高效液相色谱法测定阿糖胞苷的血药浓度
作者：李文英 赵丽
单位：李文英 山西省药品检验所 太原 030001；赵丽 山西省肿瘤研究所中心仪器室
关键词：阿糖胞苷；色谱法，高压液相；药代动力学
山西医科大学学报990116 摘要 用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中阿糖胞苷(Ara-c)浓度。Ara-c血浆浓度在0.4～12.5mg/L 范围内为直线，r＝0.999 6。日内、日间精密度(CV)均小于5.0%，回收率为86.4%，血浆中最低检测浓度为0.05mg/L,5例患者，每例静滴Ara-c 500mg后，用HPLC方法测定其血浆浓度，所得药代动力学参数平均值符合二室模型，结果表明该法适合于临床药物监护及药物动力学分析。
中图号 R446.119
阿糖胞苷(Ara-c)是最常用的抗白血病药物之一，对急性淋巴细胞白血病及急性非淋巴细胞白血病均有良好的疗效[1]，近二十年来关于阿糖胞苷抗白血病的给药剂量及临床药理学研究颇为活跃[2]，已有大量资料表明[3，4]阿糖胞苷的血药浓度、药物动力学及给药方案的设计对急性白血病的化疗效果有直接影响。为此在治疗期间，对血浆中药物浓度进行监测是必要的，测定Ara-c时可采用放射免疫法[5]，高效液相色谱法(HPLC)[5，6]，离子交换法[7]等，我们建立了Ara-c浓度测定的高效液相色谱法，为监测病人Ara-c的血药浓度提供了一个切实可行的方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 阿糖胞苷盐酸盐，上海第十二制药厂提供，包括标准品与粉针剂；三氯乙酸、甲酸铵均为分析纯，水为重蒸馏水。日立638型高效液相色谱仪，紫外分光光度检测器；LG15-10高速微量离心机；SK-1型旋涡混合器；DT-100A分析天平。
1.2 色谱条件 固定相YWG C18(25cm×4.6mm)，固定相为天津第二化学试剂厂产品；流动相，0.01mol/L甲酸铵缓冲液(pH6.2～6.8)；流速：1ml/min；检测波长：UV 254nm；灵敏度0.02 AuFs；室温条件下分析。
1.3 样品处理 静脉取血1～2ml，肝素抗凝，离心分离血浆，混匀后加入5mol/L三氯醋酸70 μl，振摇2min，静置5min，离心20min(10000r/min)，吸取上清液25μl进样。
, 百拇医药 2 结果
2.1 色谱分离效果 以YWGC18为固定相，用0.01mol/L甲酸铵缓冲液洗脱，阿糖胞苷可排除血中成分及其他常用化疗药的干扰达基线分离，保留时间为11min。见图1。
图1 血浆中阿糖胞苷色谱
2.2 血浆中Ara-c标准工作曲线、灵敏度、回收率、精密度 精取空白血浆数份，分别加入不同量的Ara-c标准液，按上法提取测定，得到0.4～12.5mg/L标准曲线，回归方程为Y=0.027X+0.0476 r=0.9996n=5，式中Y为峰高，X为血浆浓度(mg/L)。血浆中Ara-c最低检测浓度为0.05mg/L。同法测定Ara-c的绝对回收率平均为86.4%(n=10)，日内及日间的精度，见表1。
, 百拇医药 表1 Ara-c的日内、日间精度试验 血浆中Ara-c加入量(ml)
n
日内误差
日间误差
±s(mg/L)
CV(%)±s(mg/L)
CV(%)
0.4
6
0.371±0.018
, 百拇医药 4.89
0.369±0.015
4.07
2.5
6
2.145±0.049
2.31
2.217±0.106
4.78
12.5
6
11.207±0.195
1.74
, 百拇医药
11.117±0.487
4.38
2.3 Ara-c的稳定性试验 在1ml蒸馏水与含三氯醋酸(5mol/L)70μl的1ml水溶液中，加入100μlAra-c共3份，置普通冰箱中，连续10d分别取样测定，结果表明Ara-c在酸性溶液中稳定。另取血浆数份，分别加入不同量的Ara-c标准液使成2种不同浓度(2.5、5.0mg/L)，按上法提取后，分别于室温中和置-30℃冰箱中连续4d进行测定，结果表明Ara-c在室温25℃中5h或在-30℃下4d，在血浆中浓度基本不变。
