大鼠基底前脑NGFR神经元出生后的发育
作者：燕启江 姚志彬* 龙大宏 袁群芳* 陈以慈*
单位：燕启江 龙大宏 广州医学院实验医学研究中心，510182；姚志彬* 袁群芳* 陈以慈* *中山医科大学脑研究室， 510089
关键词：基底前脑；神经生长因子受体；发育；大鼠
大鼠基底前脑NGFR神经元出生后的发育 提要 目的：研究基底前脑神经生长因子受体(NGFR)阳性神经元在出生后早期的发育变化。方法：60只新生大鼠按出生后当天P0、P1、P3、P5、P7、P9、P11、P13、P15和P30天10个时间组进行灌注、固定和取材，每个时间组6只动物，冰冻切片后进行NGFR的免疫组织化学染色。结果：基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核从出生当天即有NGFR阳性细胞出现，这些阳性细胞逐渐发育生长，30天时已基本成熟。结论：基底前脑NGFR神经元在出生后早期的发育有一定的规律。
, 百拇医药
中图分类号 R329.481
Development of NGFR Neurons in
Postnatal Rat Basal Forebrain
YanQijiang ,*Yao Zhibin , Long Dahong ,Yuan Qunfang,Chen Yici
(Research Center of Experimental Medicine, Guangzhou
Medical College, Guangzhou,510182)
(*Division of Brain Research ,Sun Yat-sen University of
, 百拇医药
MedicalSciences ,Guangzhou,510089)
Objective：To explore the developmental regularity of nerve growth factorrecep tor positive neurons in basal forebrain in postnatal rat. Method: 60 rats ,aged from postnatalP0,P1,P3,P5,P7,P9,P11,P13,P15 and P30 were used, 6 rats for each age group. The rats were perfused and postfixed, thebrains were cut on a freezing microtome,the slides were subject to immun ohistochemistry staining of NGFR. Results: NGFRpositive neurons were de tected on P0 in the medial septum, diagonal band of broca, ventral pallidum and magnocellularpreoptic area.NGFR positive neurons gradually grew and differ entiated with the increasement of postnatal age. The NGFRneurons were basically matur ed on P30. Conclusion: There is certain regularity in the development of NGFR ne urons inpostnatal rat basal forebrain.
, http://www.100md.com
Key words：Basal forebrain; Rat; Nerve growth factor receptor(NGFR);Development
基底前脑的胆碱能神经元与学习记忆密切相关，这些胆碱能神经元都是神经生长因子受体阳性神经元[1～3]。在正常生理状态下它们需要由海马逆行转运来的神经 生长因子的营养才能维持正常存活和发挥功能。在发育过程中它们也非常需要神经生长因子的营养来维持其正常发育。基底前脑胆碱能神经元的神经生长因子受体在发育中的变化规律的研究报道尚少，研究神经生长因子受体在生后早期的发育变化对学习记忆的形态学研究有一定的意义。
1 材料和方法
1.1 试剂
小鼠抗大鼠神经生长因子受体(NGFR)单克隆抗体(192-IgG)(Chandler et al,1980) 购于Boehringer MannheimBiochemica公司。抗小鼠抗体ABC过氧化物酶试剂 盒(第二抗)购于Sigma公司(St.Louis USA)。
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1.2 实验动物及组织切片
