基因重组促红细胞生成素导致高血压的机制研究
作者：刘章锁 耿晓仲 李中和 李全民 张明轩 刘钟明
单位：刘章锁 李中和 李全民 张明轩 刘钟明 河南省洛阳轴承(集团)公司医院；耿晓仲 河南医科大学附属第一医院
关键词：基因重组；促红细胞生成素；慢性肾衰；贫血；高血压；一氧化氮；内皮素-1
中国医院药学杂志981210 摘要 目的：探讨基因重组促红细胞生成素(r-HuEPO)在治疗慢性肾衰(CRF)贫血中导致高血压的机制及防治对策。方法：对r-HuEPO治疗中出现高血压的CRF血液透析贫血患者15例及对照组15例，应用分光光度法及放免法观察治疗前后血浆一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)及内皮素-1(ET-1)的变化。同时用大鼠进行对照试验。结果：1.CRF贫血患者及贫血鼠用r-HuEPO16周后，红细胞压积(Hct)升高、血压升高，ET-1增加(P<0.01)，血浆NO2-/NO3-下降(P<0.05)，而对照组用药前后无明显变化(P>0.05)。2.在用药16周后，RTPCR测得实验组大鼠肾皮质及髓质iNOSmRNA比对照组明显减少(P<0.05)。结论：研究表明r-HuEPO导致高血压与iNOSmRNA减少，合成的NO减少及ET-1增加有着重要的关系。
, 百拇医药
近年来研究表明，促红细胞生成素(EPO)合成相对或绝对不足是慢性肾炎(CRF)贫血的主要原因。应用r-HuEPO治疗CRF贫血取得了满意的效果。但其主要的不良反应是导致不同程度的高血压或使原有的高血压加重[1]。作者对30例CRF贫血血液透析(HD)患者及30例CRF贫血动物模型测定血浆一氧化氮代谢产物NO2-/NO3-、内皮素-1(ET-1)及一氧化碳合酶mRNA(iNOSmRNA)等血管活性物质的动态变化，试图探讨r-HuEPO导致高血压的机制，进而寻找防治对策。
1 临床实验
选择30例CRF贫血HD患者，男21例，女9例，平均年龄43.6±3.1岁，平均红细胞压积(Hct)0.22±0.03，血压(Bp)均在21.3/12.6 kPa以上。在实验期间所用降压药不变。分为两组：实验组给予r-HuEPO(安进中国有限公司生产)，剂量为100 U.kg-1每周三次皮下注射，当Hct≥0.3时，维持原剂量的1/3～1/2。治疗16周后，出现平均动脉压升高超过1.3 kPa的15例为实验组；对照组间断输血或洗涤红细胞悬液。两组Bp均每日测定两次，Hct每周一次。NO2-/NO3-测定应用分光光度法进行，ET-1测定采用放免法(药盒均由东亚免疫技术研究所提供，具体操作按说明书进行)。
, 百拇医药
2 动物实验
2.1 CRF大鼠模型 随机选取5月龄SD雄性大鼠，体重300～400 g，行肾5/6切除术，术后2～4周，BUN升至16.2±2.4 mmol.L-1，尿蛋白+～，Hct为0.21±0.02。术中切除鼠肾留做逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)。
2.2 实验方法 选择应用r-HuEPO，剂量为100 U.kg-1，每周三次皮下注射，在16周后出现平均动脉压升高超过1.3 kPa的CRF贫血大鼠15只为实验组。随机选择15只CRF贫血大鼠作对照组，应用等量生理盐水皮下注射，观察16周。每两周测量一次Bp。Hb、Hct及BUN每四周测量一次，NO2-/NO3-及ET-1实验前后各一次。
, 百拇医药 2.3 肾脏诱生一氧化氮合酶(iNOS)的测定 以RT-PCR来表达。将大鼠在全麻下切下肾组织，用冷生理盐水灌洗，直至苍白后分离皮、髓质。用Promega公司Poly ATtract试剂提取组织中总mRNA(按说明书操作)，参照文献方法[2]并加以改进。大鼠iNOS寡核苷酸引物由中国科学院微生物所合成。反义链：5′-ACA GGG AAG TCT GAA GCA CTA G3′，正义链：5′-CAT GCA AGG AAG GGA ACT CTT-3′。反应体系10×buffer 5 μl引物(正义链和反义链)各2 μl4×dNTP2.5mM4μl，AMV3单位，标本5μl，加DEPC水补足50μl体积，石蜡油封顶；42 ℃逆转录30 min；94℃预变性后加入2单位Taq酶，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min循环35次；最后延伸72 ℃7min。将扩增产物10μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照，在256 nm紫外光下可见到1 033 bp片段即为阳性。