2.4 取血后不同时间加入三氯乙酸对血药浓度的影响 为了解血中含有的脱氨酶对阿糖胞苷的降解及考查三氯乙酸对脱氨酶的破坏作用，我们分别于不同时间加入高浓度三氯乙酸处理含Ara-c血样，然后测定血药浓度，具体方法为：采集正常人静脉血(同血型)混合后立即精密吸取1.0ml6份，每管中加入标准Ara-c贮备液(100mg/L)10μl；混合均匀后分别于加入Ara-c后的0.5、15、60min及6、12、24h加入65%三氯乙酸、振荡、混匀后4℃放置3h后离心取上清液-30℃冻存，同时取全血1.0ml4份，每份立即加入65%三氯乙酸后混匀放置1h后加入Ara-c贮备液10μl。旋涡振荡后4℃放置3h离心，上清液供HPLC进样，所测浓度作为1mg/L原始体外未衰减浓度，结果表明：取血后立即及5min内加入去蛋白剂，其血药浓度变化不大，1h后加入三氯乙酸其血药浓度明显下降，6h后再加入三氯乙酸所检测出的Ara-c浓度仅为起始0时的32.8%，放置24h后血中Ara-c90%被降解、转化，见图2。
, 百拇医药
图2 血中Ara-c的体外降解
2.5 人体内Ara-c的药物动力学 患者在滴注完500mgAra-c后，在0、5、10、15、30、60、120、180min各取静脉血1ml，离心后取血浆0.1ml，按上法提取分离后用HPLC法测定血药浓度，其药动学特性可按二室模型描述，其药动学参数平均值为：A：2.29，a：8.62/h，T1/2(α)：0.09h，B：0.76，β：0.21/h，T1/2(β)：3.43h，VC：228.08L，K21：3.05，K10：0.93，K12：4.85。药时曲线见图3。
图3 人体中静注Ara-c后的模拟药时曲线
3 讨论
, 百拇医药
本法在样品预处理中，具有操作简便、分析迅速、灵敏度高、流动相成本低等优点，对Ara-c的血药浓度监测和研究具有一定的实用性，易于推广。
文献报道 Ara-c 在水溶液中其稳定性受pH值的影响较大，在酸性中易脱氨基水解成阿糖胞苷[3]。本文的稳定性试验表明 Ara-c 在酸性提取条件下，25 ℃室温中放置 5 h或-30℃下放 4 d，其浓度基本不变。因此样品的检测应在采血后 5 h内完成或放低温下保存。
Ara-c 在人及动物体内过程有一室模型和二室模型二种结果[7]。从本实验所测得的药动学参数中可以看出， Ara-c 静滴后，在人体内的药动学符合双室模型，与有些文献报道的相符。
血中 Ara-c 检测的一个主要难题是其衰减快，病人取血后在离心、分离等处理过程中将有部分降解致使测定的结果并非真实的血药浓度。现在国外一般采血后立即加入四氢尿嘧啶核苷，国内不生产，进口困难且价格昂贵，我们考虑到脱氨酶作为蛋白质，在高浓度三氯乙酸中易被破坏，而阻止 Ara-c 的代谢研究结果也证明：取血如不马上抑制酶的活性， Ara-c 在体外将继续以较快速度降解，而加入三氯乙酸后阻止了阿糖胞苷的浓度变化。这样处理样本，简单方便，结果稳定。
, 百拇医药
采用本方法检测 Ara-c 血药浓度，其灵敏度、稳定性及重现性均可满足临床血药浓度监测及药代动力学研究的要求，为 Ara-c 的临床药理研究、调整剂量、避免或减少蓄积中毒，显得十分重要。
参考文献
1 孙秉中，袁跃传，杨岚，等. 去甲基柔红毒素联合阿糖胞苷治疗急性非淋巴细胞性白血病疗效观察. 中华内科杂志，1998，37(3)：186～187
2 李希凯，廉洁. 急性非淋巴细胞性白血病缓解后应用小剂量阿糖胞苷维持治疗的疗效观察. 临床肿瘤学杂志，1997，2(2)：77～78
3 章德扬.急性白血病病人细胞体外药敏试验与临床的联系. 上海第二医科大学学报，1989， 9(2)： 117～122
4 徐兵，周淑芝，刘启发，等. 不同化疗方案治疗老年人急性髓系白血病疗效观察. 中国实用内科杂志，1998，18(3)： 159～161
, http://www.100md.com
5 Bagular BC.Plasma half-life of cytosine arabinoside(NSO-63878) in patients treated for acute myeloblastic leukemia.Cancer Chemother Rep,1971，55：291
6 Liverside GG,Simultaneous analysis of 1-β-D-arabi-nofuranosylcytosine,1-β-D-arabinofuranosyluracil and sodium salicylate in biological samples by HPLC.J Chromatogr,1983，276：375
7 Schilsky RL. Simultaneous determination of cytosine arabinoside,its nucleotider and metabolite by ion-pair high-performance liquid chromatography. J Chromatogr,1985，337：63