新生SD大鼠，每个时间点取材6只，按出生后当天(P0)、Pl、P3、P5、P7、P9、 P11、P13、P15和P3010个时间点(年龄组)取材，取60只。在麻醉下经左心室灌注生理盐水冲洗，随后灌注4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(pH 7.4 0.1M)固定。组织取材后，后 固定于上述固定液中2小时，再浸入30%蔗糖0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)中过夜。脑组织浸糖后在半导体冰冻切片机上切片，片厚20μm，浸泡于0.1M PB中，连续取5套切片。其中二套做NGFR免疫组织化学染色及对照。
1.3 NGFR免疫组织化学反应
1.3.1 试剂配制
(1)缓冲液A：0.01MPBS，pH7.4；(2)NGFR第一抗体稀释液：正常羊血清10%(V/V)；2%牛血清白蛋白(W/V)。Triton X-1000.05%(V/V)；以缓冲液A配；(3)第一抗体：抗NGFR抗体(1：30)；(4)第二抗体稀释液：含2%牛血清白蛋白用缓冲液A配；(5)第二抗体：1：200的生物素标记的抗小鼠IgG；(6)第三抗体稀释液：2%牛血清白蛋白以缓冲液A配；(7)第二抗体：1：200的小鼠抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物；(8)显色液：0.05%DAB，0.01%H2O2以缓冲液A配。
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1.3.2 染色程序
切片入1%牛血清白蛋白孵育30分钟，倾去血清入第一抗体液。(1)第一抗体液：玻片在湿盒内孵育24～48小时，4℃；(2)第二抗体液：室温2小时；(3)0.3%H2O2 5～10分钟；(4)第三抗体液：室温2小时；(5)DAB呈色：显色2～7分钟；以上每步骤之间以 0.01MPBS洗，10分钟×3次漂洗。(6)常规脱水、透明，树胶封片。
对照实验切片不加NGFR第一抗体孵育，其它步骤相同。
2 结果
在出生当天，基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核就有神经生长因子受体免疫组化反应阳性细胞染色，NGFR阳性的棕黄色染色在细胞表面里斑点状分布，明显区别与其他免疫组化染色。阳性细胞在斜角带核垂直支及水平支较多，这些细胞的细胞核大，不着色呈空泡状：细胞浆少，仅在胞体一侧深染。阳性突起粗稍短，基本无分支染色(图1)。内侧隔核阳性神经元数量次之，胞体着色略深，细胞核亦较大，偏于一侧，突起短粗，仅在突起近端着色，明显短于斜角带核的突起(图2)。腹侧苍白球及视前大细胞核的阳性神经元数量铰少，染色与斜角带核相似。出生一天后，内侧隔核NGFR阳性神经元数量增多，大多为大神经元，少量为小神经元。大神经元为多极型，胞核大不着色，脑浆少，突起短仅见近端突起阳性。小神经元仅见核周一圈着色。斜角带核垂直支及水平支阳性神经元，胞体形态变的完整，阳性突起也变的较长，可见一、二级分支。出生后第三天，内侧隔核NGFR阳性神经元突起着色较好(图3)，阳性胞体着色有一些深、有一些浅其形态与第30天的染色相似。斜角带核垂直支及水平支的NGFR阳性神经元突起变的更长，而且丰富，可见较多二、三级分支，胞体着色亦较内侧隔核为好。从出生后第五天开始，随着成活时间的延长，基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核神经生长因子受体免疫组化阳性细胞的胞体着色无明显变化，但胞体的体积增大，突起的数量及长度逐渐增加。到出生后第30天NGFR的表达已趋于稳定与成年时染色结构相似。其总体特征是内侧隔核神经生长因子受体阳性细胞染色的突起相对较短和较少，胞体着色亦较斜角带核差一些，斜角带核的突起长而且丰富，胞体着色完整而均匀(图4)。腹侧苍白球及视前大细胞核神经生长因子受体阳性神经元的染色与斜角带核的相似。对照实验染色全部为阴性。
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3 讨论
既往研究发现，在鼠脑神经生长因子受体和胆碱乙酰转移酶有95%～100%的共存[1、2]，在人和灵长类动物脑内亦有类似的共存[3]，故NGFR可以做为基底前脑胆碱能神经元的一个标志。观察神经生长因子受体阳性神经元的发育变化，可以从另一个侧面了解胆碱能神经元的发育规律，以及神经生长因子受体与胆碱能神经元的依存关系。本实验发现，大鼠在出生的当天就有神经生长因子受体的表达，但其斑点状的阳性颗粒分布主要出现在细胞体和突起的近端。随着发育时间的延长，阳性细胞的胞体染色增强，突起的染色也逐渐变长，由一级分支的染色逐渐增加至二到三级分支的阳性染色。这种规律表明，基底前脑胆碱能神经元的NGFR受体在出生后数天的短时间内是在神经元的胞体和突起近端发育，随后才在神经元的树突和轴突上发育，此发育过程与基底前脑胆碱能神经元在出生后的功能发育密切相关，NGFR在此过程中可能发挥了重要的作用[4]。本结果与Springer和Taniu chi的研究结果相似，他们认为细胞信号在神经元的分化和轴突生长过程中发挥重要的作用，在中枢和外周神经的某些区域，神经生长因子受体就参与了这种细胞信号作用[5、6] 。
