大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡
作者：余 擎 吴补领 肖明振 史俊南 赵书芳
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：细胞凋亡；牙髓炎；原位末端标记；大鼠
大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡 摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中细胞凋亡现象，探讨细胞凋亡在牙髓炎病理变化中的作用。方法：16只SD大鼠的磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，分别于1d、3d、5d、7d取材，常规制备石蜡切片，行HE染色和TUNEL法检测。结果：正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞均发现有凋亡细胞；炎症牙髓中炎细胞聚集区未发现典型的凋亡细胞，而在其周边发现有较典型的凋亡细胞，在其正常组织中也有散在的凋亡细胞存在。结论：正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞凋亡，细胞凋亡在牙髓炎的转归和预后方面可能有一定的作用。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0052-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：52]
Apoptosis in rat normal and inflammatory dental pulp
Yu Qing, Wu Buling, Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aims: To establish a model of rat endotoxic pulpitis. To observe the phenomena of apoptosis in rat normal and inflammatory dental pulp in situ, and to explore the impact of apoptosis on pulpitis. Methods: Sixteen rat molars by application of LPS were removed from the jaws after 24h、72h、120h and 168h respectively. They were stained with Hematoxylin-Eosin and were detected by in situ terminal nick end labeling. Results: In normal dental pulp some odontoblasts and some pulp cells were labeled, mostly in the periphery of the pulp. In inflammatory dental pulp, most inflammatory cells were unlabeled, a few apoptotic cells were observed in the normal pulp, and there were some apoptotic cells displayed a wall between the inflammatory area and the normal area. Conclusions: Apoptosis are found in rat normal and inflammatory dental pulp, and it may have a important role in pulpitis.
, 百拇医药
Key words apoptosis；pulpitis；TUNEL method；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):52]
细胞凋亡是多细胞生物体中广泛发生的正常的细胞生理死亡过程，用于清除不需要的细胞或对自身有害的细胞。恶性肿瘤、自身免疫性疾病、获得性免疫缺陷综合征、退行性变等许多人类重要的疾病都与细胞凋亡机制异常密切相关[1]，随着凋亡的中性粒细胞被吞噬清除现象的发现，炎症与细胞凋亡间的关系也越来越受关注。近两年法国学者发现正常牙髓中存在细胞凋亡[2，3]，那么作为我国口腔内科的常见病——牙髓炎，细胞凋亡现象是否存在？与牙髓炎的发生发展有何关系？现将本研究的初步结果报道如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物模型的制备
参见余擎的报道[4]，选用LPS法建立的牙髓炎模型。
1.2 HE染色组织中凋亡细胞的识别
在HE染色的组织切片上光镜检查能识别典型的凋亡细胞，其形态特征为：①胞浆弱嗜伊红(嗜酸性变)；②细胞收缩变小，可与周围细胞分离；③核染色质沿核膜浓缩呈环状或新月状和(或)核片段化，且至少具备两个以上条件方可确定为凋亡细胞[5]。
1.3 原位末端标记
参照德国宝灵曼(Boehringer Mannhelm)公司1998年细胞凋亡试剂盒的说明书,具体步骤如下：切片脱蜡至水，蛋白酶K室温30min，加TUNEL反应液37℃60min，加标有碱性磷酸酶的抗荧光素抗体37℃30min，再加NBT/BCIP显色15min，伊红复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照用标记液代替TUNEL反应液。
, http://www.100md.com
2 结果
HE染色镜下能观察到正常牙髓的成牙本质细胞中有一些较典型的凋亡细胞，在牙髓细胞中也能发现这种形态的细胞，且多位于牙髓的外围。炎症牙髓中HE染色未能区分出典型的凋亡细胞。
TUNEL检测法中细胞核2/3为蓝紫色颗粒，核固缩，细胞呈圆形者即为凋亡细胞。正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞中均有一些阳性细胞，且越靠近牙髓外周阳性细胞就越密集(图1，2)。在炎症牙髓中1d组的阳性细胞分布与正常牙髓相似，只是越靠近穿髓点阳性细胞越多；3d组、5d组、7d组的阳性细胞随着时间的推移逐渐减少，5d组和7d组穿髓点下方出现大片的坏死区和炎细胞高度密集区，这些部位都呈较均匀的深蓝色，无凋亡细胞的形态，为非特异性着色；在非特异性着色与根髓正常组织的交界处可见一些阳性细胞(图3)，呈弧型围绕非特异性着色区，可能为一些炎细胞和成纤维细胞，其下方的正常组织阳性细胞增多(图4)。所有的阴性对照标本均未着色.