[1998-10-22收稿], 百拇医药
单位：李文英 山西省药品检验所 太原 030001；赵丽 山西省肿瘤研究所中心仪器室
关键词：阿糖胞苷；色谱法，高压液相；药代动力学
山西医科大学学报990116 摘要 用高效液相色谱法(HPLC)测定血浆中阿糖胞苷(Ara-c)浓度。Ara-c血浆浓度在0.4～12.5mg/L 范围内为直线，r＝0.999 6。日内、日间精密度(CV)均小于5.0%，回收率为86.4%，血浆中最低检测浓度为0.05mg/L,5例患者，每例静滴Ara-c 500mg后，用HPLC方法测定其血浆浓度，所得药代动力学参数平均值符合二室模型，结果表明该法适合于临床药物监护及药物动力学分析。
中图号 R446.119
阿糖胞苷(Ara-c)是最常用的抗白血病药物之一，对急性淋巴细胞白血病及急性非淋巴细胞白血病均有良好的疗效[1]，近二十年来关于阿糖胞苷抗白血病的给药剂量及临床药理学研究颇为活跃[2]，已有大量资料表明[3，4]阿糖胞苷的血药浓度、药物动力学及给药方案的设计对急性白血病的化疗效果有直接影响。为此在治疗期间，对血浆中药物浓度进行监测是必要的，测定Ara-c时可采用放射免疫法[5]，高效液相色谱法(HPLC)[5，6]，离子交换法[7]等，我们建立了Ara-c浓度测定的高效液相色谱法，为监测病人Ara-c的血药浓度提供了一个切实可行的方法。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 阿糖胞苷盐酸盐，上海第十二制药厂提供，包括标准品与粉针剂；三氯乙酸、甲酸铵均为分析纯，水为重蒸馏水。日立638型高效液相色谱仪，紫外分光光度检测器；LG15-10高速微量离心机；SK-1型旋涡混合器；DT-100A分析天平。
1.2 色谱条件 固定相YWG C18(25cm×4.6mm)，固定相为天津第二化学试剂厂产品；流动相，0.01mol/L甲酸铵缓冲液(pH6.2～6.8)；流速：1ml/min；检测波长：UV 254nm；灵敏度0.02 AuFs；室温条件下分析。
1.3 样品处理 静脉取血1～2ml，肝素抗凝，离心分离血浆，混匀后加入5mol/L三氯醋酸70 μl，振摇2min，静置5min，离心20min(10000r/min)，吸取上清液25μl进样。
, 百拇医药 2 结果
2.1 色谱分离效果 以YWGC18为固定相，用0.01mol/L甲酸铵缓冲液洗脱，阿糖胞苷可排除血中成分及其他常用化疗药的干扰达基线分离，保留时间为11min。见图1。
图1 血浆中阿糖胞苷色谱
2.2 血浆中Ara-c标准工作曲线、灵敏度、回收率、精密度 精取空白血浆数份，分别加入不同量的Ara-c标准液，按上法提取测定，得到0.4～12.5mg/L标准曲线，回归方程为Y=0.027X+0.0476 r=0.9996n=5，式中Y为峰高，X为血浆浓度(mg/L)。血浆中Ara-c最低检测浓度为0.05mg/L。同法测定Ara-c的绝对回收率平均为86.4%(n=10)，日内及日间的精度，见表1。
, 百拇医药 表1 Ara-c的日内、日间精度试验 血浆中Ara-c加入量(ml)
n
日内误差
日间误差
±s(mg/L)CV(%)
±s(mg/L)CV(%)
0.4
6
0.371±0.018
, 百拇医药 4.89
0.369±0.015
4.07
2.5
6
2.145±0.049
2.31
2.217±0.106
4.78
12.5
6
11.207±0.195
1.74
, 百拇医药
11.117±0.487
4.38
2.3 Ara-c的稳定性试验 在1ml蒸馏水与含三氯醋酸(5mol/L)70μl的1ml水溶液中，加入100μlAra-c共3份，置普通冰箱中，连续10d分别取样测定，结果表明Ara-c在酸性溶液中稳定。另取血浆数份，分别加入不同量的Ara-c标准液使成2种不同浓度(2.5、5.0mg/L)，按上法提取后，分别于室温中和置-30℃冰箱中连续4d进行测定，结果表明Ara-c在室温25℃中5h或在-30℃下4d，在血浆中浓度基本不变。