, 百拇医药
发育到第5天后，神经生长因子受体在神经元上结构分布己基本确定，只是随着胞体增大和突起伸长而略有增加，到30天时其发育已基本成熟，和成年鼠基底前脑的NGFR神经元已无明显差异。从发育过程到成熟后总体来看，基底前脑神经生长因子受体阳性神经元在内侧隔核和斜角带核的差异是：内侧隔核的胆碱能神经元NGFR染色明显弱于斜角带核，提示内侧隔核胆碱能神经元上的神经生长因子受体的数量明显少于斜角带核的。这种现象与成年鼠弯窿-海马伞切断后，基底前脑胆碱能神经元迅速而持续地减少，而且内侧隔核的减少明显多于斜角带核可能有着一定的联系[7、8]。因为内侧隔核胆碱能神 经元上的神经生长因子受体数量明显少于斜角带核的，所以内侧隔核的胆碱能神经元的脆弱性可能较强，对弯隆海-马伞切断后神经生长因子逆转运通路损伤后的伤害表现较重；而斜角带核的胆碱能神经元由于共存了大量的神经生长因子受体，可以相对较多地接受神经生长因子的营养，对损伤的耐受性较强。
参考文献
1 Book AA, Wiley RG, Schweitzer JR.Special of 192 IgG-Saparin for NGF receptor-positive cholinergic basal forebrain neurons in the rat. Brain Res, 1992;590:350
, http://www.100md.com
2 Kiss J, Shooter EM, Pate AJ. A low-affinity Nerve growth factor receptor antibody isinternalized and retrogradely transported selectively into choline rgic neurons of the rat basal forebrain. Neuroscience,1993;57:297
3 Mufson EJ, Bathwell J, Hersh LB, et al. Nerve growth factor receptor inimunoreactive profiles in normal aged human basal forebrain: Colocalization with cholinergic neurons. J CompNeuro,1989;285:196
4 Candan AA William CW. Amyloid procursor protein modulates the interacti onof nerve growth factor with P75 receptor and potentiates its activation of trkA phospharylation . Mol Brain Res,1998;56(1-2):125
, 百拇医药
5 Springer JE. Nerve growth factor receptors in the central nerve system. Exp Neurol,1988;102:354
6 Taniuchi M, Clark HB, Schweitzer JE, and Johnson. Expression of Nerve growth factor receptors by Schwann cells of axotomized peripheral nerves: Ultrast ructural location,suppression by axonal contact,and binding properties. J Neuro sci, 1988 ;8(2):664
7 Batchelor PE, Armstrong DM, Blaker SN, et al.Nerve growth factor recep tor and acetyltransferase co-lacalizition in neurons within the rat forebrain r esponse tofimbria-fornix transection. J Comp Neurol, 1989;284:187
8 龙大宏，姚志彬，何蕴韶等.神经生长因子(NGF)对基底前脑NGF-受体阳性神经元损伤后的保护作用.神经解剖学杂志，1995；11(1)：13