, 百拇医药
3 结果
r-HuEPO对CRF贫血HD患者的影响见表1。r-HuEPO对CRF贫血大鼠的影响见表2。
表1 r-HuEPO治疗前后CRF血透病人Bp、HCT、NO2-/NO3-、ET-1等变化(±s,n=15) 组别
Bp
kPa
HCT
%
NO2/NO3
μmol.L-1
, 百拇医药
ET-1
pg.ml-1
BUN
mmol.L-1
实验组
用药前
122.8±
4.7
22.3±
3.2
42.1±
8.5
, 百拇医药
244.1±
26.2
28.4±
3.9
用药后
132.2±
5.5*1
36.7±
3.3*1
25.6±
6.6
392.9±
, 百拇医药
69.8*1
28.4±
4.1
对照组
前
123.2±
1.6
23.6±
3.4
42.1±
7.2
247.1±
29.3
, 百拇医药
29.0±
5.2
后
122.7±
4.0*2
23.0±
2.3*2
40.6±
7.4*2
253.3±
26.8*2
27.4±
, 百拇医药
1.3
用药前后自身比较，*1P<0.01；用药后与对照组比较，*2P<0.05。下表同。
CRF贫血鼠iNOSmRAN经各种特异条带吸光度测定，用药12～16周后肾皮质髓质iNOSmRNA水平明显低于对照组(P<0.05)。
表2 r-HuEPO治疗前后CRF大鼠Bp、HCT、NO2-/NO3-、ET-1等变化(±s,n=15) 组别
Bp
kPa
HCT
%
, http://www.100md.com
NO2/NO3
μmol.L-1
ET-1
pg.ml-1
BUN
mmol.L-1
实验组
用药前
139.4±
4.3
, 百拇医药 21.5±
2.2
52.9±
7.7
308.9
16.8
26.3±
2.0
用药后
158.93±
5.6*1
38.5±
3.1*1
, 百拇医药
34.4±
5.2*1
482.7±
30.0*1
25.7±
2.3
对照组
前
140.3±
5.2
21.5±
1.9
, 百拇医药
51.3±
6.8
316.9±
19.8
25.9±
2.8
后
143.3±
6.9*2
19.2±
2.1*2
49.9±
, http://www.100md.com
7.2*2
314.1±
23.0*2
24.8±
3.2
4 讨论
4.1 作者通过测定NO、ET-1等血管活性物质，发现其在r-HuEPO致高血压中起着一定作用。
4.2 为了排除环境和遗传因素的影响，作者选用SD大鼠作为观察对象。结果发现，应用r-HuEPO16周后，高血压大鼠中血浆NO2-/NO3-下降，ET-1明显升高。由此推测，NO合成减少时，ET-1含量增加，导致肾血管收缩，使肾血流量下降和GER降低，同时导致缩血管反应增加，使血压升高。
, 百拇医药
4.3 应用分子生物学方法检测应用r-HuEPO后，实验组鼠肾皮质及髓质iNOSmRNA水平明显低于对照组。表明应用r-HuEPO后，可导致肾iNOSmRNA合成减少，使NO合成减少，ET-1含量增加，导致周围血管阻力增加[3]，进而使血压升高。因此，若能增加NO产生的底物左旋精氨酸和NOS的活性，同时抑制NOS灭活速度，可望防治r-HuEPO所致高血压。
参考文献
1 Muirhead N,Bargman J,Burgess E,et al.Evidence-based recommendations for the clinical use of recombinant human erythropoietin.Am J Kidney Dis,1995(supple 1):1
2 陈昂、吕小燕、王海燕.一氧化氮在老龄大鼠急性缺血性肾损伤中的作用.中华医学杂志，1996，76：572～577
3 Hon G,Vaziri ND,Kaupke CJ,et al.Lack of a fast-acting effect of erythropoietin on arterial blood pressure and endothelin level.Artif Organs.1995,19:188