, 百拇医药
图1 正常牙髓中成牙本质细胞TUNEL阳性 (40×10)
图2 正常牙髓冠髓外周有散在的TUNEL阳性细胞 (40×10)
图3 5d组，炎症牙髓在坏死区与正常组织交界处有凋亡细胞 (40×10)
, 百拇医药
图4 7d组，在炎症牙髓炎症下方牙髓中凋亡细胞增多 (40×10)
3 讨论
有核细胞一方面存在受遗传控制的细胞分裂、增殖的功能，另一方面也具有使细胞主动发生死亡的机制，即细胞凋亡(apoptosis), 又称细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，二者之间的动态平衡维持着多细胞组织的内环境稳定。因此，细胞凋亡是生命过程中不可缺少的组成内容，是多细胞生物籍以存活的需要，贯穿于生物全部生命活动中。近来法国学者Vermelin等发现正常的牙髓组织中存在细胞凋亡，其主要分布于牙髓的周边，尤其是成牙本质细胞下层，且冠髓明显多于根髓，但在成牙本质细胞层却未见阳性细胞[2]。不久前又一名法国学者Franquin采用先进的计算机三维图像分析系统发现人的牙髓在增龄过程中，成牙本质细胞的总数是逐渐减少的，并发现成牙本质细胞层中有TUNEL染色阳性的凋亡细胞[3]。本研究发现正常牙髓中存在细胞凋亡，且牙髓的周边多于中央区，该结果与两位法国学者的结果一致，而成牙本质细胞层中凋亡细胞的发现却支持Franquin的观点，与Vermelin的结果相反，说明成牙本质细胞数目的减少是通过细胞凋亡的方式得以清除的，从而维持了牙髓组织内环境的稳定。
, 百拇医药
炎症反应是机体对伤害刺激正常防御反应的一部分，中性粒细胞是炎症反应的重要标志，在炎症的发生、发展和转归中起着至关重要的作用，其它如淋巴细胞和浆细胞，还有被有害的病原微生物和其它有害物质侵袭破坏的组织细胞，这些细胞如果未得到及时清除，就可以在炎症部位坏死分解，释放毒性内容物或产生趋化因子而加重局部组织的损害。凋亡作为一种正常的细胞生理死亡方式，区别于坏死的重要之点，就是凋亡的细胞能被巨噬细胞或周围组织细胞平稳识别清除而不引发炎症反应，因此有学者认为通过凋亡方式清除炎症灶内的中性粒细胞和其它滞留细胞，是限制组织损伤，促进炎症吸收的重要机制。本研究发现在实验性牙髓炎中炎细胞大量聚集的区域未见凋亡细胞，TUNEL染色为非特异性着色，说明牙髓炎过程中大量的炎细胞不发生凋亡，换句话说，不能通过细胞凋亡的方式得以清除，这样其分解释放的产物就不可避免地加重了局部组织的损害，使炎症不易于控制，最终牙髓坏死。曾经认为，位于髓腔内的牙髓组织在炎症时，因其缺乏侧支循环，血管壁薄，易于扩张和充血、渗出，髓腔内压力增高，导致血循环障碍而出现坏死，即所谓“自身扼杀”。近来，文玲英等国内外学者认为“自身扼杀”理论不能成立[6]。牙髓炎中细胞凋亡的发现能否成为研究牙髓炎疾病的一条新途径，尚待进一步的研究和探讨。此外，在炎症区和正常组织区交界处发现有一些成弧型排列的凋亡细胞，提示牙髓组织有一定的自身防御能力，对于外界刺激影响的细胞它还是能够启动凋亡机制设法清除，控制炎症的发展。从本实验模型4个时间点的结果来看，牙髓组织的这种自身防御能力又是相当有限的，这对活髓保存中如何激发牙髓的自身修复潜能可能会有一点启示。
, 百拇医药
TUNEL法是目前检测细胞凋亡最常用的方法，它具有灵敏度高(可检测单细胞的早期凋亡)、特异性强(可区分凋亡和坏死)、快速简便等优点，可适用于细胞和组织切片，但在具体实验中必须注意一些问题，才能对结果进行全面地分析。①由于任何角度的切片都只能观察到少部分的凋亡细胞，这样会低估细胞凋亡的数目，因此需要观察连续切片的标记结果，最好通过计算机进行三维重建。②细胞凋亡是一个动态的过程，凋亡细胞在几个小时内就被邻近的细胞或巨噬细胞吞噬[7]，因此我们观察的结果只能是某一特定时间点的结果。③处于坏死后期的细胞会出现假阳性。
参考文献
1 Steller H .Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995，267(5203):1445
2 Vermelin L, Lecolle S, Septier D et al. Apoptosis in human and rat dental pulp. Eur J Oral Sci, 1996，104:547
, 百拇医药
3 Franquin JC, Remusat M, Abou Hashieh I et al. Immunocytochemical detection of apoptosis in human odontoblasts. Eur J Oral Sci, 1998，106(suppl 1):384