2.4 取血后不同时间加入三氯乙酸对血药浓度的影响 为了解血中含有的脱氨酶对阿糖胞苷的降解及考查三氯乙酸对脱氨酶的破坏作用，我们分别于不同时间加入高浓度三氯乙酸处理含Ara-c血样，然后测定血药浓度，具体方法为：采集正常人静脉血(同血型)混合后立即精密吸取1.0ml6份，每管中加入标准Ara-c贮备液(100mg/L)10μl；混合均匀后分别于加入Ara-c后的0.5、15、60min及6、12、24h加入65%三氯乙酸、振荡、混匀后4℃放置3h后离心取上清液-30℃冻存，同时取全血1.0ml4份，每份立即加入65%三氯乙酸后混匀放置1h后加入Ara-c贮备液10μl。旋涡振荡后4℃放置3h离心，上清液供HPLC进样，所测浓度作为1mg/L原始体外未衰减浓度，结果表明：取血后立即及5min内加入去蛋白剂，其血药浓度变化不大，1h后加入三氯乙酸其血药浓度明显下降，6h后再加入三氯乙酸所检测出的Ara-c浓度仅为起始0时的32.8%，放置24h后血中Ara-c90%被降解、转化，见图2。
, 百拇医药
图2 血中Ara-c的体外降解
2.5 人体内Ara-c的药物动力学 患者在滴注完500mgAra-c后，在0、5、10、15、30、60、120、180min各取静脉血1ml，离心后取血浆0.1ml，按上法提取分离后用HPLC法测定血药浓度，其药动学特性可按二室模型描述，其药动学参数平均值为：A：2.29，a：8.62/h，T1/2(α)：0.09h，B：0.76，β：0.21/h，T1/2(β)：3.43h，VC：228.08L，K21：3.05，K10：0.93，K12：4.85。药时曲线见图3。
图3 人体中静注Ara-c后的模拟药时曲线
3 讨论
, 百拇医药
本法在样品预处理中，具有操作简便、分析迅速、灵敏度高、流动相成本低等优点，对Ara-c的血药浓度监测和研究具有一定的实用性，易于推广。
文献报道 Ara-c 在水溶液中其稳定性受pH值的影响较大，在酸性中易脱氨基水解成阿糖胞苷[3]。本文的稳定性试验表明 Ara-c 在酸性提取条件下，25 ℃室温中放置 5 h或-30℃下放 4 d，其浓度基本不变。因此样品的检测应在采血后 5 h内完成或放低温下保存。
Ara-c 在人及动物体内过程有一室模型和二室模型二种结果[7]。从本实验所测得的药动学参数中可以看出， Ara-c 静滴后，在人体内的药动学符合双室模型，与有些文献报道的相符。
血中 Ara-c 检测的一个主要难题是其衰减快，病人取血后在离心、分离等处理过程中将有部分降解致使测定的结果并非真实的血药浓度。现在国外一般采血后立即加入四氢尿嘧啶核苷，国内不生产，进口困难且价格昂贵，我们考虑到脱氨酶作为蛋白质，在高浓度三氯乙酸中易被破坏，而阻止 Ara-c 的代谢研究结果也证明：取血如不马上抑制酶的活性， Ara-c 在体外将继续以较快速度降解，而加入三氯乙酸后阻止了阿糖胞苷的浓度变化。这样处理样本，简单方便，结果稳定。
, 百拇医药
采用本方法检测 Ara-c 血药浓度，其灵敏度、稳定性及重现性均可满足临床血药浓度监测及药代动力学研究的要求，为 Ara-c 的临床药理研究、调整剂量、避免或减少蓄积中毒，显得十分重要。
参考文献
1 孙秉中，袁跃传，杨岚，等. 去甲基柔红毒素联合阿糖胞苷治疗急性非淋巴细胞性白血病疗效观察. 中华内科杂志，1998，37(3)：186～187
2 李希凯，廉洁. 急性非淋巴细胞性白血病缓解后应用小剂量阿糖胞苷维持治疗的疗效观察. 临床肿瘤学杂志，1997，2(2)：77～78
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4 徐兵，周淑芝，刘启发，等. 不同化疗方案治疗老年人急性髓系白血病疗效观察. 中国实用内科杂志，1998，18(3)： 159～161
, http://www.100md.com
5 Bagular BC.Plasma half-life of cytosine arabinoside(NSO-63878) in patients treated for acute myeloblastic leukemia.Cancer Chemother Rep,1971，55：291
6 Liverside GG,Simultaneous analysis of 1-β-D-arabi-nofuranosylcytosine,1-β-D-arabinofuranosyluracil and sodium salicylate in biological samples by HPLC.J Chromatogr,1983，276：375
7 Schilsky RL. Simultaneous determination of cytosine arabinoside,its nucleotider and metabolite by ion-pair high-performance liquid chromatography. J Chromatogr,1985，337：63
[1998-10-22收稿], 百拇医药