(收稿：1998-12-05), 百拇医药(作者：燕启江 姚志彬* 龙大宏 袁群芳* 陈以慈*)
单位：燕启江 龙大宏 广州医学院实验医学研究中心，510182；姚志彬* 袁群芳* 陈以慈* *中山医科大学脑研究室， 510089
关键词：基底前脑；神经生长因子受体；发育；大鼠
大鼠基底前脑NGFR神经元出生后的发育 提要 目的：研究基底前脑神经生长因子受体(NGFR)阳性神经元在出生后早期的发育变化。方法：60只新生大鼠按出生后当天P0、P1、P3、P5、P7、P9、P11、P13、P15和P30天10个时间组进行灌注、固定和取材，每个时间组6只动物，冰冻切片后进行NGFR的免疫组织化学染色。结果：基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核从出生当天即有NGFR阳性细胞出现，这些阳性细胞逐渐发育生长，30天时已基本成熟。结论：基底前脑NGFR神经元在出生后早期的发育有一定的规律。
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中图分类号 R329.481
Development of NGFR Neurons in
Postnatal Rat Basal Forebrain
YanQijiang ,*Yao Zhibin , Long Dahong ,Yuan Qunfang,Chen Yici
(Research Center of Experimental Medicine, Guangzhou
Medical College, Guangzhou,510182)
(*Division of Brain Research ,Sun Yat-sen University of
, 百拇医药
MedicalSciences ,Guangzhou,510089)
Objective：To explore the developmental regularity of nerve growth factorrecep tor positive neurons in basal forebrain in postnatal rat. Method: 60 rats ,aged from postnatalP0,P1,P3,P5,P7,P9,P11,P13,P15 and P30 were used, 6 rats for each age group. The rats were perfused and postfixed, thebrains were cut on a freezing microtome,the slides were subject to immun ohistochemistry staining of NGFR. Results: NGFRpositive neurons were de tected on P0 in the medial septum, diagonal band of broca, ventral pallidum and magnocellularpreoptic area.NGFR positive neurons gradually grew and differ entiated with the increasement of postnatal age. The NGFRneurons were basically matur ed on P30. Conclusion: There is certain regularity in the development of NGFR ne urons inpostnatal rat basal forebrain.
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Key words：Basal forebrain; Rat; Nerve growth factor receptor(NGFR);Development
基底前脑的胆碱能神经元与学习记忆密切相关，这些胆碱能神经元都是神经生长因子受体阳性神经元[1～3]。在正常生理状态下它们需要由海马逆行转运来的神经 生长因子的营养才能维持正常存活和发挥功能。在发育过程中它们也非常需要神经生长因子的营养来维持其正常发育。基底前脑胆碱能神经元的神经生长因子受体在发育中的变化规律的研究报道尚少，研究神经生长因子受体在生后早期的发育变化对学习记忆的形态学研究有一定的意义。
1 材料和方法
1.1 试剂
小鼠抗大鼠神经生长因子受体(NGFR)单克隆抗体(192-IgG)(Chandler et al,1980) 购于Boehringer MannheimBiochemica公司。抗小鼠抗体ABC过氧化物酶试剂 盒(第二抗)购于Sigma公司(St.Louis USA)。
, http://www.100md.com