4 余擎，吴补领，肖明振等. 内毒素脂多糖等方法刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：49
5 Kerr JFR, Winterford CM, Harman BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994，73:2013
6 文玲英，吴海珍. 现代牙髓免疫学. 安徽科学技术出版社, 1998.3
7 Bursch W, Kleine L, Tenniswood M. The biochemistry of cell death by apoptosis. Biochem Cell Biol, 1990，88:1073
收稿日期：1998-10-12
修回日期：1998-12-20, 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院，陕西 西安 710032
关键词：细胞凋亡；牙髓炎；原位末端标记；大鼠
大鼠正常牙髓和炎症牙髓中的细胞凋亡 摘要 目的：建立大鼠实验性牙髓炎模型；原位观察大鼠正常牙髓和炎症牙髓中细胞凋亡现象，探讨细胞凋亡在牙髓炎病理变化中的作用。方法：16只SD大鼠的磨牙采用内毒素化学诱导法建立牙髓炎模型，分别于1d、3d、5d、7d取材，常规制备石蜡切片，行HE染色和TUNEL法检测。结果：正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞均发现有凋亡细胞；炎症牙髓中炎细胞聚集区未发现典型的凋亡细胞，而在其周边发现有较典型的凋亡细胞，在其正常组织中也有散在的凋亡细胞存在。结论：正常牙髓和炎症牙髓中存在细胞凋亡，细胞凋亡在牙髓炎的转归和预后方面可能有一定的作用。
中图号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1005-2593(1999)01-0052-03
, 百拇医药
[牙体牙髓牙周病学杂志，1999，9(1)：52]
Apoptosis in rat normal and inflammatory dental pulp
Yu Qing, Wu Buling, Xiao Mingzhen et al
School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032
Abstract Aims: To establish a model of rat endotoxic pulpitis. To observe the phenomena of apoptosis in rat normal and inflammatory dental pulp in situ, and to explore the impact of apoptosis on pulpitis. Methods: Sixteen rat molars by application of LPS were removed from the jaws after 24h、72h、120h and 168h respectively. They were stained with Hematoxylin-Eosin and were detected by in situ terminal nick end labeling. Results: In normal dental pulp some odontoblasts and some pulp cells were labeled, mostly in the periphery of the pulp. In inflammatory dental pulp, most inflammatory cells were unlabeled, a few apoptotic cells were observed in the normal pulp, and there were some apoptotic cells displayed a wall between the inflammatory area and the normal area. Conclusions: Apoptosis are found in rat normal and inflammatory dental pulp, and it may have a important role in pulpitis.
