香烟烟雾提取物对大鼠肺组织乳酸脱氢酶漏出及对一氧化氮生成的影响
作者：任光民 赵鸣武 方秋红 姚兴海 王培勇 唐朝枢
单位：221002 江苏，徐州市第一人民医院呼吸内科(任光民)；北京医科大学第三临床医学院呼吸内科(赵鸣武、方秋红)，心肺内分泌研究室(姚兴海、王培勇、唐朝枢)
关键词：
中华医学杂志/980933 本实验将香烟烟雾提取物(CSE)与大鼠肺组织切片共同孵育，探讨吸烟对肺组织乳酸脱氢酶(LDH)漏出及对NO生成的影响。
一、材料与方法
1.大鼠肺组织切片的制备：取体重为200～250 g雄性SD大鼠36只，戊巴比妥钠麻醉后摘除肺脏，制成约1～2 mm厚的大鼠肺组织切片。
2.实验分组：实验分对照组和CSE组。LDH漏出和一氧化氮合酶(NOS)测定每组6只，左旋精氨酸(L-Arg)转运每组5只，全部实验均采用双平行管法。每例各取约200 mg大鼠肺组织切片，对照组加入 MEM培养液、CSE组加入含10%CSE的MEM培养液各2 ml进行孵育。
, 百拇医药
3.亚硝酸盐(NO2)含量和LDH活性测定：取孵育1、2和3小时的大鼠肺组织切片孵育液0.1 ml，分别测定其LDH的活性和NO2含量。固体标本彻底烘干后测定其干重(dw)。
4.NOS活性测定：取含200 mg蛋白的组织匀浆上清，按文献[1]方法测定cNOS和iNOS活性。
6.L-Arg转运测定：取孵育3小时的大鼠肺组织切片，离心3次去除CSE，加入5～20 μmol/L的L-Arg，按文献[2]方法测定CSE对大鼠肺组织L-Arg转运的影响。
7.统计学处理：两样本均数比较采
表3 10% CSE对大鼠肺组织NOS活性的影响(pmol*min-1*mg-1蛋白，±s) 组别
, http://www.100md.com
鼠数
iNOS活性
cNOS活性
1小时
2小时
3小时
1小时
2小时
3小时
对照组
6
29.2±1.8
28.1±2.2
, http://www.100md.com
41.4±3.3
23.2±1.8
35.8±4.5
28.4±5.6
CSE组
6
42.8±3.1*
57.2±2.2*△
68.5±4.4*△
11.5±2.8*
8.7±2.2*
, http://www.100md.com
18.8±7.4
注：与对照组比较，* P<0.01；与1小时比较，△ P<0.01
用组间t检验，多组资料比较采用One Way ANOVA组间q检验作统计学处理。
二、结果
1.对LDH漏出的影响：结果见表1。表1 10% CSE对大鼠肺组织LDH漏出
的影响(IU*g-1*dw，±s) 组别
鼠数
1小时
2小时
, http://www.100md.com
3小时
对照组
6
1534
±250
1824
±274
2089
±303
CSE组
6
2612
±395*
, http://www.100md.com
3075
±463*
4053
±754*△
注：与对照组比较* P<0.05；与1小时比较△ P<0.05
2.对NO2释放的影响：CSE中含有微量NO2，实验测定的NO2均经过与10% CSE空白管校正。实验结果见表2。表2 10% CSE对大鼠肺组织NO2-
释放的影响(μmol*g-1*dw,±s) 组别
, 百拇医药
鼠数
1小时
2小时
3小时
对照组
6
63
±3
62
±4
66
±3
CSE组
6
, 百拇医药
82
±6*
119
±12**△
123
±5**△
注：与对照组比较 * P<0.05；**P<0.01；与1小时比较△ P<0.01
3.大鼠肺组织NO2释放与LDH漏出的关系：CSE呈时间和浓度依赖性的增加了大鼠肺组织LDH漏出和NO2的生成。直线相关分析表明，二者的变化显著正相关(r=0.65，P<0.01)。
, 百拇医药
4.CSE对大鼠肺组织NOS活性的影响：CSE对大鼠肺组织NOS活性具有激活作用。其中以iNOS活性增加为主，而对cNOS活性则具有抑制作用(表3)。
5.CSE对大鼠肺组织L-Arg转运的影响：大鼠肺组织摄取L-Arg通过高亲和力载体蛋白所介导。10% CSE刺激大鼠肺组织L-Arg转运的最大速率增加45.8%(P<0.01)。而对L-Arg转运的米氏常数(Km)无明显影响(P>0.05)。
大鼠肺组织摄取[3H]-L-Arg具有时间依赖性，在5分钟时其转运速度达到峰值，而经10% CSE处理的大鼠肺组织孵育1、2、5和10分钟其转运速度分别较对照组增加59%、33%、40%和43%(P均<0.01)。
三、讨论