1.2 实验动物及组织切片
新生SD大鼠，每个时间点取材6只，按出生后当天(P0)、Pl、P3、P5、P7、P9、 P11、P13、P15和P3010个时间点(年龄组)取材，取60只。在麻醉下经左心室灌注生理盐水冲洗，随后灌注4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(pH 7.4 0.1M)固定。组织取材后，后 固定于上述固定液中2小时，再浸入30%蔗糖0.1M磷酸缓冲液(pH 7.4)中过夜。脑组织浸糖后在半导体冰冻切片机上切片，片厚20μm，浸泡于0.1M PB中，连续取5套切片。其中二套做NGFR免疫组织化学染色及对照。
1.3 NGFR免疫组织化学反应
1.3.1 试剂配制
(1)缓冲液A：0.01MPBS，pH7.4；(2)NGFR第一抗体稀释液：正常羊血清10%(V/V)；2%牛血清白蛋白(W/V)。Triton X-1000.05%(V/V)；以缓冲液A配；(3)第一抗体：抗NGFR抗体(1：30)；(4)第二抗体稀释液：含2%牛血清白蛋白用缓冲液A配；(5)第二抗体：1：200的生物素标记的抗小鼠IgG；(6)第三抗体稀释液：2%牛血清白蛋白以缓冲液A配；(7)第二抗体：1：200的小鼠抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶复合物；(8)显色液：0.05%DAB，0.01%H2O2以缓冲液A配。
, http://www.100md.com
1.3.2 染色程序
切片入1%牛血清白蛋白孵育30分钟，倾去血清入第一抗体液。(1)第一抗体液：玻片在湿盒内孵育24～48小时，4℃；(2)第二抗体液：室温2小时；(3)0.3%H2O2 5～10分钟；(4)第三抗体液：室温2小时；(5)DAB呈色：显色2～7分钟；以上每步骤之间以 0.01MPBS洗，10分钟×3次漂洗。(6)常规脱水、透明，树胶封片。
对照实验切片不加NGFR第一抗体孵育，其它步骤相同。
2 结果
在出生当天，基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核就有神经生长因子受体免疫组化反应阳性细胞染色，NGFR阳性的棕黄色染色在细胞表面里斑点状分布，明显区别与其他免疫组化染色。阳性细胞在斜角带核垂直支及水平支较多，这些细胞的细胞核大，不着色呈空泡状：细胞浆少，仅在胞体一侧深染。阳性突起粗稍短，基本无分支染色(图1)。内侧隔核阳性神经元数量次之，胞体着色略深，细胞核亦较大，偏于一侧，突起短粗，仅在突起近端着色，明显短于斜角带核的突起(图2)。腹侧苍白球及视前大细胞核的阳性神经元数量铰少，染色与斜角带核相似。出生一天后，内侧隔核NGFR阳性神经元数量增多，大多为大神经元，少量为小神经元。大神经元为多极型，胞核大不着色，脑浆少，突起短仅见近端突起阳性。小神经元仅见核周一圈着色。斜角带核垂直支及水平支阳性神经元，胞体形态变的完整，阳性突起也变的较长，可见一、二级分支。出生后第三天，内侧隔核NGFR阳性神经元突起着色较好(图3)，阳性胞体着色有一些深、有一些浅其形态与第30天的染色相似。斜角带核垂直支及水平支的NGFR阳性神经元突起变的更长，而且丰富，可见较多二、三级分支，胞体着色亦较内侧隔核为好。从出生后第五天开始，随着成活时间的延长，基底前脑内侧隔核、斜角带核、腹侧苍白球及视前大细胞核神经生长因子受体免疫组化阳性细胞的胞体着色无明显变化，但胞体的体积增大，突起的数量及长度逐渐增加。到出生后第30天NGFR的表达已趋于稳定与成年时染色结构相似。其总体特征是内侧隔核神经生长因子受体阳性细胞染色的突起相对较短和较少，胞体着色亦较斜角带核差一些，斜角带核的突起长而且丰富，胞体着色完整而均匀(图4)。腹侧苍白球及视前大细胞核神经生长因子受体阳性神经元的染色与斜角带核的相似。对照实验染色全部为阴性。
, 百拇医药
3 讨论
既往研究发现，在鼠脑神经生长因子受体和胆碱乙酰转移酶有95%～100%的共存[1、2]，在人和灵长类动物脑内亦有类似的共存[3]，故NGFR可以做为基底前脑胆碱能神经元的一个标志。观察神经生长因子受体阳性神经元的发育变化，可以从另一个侧面了解胆碱能神经元的发育规律，以及神经生长因子受体与胆碱能神经元的依存关系。本实验发现，大鼠在出生的当天就有神经生长因子受体的表达，但其斑点状的阳性颗粒分布主要出现在细胞体和突起的近端。随着发育时间的延长，阳性细胞的胞体染色增强，突起的染色也逐渐变长，由一级分支的染色逐渐增加至二到三级分支的阳性染色。这种规律表明，基底前脑胆碱能神经元的NGFR受体在出生后数天的短时间内是在神经元的胞体和突起近端发育，随后才在神经元的树突和轴突上发育，此发育过程与基底前脑胆碱能神经元在出生后的功能发育密切相关，NGFR在此过程中可能发挥了重要的作用[4]。本结果与Springer和Taniu chi的研究结果相似，他们认为细胞信号在神经元的分化和轴突生长过程中发挥重要的作用，在中枢和外周神经的某些区域，神经生长因子受体就参与了这种细胞信号作用[5、6] 。