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Key words apoptosis；pulpitis；TUNEL method；rat
[Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):52]
细胞凋亡是多细胞生物体中广泛发生的正常的细胞生理死亡过程，用于清除不需要的细胞或对自身有害的细胞。恶性肿瘤、自身免疫性疾病、获得性免疫缺陷综合征、退行性变等许多人类重要的疾病都与细胞凋亡机制异常密切相关[1]，随着凋亡的中性粒细胞被吞噬清除现象的发现，炎症与细胞凋亡间的关系也越来越受关注。近两年法国学者发现正常牙髓中存在细胞凋亡[2，3]，那么作为我国口腔内科的常见病——牙髓炎，细胞凋亡现象是否存在？与牙髓炎的发生发展有何关系？现将本研究的初步结果报道如下。
1 材料和方法
, 百拇医药
1.1 动物模型的制备
参见余擎的报道[4]，选用LPS法建立的牙髓炎模型。
1.2 HE染色组织中凋亡细胞的识别
在HE染色的组织切片上光镜检查能识别典型的凋亡细胞，其形态特征为：①胞浆弱嗜伊红(嗜酸性变)；②细胞收缩变小，可与周围细胞分离；③核染色质沿核膜浓缩呈环状或新月状和(或)核片段化，且至少具备两个以上条件方可确定为凋亡细胞[5]。
1.3 原位末端标记
参照德国宝灵曼(Boehringer Mannhelm)公司1998年细胞凋亡试剂盒的说明书,具体步骤如下：切片脱蜡至水，蛋白酶K室温30min，加TUNEL反应液37℃60min，加标有碱性磷酸酶的抗荧光素抗体37℃30min，再加NBT/BCIP显色15min，伊红复染，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察。阴性对照用标记液代替TUNEL反应液。
, http://www.100md.com
2 结果
HE染色镜下能观察到正常牙髓的成牙本质细胞中有一些较典型的凋亡细胞，在牙髓细胞中也能发现这种形态的细胞，且多位于牙髓的外围。炎症牙髓中HE染色未能区分出典型的凋亡细胞。
TUNEL检测法中细胞核2/3为蓝紫色颗粒，核固缩，细胞呈圆形者即为凋亡细胞。正常牙髓中成牙本质细胞和牙髓细胞中均有一些阳性细胞，且越靠近牙髓外周阳性细胞就越密集(图1，2)。在炎症牙髓中1d组的阳性细胞分布与正常牙髓相似，只是越靠近穿髓点阳性细胞越多；3d组、5d组、7d组的阳性细胞随着时间的推移逐渐减少，5d组和7d组穿髓点下方出现大片的坏死区和炎细胞高度密集区，这些部位都呈较均匀的深蓝色，无凋亡细胞的形态，为非特异性着色；在非特异性着色与根髓正常组织的交界处可见一些阳性细胞(图3)，呈弧型围绕非特异性着色区，可能为一些炎细胞和成纤维细胞，其下方的正常组织阳性细胞增多(图4)。所有的阴性对照标本均未着色.