内源性NO是以L-Arg和分子氧为底物，在NOS催化下脱去等分子胍氨酸而产生。NOS分为cNOS和iNOS[3]。cNOS为钙依赖型，基础状态下在钙调蛋白存在时产生少量NO，参与血管张力调节和神经传导；而iNOS为钙非依赖性，在炎症细胞因子的刺激下，肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞的iNOS活性增加，生成大量的NO[3]。这些过量产生的NO可以通过与细胞内含铁酶的结合抑制细胞呼吸、破坏DNA双螺旋结构，与香烟烟雾或巨噬细胞来源的O2迅速反应生成毒性更强的过氧亚硝酸根(ONOO-)，从而损伤肺组织[4]。
, 百拇医药
本实验结果表明，CSE通过增加大鼠肺组织iNOS活性及L-Arg转运，使NO生成增多，并造成肺组织损伤。这可能为我们使用NOS抑制剂(如肾上腺皮质激素等)干预吸烟造成的肺损害提供进一步的依据。但CSE激活L-Arg转运载体的作用为其直接效应和/或通过某些因素的介导，尚需进一步研究。 参考文献
1 Scott JA, Mechoun M, McCormack DG, et al. Inducible nitric oxide synthase and vascular reactivity in rat thoracic aorta: effect of amino-guanidine. J Appl Physiol, 1996, 80：271-277.
2 Cendan JC, Souba WW, Copeland SE, et al. Cytokines regulate endotoxin stimulation of endothelial cell arginine transport. Surgery, 1995, 117：213-219.
3 Barnes PJ, Belvisi MG. Nitric oxide and lung disease. Thorax, 1993, 48：1034-1043.
4 Haddad IY, Ischiropoulos H, Holin BA, et al. Machanism of peroxynitrite-induce injury pulmonary Surfantants. Am J Physiol, 1994, 267：L720-727., 百拇医药
单位：221002 江苏，徐州市第一人民医院呼吸内科(任光民)；北京医科大学第三临床医学院呼吸内科(赵鸣武、方秋红)，心肺内分泌研究室(姚兴海、王培勇、唐朝枢)
关键词：
中华医学杂志/980933 本实验将香烟烟雾提取物(CSE)与大鼠肺组织切片共同孵育，探讨吸烟对肺组织乳酸脱氢酶(LDH)漏出及对NO生成的影响。
一、材料与方法
1.大鼠肺组织切片的制备：取体重为200～250 g雄性SD大鼠36只，戊巴比妥钠麻醉后摘除肺脏，制成约1～2 mm厚的大鼠肺组织切片。
2.实验分组：实验分对照组和CSE组。LDH漏出和一氧化氮合酶(NOS)测定每组6只，左旋精氨酸(L-Arg)转运每组5只，全部实验均采用双平行管法。每例各取约200 mg大鼠肺组织切片，对照组加入 MEM培养液、CSE组加入含10%CSE的MEM培养液各2 ml进行孵育。
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3.亚硝酸盐(NO2)含量和LDH活性测定：取孵育1、2和3小时的大鼠肺组织切片孵育液0.1 ml，分别测定其LDH的活性和NO2含量。固体标本彻底烘干后测定其干重(dw)。
4.NOS活性测定：取含200 mg蛋白的组织匀浆上清，按文献[1]方法测定cNOS和iNOS活性。
6.L-Arg转运测定：取孵育3小时的大鼠肺组织切片，离心3次去除CSE，加入5～20 μmol/L的L-Arg，按文献[2]方法测定CSE对大鼠肺组织L-Arg转运的影响。
7.统计学处理：两样本均数比较采
表3 10% CSE对大鼠肺组织NOS活性的影响(pmol*min-1*mg-1蛋白，±s) 组别
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鼠数
iNOS活性
cNOS活性
1小时
2小时
3小时
1小时
2小时
3小时
对照组
6
29.2±1.8
28.1±2.2
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41.4±3.3
23.2±1.8
35.8±4.5
28.4±5.6
CSE组
6
42.8±3.1*
57.2±2.2*△
68.5±4.4*△
11.5±2.8*
8.7±2.2*
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18.8±7.4
注：与对照组比较，* P<0.01；与1小时比较，△ P<0.01
用组间t检验，多组资料比较采用One Way ANOVA组间q检验作统计学处理。
二、结果
