这些资料表明，VmD11单抗在治疗肿瘤转移中具有重要的应用前景。本室采用基因工程抗体技术开展单抗VmD11的人源化抗体研究，以期使其更适用于临床治疗。为此，首先克隆抗VEGF165单抗VmD11的轻、重链可变区基因，并作核苷酸序列分析，为VmD11的人源化基因工程抗体研究完成了关键性的第一步。
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1 材料和方法
质粒、菌种、细胞株和引物 含有一个抗体重链可变区基因的质粒pRUWH和含有一个抗体轻链可变区基因的质粒pRGWL由本室构建。 大肠杆菌菌株DH5α为本室保存。杂交瘤细胞株VmD11由本室研制。 选用Winter等[6]设计，合成的扩增轻重链可变区基因的引物如下：轻链5′端引物5′-GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA-3′，轻链3′端引物5′-GTTA-GATCTCCAGCTTGGTCCC-3′；重链5′端引物 5′-AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3′ (S=C/G,M=A/C,R=A/G,W=A/T)，重链3′端引物5′-TGAGGAGACGGTGACCGT-GGTCCCTTGGCCCCAG-3′(中国科学院微生物研究所合成)。
细胞总RNA的提取 收集杂交瘤细胞株VmD11细胞，采用一步法提取总RNA，按TRIzolTM试剂(Gibco BRL公司)说明书进行。提取的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳定量。
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cDNA第一条链的合成 以10 μg总RNA为模板，采用轻、重链的3′端引物，按M-MLV反转录酶(Gibco BRL公司)说明书进行。
PCR反应 以cDNA第一条链为模板，50 μl的反应体积内含有以下成分：5 μl模板，各25 pmol轻链或重链可变区的5′及3′端引物，200 μmol/L的dNTP，5 μl的10×反应缓冲液，2.5 U的Taq DNA聚合酶(华美公司)。反应条件：93℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30次循环。扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
可变区基因的克隆 以限制性内切酶PstⅠ和BstEⅡ(内切酶均为Boehringer Mennheim公司产品)对质粒pRUWH及重链扩增产物进行完全酶解，以PvuⅡ和BglⅡ对质粒pRGWL及轻链扩增产物进行完全酶解。采用Glass Milk法回收相应片段。用T4 DNA连接酶(Boehringer Mennheim公司)分别连接重链片段和pRUWH、轻链片段和pRGWL,并转化经CaCl2处理处于感受态的DH5α菌。采用含80 μg/ml 氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选转化菌，在对克隆进行质粒小量快提后分别加以酶切鉴定。
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核苷酸序列测定 采用荧光标记双脱氧末端链终止法，使用载体克隆位点两端的测序引物，按DyeDeoxyTM Terminator DNA测序试剂盒(Perkin Elmer公司)说明书进行。
2 结果
VmD11单抗轻重链可变区基因的扩增和鉴定 以从杂交瘤株VmD11合成的cDNA第一条链为模板，经30个PCR循环，轻链引物扩增出320 bp左右的片段，重链引物扩增出360 bp左右的片段，未加模板的空白对照无扩增带。此结果与一般抗体轻重链可变区基因的大小相符。
VmD11单抗轻重链可变区基因的克隆和鉴定 将VmD11单抗的轻重链可变区基因分别克隆入载体pRGWL和pRUWH。轻链共得50个转化菌落，随机挑取4个克隆进行EcoRⅠ、 HindⅢ单酶切及PvuⅡ、BglⅡ双酶切鉴定，其中3个克隆为重组克隆。重链共得189个转化菌落，随机挑取4个克隆进行HindⅢ、Sau3AⅠ单酶切及PstⅠ、BstEⅡ双酶切鉴定，其中3个克隆为重组克隆。
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VmD11单抗轻重链可变区基因核苷酸序列 采用荧光标记Sanger双脱氧末端终止法对2个轻链可变区基因的重组克隆和2个重链可变区基因的重组克隆进行核苷酸序列测定。结果2个轻链可变区基因的重组克隆的序列完全相同(图1)。2个重链可变区基因的重组克隆的序列仅在第21位核苷酸有所不同，但不影响其氨基酸序列的一致(图2)。
图 1 VmD11 Vκ基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
Fig 1 The nucleotide sequence of VmD11 Vκ gene and its amino acid sequence
The complementarity-determining regions (CDRs) are indicated with lines
图 2 VmD11 VH 基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列
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Fig 2 The nucleotide sequence of VmD11 VH gene and its amino acid sequence
R=A or T. The complementarity-determining regions (CDRs) are indicated with lines
3 讨论
从杂交瘤中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出单抗的可变区基因，克隆入质粒载体中进行测序并确定可变区基因的亚群已成为获得单抗可变区基因的一条通用、快速、有效的方法。为此已根据鼠单抗可变区基因两侧的序列设计出了多种PCR扩增引物。虽然并非每一种引物均适用于所有的单抗，但在绝大多数情况下，只要选用合适的引物，总能扩增出单抗的可变区基因。
VEGF是一种促血管形成的内皮细胞特异的生长因子，已有大量证据表明它在肿瘤的发展、转移中起着重要的作用[7]。近年来许多研究均显示具有中和活性的VEGF抗体可在动物体内抑制原发瘤的生长并抑制转移灶的形成和生长[8]，具有潜在的临床治疗肿瘤的应用价值。