(1998年6月30日收稿), 百拇医药
单位：刘章锁 李中和 李全民 张明轩 刘钟明 河南省洛阳轴承(集团)公司医院；耿晓仲 河南医科大学附属第一医院
关键词：基因重组；促红细胞生成素；慢性肾衰；贫血；高血压；一氧化氮；内皮素-1
中国医院药学杂志981210 摘要 目的：探讨基因重组促红细胞生成素(r-HuEPO)在治疗慢性肾衰(CRF)贫血中导致高血压的机制及防治对策。方法：对r-HuEPO治疗中出现高血压的CRF血液透析贫血患者15例及对照组15例，应用分光光度法及放免法观察治疗前后血浆一氧化氮代谢产物(NO2-/NO3-)及内皮素-1(ET-1)的变化。同时用大鼠进行对照试验。结果：1.CRF贫血患者及贫血鼠用r-HuEPO16周后，红细胞压积(Hct)升高、血压升高，ET-1增加(P<0.01)，血浆NO2-/NO3-下降(P<0.05)，而对照组用药前后无明显变化(P>0.05)。2.在用药16周后，RTPCR测得实验组大鼠肾皮质及髓质iNOSmRNA比对照组明显减少(P<0.05)。结论：研究表明r-HuEPO导致高血压与iNOSmRNA减少，合成的NO减少及ET-1增加有着重要的关系。
, 百拇医药
近年来研究表明，促红细胞生成素(EPO)合成相对或绝对不足是慢性肾炎(CRF)贫血的主要原因。应用r-HuEPO治疗CRF贫血取得了满意的效果。但其主要的不良反应是导致不同程度的高血压或使原有的高血压加重[1]。作者对30例CRF贫血血液透析(HD)患者及30例CRF贫血动物模型测定血浆一氧化氮代谢产物NO2-/NO3-、内皮素-1(ET-1)及一氧化碳合酶mRNA(iNOSmRNA)等血管活性物质的动态变化，试图探讨r-HuEPO导致高血压的机制，进而寻找防治对策。
1 临床实验
选择30例CRF贫血HD患者，男21例，女9例，平均年龄43.6±3.1岁，平均红细胞压积(Hct)0.22±0.03，血压(Bp)均在21.3/12.6 kPa以上。在实验期间所用降压药不变。分为两组：实验组给予r-HuEPO(安进中国有限公司生产)，剂量为100 U.kg-1每周三次皮下注射，当Hct≥0.3时，维持原剂量的1/3～1/2。治疗16周后，出现平均动脉压升高超过1.3 kPa的15例为实验组；对照组间断输血或洗涤红细胞悬液。两组Bp均每日测定两次，Hct每周一次。NO2-/NO3-测定应用分光光度法进行，ET-1测定采用放免法(药盒均由东亚免疫技术研究所提供，具体操作按说明书进行)。
, 百拇医药
2 动物实验
2.1 CRF大鼠模型 随机选取5月龄SD雄性大鼠，体重300～400 g，行肾5/6切除术，术后2～4周，BUN升至16.2±2.4 mmol.L-1，尿蛋白+～，Hct为0.21±0.02。术中切除鼠肾留做逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)。
2.2 实验方法 选择应用r-HuEPO，剂量为100 U.kg-1，每周三次皮下注射，在16周后出现平均动脉压升高超过1.3 kPa的CRF贫血大鼠15只为实验组。随机选择15只CRF贫血大鼠作对照组，应用等量生理盐水皮下注射，观察16周。每两周测量一次Bp。Hb、Hct及BUN每四周测量一次，NO2-/NO3-及ET-1实验前后各一次。
, 百拇医药 2.3 肾脏诱生一氧化氮合酶(iNOS)的测定 以RT-PCR来表达。将大鼠在全麻下切下肾组织，用冷生理盐水灌洗，直至苍白后分离皮、髓质。用Promega公司Poly ATtract试剂提取组织中总mRNA(按说明书操作)，参照文献方法[2]并加以改进。大鼠iNOS寡核苷酸引物由中国科学院微生物所合成。反义链：5′-ACA GGG AAG TCT GAA GCA CTA G3′，正义链：5′-CAT GCA AGG AAG GGA ACT CTT-3′。反应体系10×buffer 5 μl引物(正义链和反义链)各2 μl4×dNTP2.5mM4μl，AMV3单位，标本5μl，加DEPC水补足50μl体积，石蜡油封顶；42 ℃逆转录30 min；94℃预变性后加入2单位Taq酶，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min循环35次；最后延伸72 ℃7min。将扩增产物10μl上样，1.5%琼脂糖凝胶电泳后拍照，在256 nm紫外光下可见到1 033 bp片段即为阳性。