1.对LDH漏出的影响：结果见表1。表1 10% CSE对大鼠肺组织LDH漏出
的影响(IU*g-1*dw，±s) 组别
鼠数
1小时
2小时
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3小时
对照组
6
1534
±250
1824
±274
2089
±303
CSE组
6
2612
±395*
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3075
±463*
4053
±754*△
注：与对照组比较* P<0.05；与1小时比较△ P<0.05
2.对NO2释放的影响：CSE中含有微量NO2，实验测定的NO2均经过与10% CSE空白管校正。实验结果见表2。表2 10% CSE对大鼠肺组织NO2-
释放的影响(μmol*g-1*dw,±s) 组别
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鼠数
1小时
2小时
3小时
对照组
6
63
±3
62
±4
66
±3
CSE组
6
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82
±6*
119
±12**△
123
±5**△
注：与对照组比较 * P<0.05；**P<0.01；与1小时比较△ P<0.01
3.大鼠肺组织NO2释放与LDH漏出的关系：CSE呈时间和浓度依赖性的增加了大鼠肺组织LDH漏出和NO2的生成。直线相关分析表明，二者的变化显著正相关(r=0.65，P<0.01)。
, 百拇医药
4.CSE对大鼠肺组织NOS活性的影响：CSE对大鼠肺组织NOS活性具有激活作用。其中以iNOS活性增加为主，而对cNOS活性则具有抑制作用(表3)。
5.CSE对大鼠肺组织L-Arg转运的影响：大鼠肺组织摄取L-Arg通过高亲和力载体蛋白所介导。10% CSE刺激大鼠肺组织L-Arg转运的最大速率增加45.8%(P<0.01)。而对L-Arg转运的米氏常数(Km)无明显影响(P>0.05)。
大鼠肺组织摄取[3H]-L-Arg具有时间依赖性，在5分钟时其转运速度达到峰值，而经10% CSE处理的大鼠肺组织孵育1、2、5和10分钟其转运速度分别较对照组增加59%、33%、40%和43%(P均<0.01)。
三、讨论
内源性NO是以L-Arg和分子氧为底物，在NOS催化下脱去等分子胍氨酸而产生。NOS分为cNOS和iNOS[3]。cNOS为钙依赖型，基础状态下在钙调蛋白存在时产生少量NO，参与血管张力调节和神经传导；而iNOS为钙非依赖性，在炎症细胞因子的刺激下，肺泡巨噬细胞、成纤维细胞、嗜中性粒细胞的iNOS活性增加，生成大量的NO[3]。这些过量产生的NO可以通过与细胞内含铁酶的结合抑制细胞呼吸、破坏DNA双螺旋结构，与香烟烟雾或巨噬细胞来源的O2迅速反应生成毒性更强的过氧亚硝酸根(ONOO-)，从而损伤肺组织[4]。
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本实验结果表明，CSE通过增加大鼠肺组织iNOS活性及L-Arg转运，使NO生成增多，并造成肺组织损伤。这可能为我们使用NOS抑制剂(如肾上腺皮质激素等)干预吸烟造成的肺损害提供进一步的依据。但CSE激活L-Arg转运载体的作用为其直接效应和/或通过某些因素的介导，尚需进一步研究。 参考文献
1 Scott JA, Mechoun M, McCormack DG, et al. Inducible nitric oxide synthase and vascular reactivity in rat thoracic aorta: effect of amino-guanidine. J Appl Physiol, 1996, 80：271-277.
2 Cendan JC, Souba WW, Copeland SE, et al. Cytokines regulate endotoxin stimulation of endothelial cell arginine transport. Surgery, 1995, 117：213-219.
3 Barnes PJ, Belvisi MG. Nitric oxide and lung disease. Thorax, 1993, 48：1034-1043.
4 Haddad IY, Ischiropoulos H, Holin BA, et al. Machanism of peroxynitrite-induce injury pulmonary Surfantants. Am J Physiol, 1994, 267：L720-727., 百拇医药