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发育到第5天后，神经生长因子受体在神经元上结构分布己基本确定，只是随着胞体增大和突起伸长而略有增加，到30天时其发育已基本成熟，和成年鼠基底前脑的NGFR神经元已无明显差异。从发育过程到成熟后总体来看，基底前脑神经生长因子受体阳性神经元在内侧隔核和斜角带核的差异是：内侧隔核的胆碱能神经元NGFR染色明显弱于斜角带核，提示内侧隔核胆碱能神经元上的神经生长因子受体的数量明显少于斜角带核的。这种现象与成年鼠弯窿-海马伞切断后，基底前脑胆碱能神经元迅速而持续地减少，而且内侧隔核的减少明显多于斜角带核可能有着一定的联系[7、8]。因为内侧隔核胆碱能神 经元上的神经生长因子受体数量明显少于斜角带核的，所以内侧隔核的胆碱能神经元的脆弱性可能较强，对弯隆海-马伞切断后神经生长因子逆转运通路损伤后的伤害表现较重；而斜角带核的胆碱能神经元由于共存了大量的神经生长因子受体，可以相对较多地接受神经生长因子的营养，对损伤的耐受性较强。
参考文献
1 Book AA, Wiley RG, Schweitzer JR.Special of 192 IgG-Saparin for NGF receptor-positive cholinergic basal forebrain neurons in the rat. Brain Res, 1992;590:350
, http://www.100md.com
2 Kiss J, Shooter EM, Pate AJ. A low-affinity Nerve growth factor receptor antibody isinternalized and retrogradely transported selectively into choline rgic neurons of the rat basal forebrain. Neuroscience,1993;57:297
3 Mufson EJ, Bathwell J, Hersh LB, et al. Nerve growth factor receptor inimunoreactive profiles in normal aged human basal forebrain: Colocalization with cholinergic neurons. J CompNeuro,1989;285:196
4 Candan AA William CW. Amyloid procursor protein modulates the interacti onof nerve growth factor with P75 receptor and potentiates its activation of trkA phospharylation . Mol Brain Res,1998;56(1-2):125
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5 Springer JE. Nerve growth factor receptors in the central nerve system. Exp Neurol,1988;102:354
6 Taniuchi M, Clark HB, Schweitzer JE, and Johnson. Expression of Nerve growth factor receptors by Schwann cells of axotomized peripheral nerves: Ultrast ructural location,suppression by axonal contact,and binding properties. J Neuro sci, 1988 ;8(2):664
7 Batchelor PE, Armstrong DM, Blaker SN, et al.Nerve growth factor recep tor and acetyltransferase co-lacalizition in neurons within the rat forebrain r esponse tofimbria-fornix transection. J Comp Neurol, 1989;284:187
8 龙大宏，姚志彬，何蕴韶等.神经生长因子(NGF)对基底前脑NGF-受体阳性神经元损伤后的保护作用.神经解剖学杂志，1995；11(1)：13
(收稿：1998-12-05), 百拇医药(作者：燕启江 姚志彬* 龙大宏 袁群芳* 陈以慈*)