, 百拇医药
3 结果
r-HuEPO对CRF贫血HD患者的影响见表1。r-HuEPO对CRF贫血大鼠的影响见表2。
表1 r-HuEPO治疗前后CRF血透病人Bp、HCT、NO2-/NO3-、ET-1等变化(±s,n=15) 组别
Bp
kPa
HCT
%
NO2/NO3
μmol.L-1
, 百拇医药
ET-1
pg.ml-1
BUN
mmol.L-1
实验组
用药前
122.8±
4.7
22.3±
3.2
42.1±
8.5
, 百拇医药
244.1±
26.2
28.4±
3.9
用药后
132.2±
5.5*1
36.7±
3.3*1
25.6±
6.6
392.9±
, 百拇医药
69.8*1
28.4±
4.1
对照组
前
123.2±
1.6
23.6±
3.4
42.1±
7.2
247.1±
29.3
, 百拇医药
29.0±
5.2
后
122.7±
4.0*2
23.0±
2.3*2
40.6±
7.4*2
253.3±
26.8*2
27.4±
, 百拇医药
1.3
用药前后自身比较，*1P<0.01；用药后与对照组比较，*2P<0.05。下表同。
CRF贫血鼠iNOSmRAN经各种特异条带吸光度测定，用药12～16周后肾皮质髓质iNOSmRNA水平明显低于对照组(P<0.05)。
表2 r-HuEPO治疗前后CRF大鼠Bp、HCT、NO2-/NO3-、ET-1等变化(±s,n=15) 组别
Bp
kPa
HCT
%
, http://www.100md.com
NO2/NO3
μmol.L-1
ET-1
pg.ml-1
BUN
mmol.L-1
实验组
用药前
139.4±
4.3
, 百拇医药 21.5±
2.2
52.9±
7.7
308.9
16.8
26.3±
2.0
用药后
158.93±
5.6*1
38.5±
3.1*1
, 百拇医药
34.4±
5.2*1
482.7±
30.0*1
25.7±
2.3
对照组
前
140.3±
5.2
21.5±
1.9
, 百拇医药
51.3±
6.8
316.9±
19.8
25.9±
2.8
后
143.3±
6.9*2
19.2±
2.1*2
49.9±
, http://www.100md.com
7.2*2
314.1±
23.0*2
24.8±
3.2
4 讨论
4.1 作者通过测定NO、ET-1等血管活性物质，发现其在r-HuEPO致高血压中起着一定作用。
4.2 为了排除环境和遗传因素的影响，作者选用SD大鼠作为观察对象。结果发现，应用r-HuEPO16周后，高血压大鼠中血浆NO2-/NO3-下降，ET-1明显升高。由此推测，NO合成减少时，ET-1含量增加，导致肾血管收缩，使肾血流量下降和GER降低，同时导致缩血管反应增加，使血压升高。
, 百拇医药
4.3 应用分子生物学方法检测应用r-HuEPO后，实验组鼠肾皮质及髓质iNOSmRNA水平明显低于对照组。表明应用r-HuEPO后，可导致肾iNOSmRNA合成减少，使NO合成减少，ET-1含量增加，导致周围血管阻力增加[3]，进而使血压升高。因此，若能增加NO产生的底物左旋精氨酸和NOS的活性，同时抑制NOS灭活速度，可望防治r-HuEPO所致高血压。
参考文献
1 Muirhead N,Bargman J,Burgess E,et al.Evidence-based recommendations for the clinical use of recombinant human erythropoietin.Am J Kidney Dis,1995(supple 1):1
2 陈昂、吕小燕、王海燕.一氧化氮在老龄大鼠急性缺血性肾损伤中的作用.中华医学杂志，1996，76：572～577
3 Hon G,Vaziri ND,Kaupke CJ,et al.Lack of a fast-acting effect of erythropoietin on arterial blood pressure and endothelin level.Artif Organs.1995,19:188
(1998年6月30日收稿), 百拇医药