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本室研制的VEGF165鼠单抗VmD11具有中和VEGF165的活性，属小鼠IgG2a亚类[5]，在动物体内实验中显示出一定的抑制原发瘤生长及转移灶形成和生长的能力。故而笔者根据VmD11的IgG亚类选用相应的引物，以RT-PCR的方法扩增并克隆VmD11的轻、重链可变区基因，并进行核苷酸序列分析。轻链可变区基因推导出氨基酸序列后与小鼠κ轻链可变区亚群共有序列[9]比较，确定其属于第Ⅴ亚群，氨基酸序列同源性达72.9%，并确定该重链可变区基因属于VJκ5重排。重链可变区基因推导出氨基酸序列后与小鼠重链可变区亚群的共有序列[9]比较，确定其属于第Ⅱ(B)亚群，氨基酸序列同源性达80.5%，并确定该重链可变区基因属于VDJH2重排，其中D片段为小鼠的DSP2.7。
进一步将VmD11应用于临床治疗肿瘤，必须克服鼠单抗在人体内引起的人抗鼠抗体(HAMA)反应，为此已开展了VmD11人源化基因工程抗体的研究。VmD11的轻、重链可变区基因的克隆和测序为此项研究奠定了必要的基础。
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参 考 文 献
1 Keck PJ, Hauser SD, Krivi G,et al. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science, 1989, 246:1309～1311
2 Leung DW, Cachiances G, Kuang WJ, et al. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. Science, 1989, 246:1306～1309
3 Breler G, Albrecht U, Sterrer S, et al. Expression of vascular endothelial growth factor during embryonic angiogenesis and endothelial cell differentiation. Development, 1992, 114:521～526
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4 Tischer E, Mitchell R, Hartman T, et al. The human gene for vascular endothelial growth factor. Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J Biol Chem, 1991, 266:26031～26038
5 杨治华，石瑜琳，冉宇靓，等.抗人VEGF单抗的研制及对肿瘤生长及转移的抑制作用.中华微生物免疫学杂志，1998， 待发表
6 Orlandi R, Gssow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:3833～3839
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7 Hlatky L, Tsionou C, Hahnfeldt P, et al. Mammary fibroblast may influence breast tumor angiogenesis via hypoxia-induced vascular endothelial growth factor up-regulation and protein expression. Cancer Res, 1994, 54:6038～6042
8 Asano M, Yukita A, Matsumoto T, et al. Inhibition of tumor growth and metastasis by an immunoneutralizing monoclonal antibody to human vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor 121. Cancer Res, 1995, 55:5296～5302
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9 Kabat EA, Wu TT, Reid-Miler M, et al. Sequences of proteins of immunological interest. 4th ed. Washington DC: US Dept Health and Human Services, US Government Printing offices, 1991. 78～239
Cloning and Sequencing of the VL and VH Genes from the Anti-vascular Endothelial Growth Factor McAb Hybridoma Cell Line
Ran Yuliang Yang Zhihua Wang Guiqi Dong Zhiwei
(Cancer Institute, CAMS and PUMC, Beijing 100021)
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Objective The light chain variable region (VL) and heavy chain variable region (VH) genes from the anti-VEGF165 McAb hybridoma cell line were cloned for construction of it′s chimeric antibody. Methods The VL and VH genes were amplified from the total RNA of the VmD11 hybridoma with RT-PCR and cloned into vectors, and then analyzed by sequencing. Results The 320 bp VL gene belong to mouse kappa light chain subgroup V, the 354 bp VH gene belong to mouse heavy chains subgroup Ⅱ(B). Conclusions The nucleotide sequence analysis indicated that the cloned genes coded the light and heavy chain variable region of mouse respectively.
Key words vascular endothelial growth factor 165; variable region genes; polymerase chain reaction; nucleotide sequence analyses
(1998-03-12 收稿), 百拇医药