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图1 正常牙髓中成牙本质细胞TUNEL阳性 (40×10)
图2 正常牙髓冠髓外周有散在的TUNEL阳性细胞 (40×10)
图3 5d组，炎症牙髓在坏死区与正常组织交界处有凋亡细胞 (40×10)
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图4 7d组，在炎症牙髓炎症下方牙髓中凋亡细胞增多 (40×10)
3 讨论
有核细胞一方面存在受遗传控制的细胞分裂、增殖的功能，另一方面也具有使细胞主动发生死亡的机制，即细胞凋亡(apoptosis), 又称细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)，二者之间的动态平衡维持着多细胞组织的内环境稳定。因此，细胞凋亡是生命过程中不可缺少的组成内容，是多细胞生物籍以存活的需要，贯穿于生物全部生命活动中。近来法国学者Vermelin等发现正常的牙髓组织中存在细胞凋亡，其主要分布于牙髓的周边，尤其是成牙本质细胞下层，且冠髓明显多于根髓，但在成牙本质细胞层却未见阳性细胞[2]。不久前又一名法国学者Franquin采用先进的计算机三维图像分析系统发现人的牙髓在增龄过程中，成牙本质细胞的总数是逐渐减少的，并发现成牙本质细胞层中有TUNEL染色阳性的凋亡细胞[3]。本研究发现正常牙髓中存在细胞凋亡，且牙髓的周边多于中央区，该结果与两位法国学者的结果一致，而成牙本质细胞层中凋亡细胞的发现却支持Franquin的观点，与Vermelin的结果相反，说明成牙本质细胞数目的减少是通过细胞凋亡的方式得以清除的，从而维持了牙髓组织内环境的稳定。
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炎症反应是机体对伤害刺激正常防御反应的一部分，中性粒细胞是炎症反应的重要标志，在炎症的发生、发展和转归中起着至关重要的作用，其它如淋巴细胞和浆细胞，还有被有害的病原微生物和其它有害物质侵袭破坏的组织细胞，这些细胞如果未得到及时清除，就可以在炎症部位坏死分解，释放毒性内容物或产生趋化因子而加重局部组织的损害。凋亡作为一种正常的细胞生理死亡方式，区别于坏死的重要之点，就是凋亡的细胞能被巨噬细胞或周围组织细胞平稳识别清除而不引发炎症反应，因此有学者认为通过凋亡方式清除炎症灶内的中性粒细胞和其它滞留细胞，是限制组织损伤，促进炎症吸收的重要机制。本研究发现在实验性牙髓炎中炎细胞大量聚集的区域未见凋亡细胞，TUNEL染色为非特异性着色，说明牙髓炎过程中大量的炎细胞不发生凋亡，换句话说，不能通过细胞凋亡的方式得以清除，这样其分解释放的产物就不可避免地加重了局部组织的损害，使炎症不易于控制，最终牙髓坏死。曾经认为，位于髓腔内的牙髓组织在炎症时，因其缺乏侧支循环，血管壁薄，易于扩张和充血、渗出，髓腔内压力增高，导致血循环障碍而出现坏死，即所谓“自身扼杀”。近来，文玲英等国内外学者认为“自身扼杀”理论不能成立[6]。牙髓炎中细胞凋亡的发现能否成为研究牙髓炎疾病的一条新途径，尚待进一步的研究和探讨。此外，在炎症区和正常组织区交界处发现有一些成弧型排列的凋亡细胞，提示牙髓组织有一定的自身防御能力，对于外界刺激影响的细胞它还是能够启动凋亡机制设法清除，控制炎症的发展。从本实验模型4个时间点的结果来看，牙髓组织的这种自身防御能力又是相当有限的，这对活髓保存中如何激发牙髓的自身修复潜能可能会有一点启示。
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TUNEL法是目前检测细胞凋亡最常用的方法，它具有灵敏度高(可检测单细胞的早期凋亡)、特异性强(可区分凋亡和坏死)、快速简便等优点，可适用于细胞和组织切片，但在具体实验中必须注意一些问题，才能对结果进行全面地分析。①由于任何角度的切片都只能观察到少部分的凋亡细胞，这样会低估细胞凋亡的数目，因此需要观察连续切片的标记结果，最好通过计算机进行三维重建。②细胞凋亡是一个动态的过程，凋亡细胞在几个小时内就被邻近的细胞或巨噬细胞吞噬[7]，因此我们观察的结果只能是某一特定时间点的结果。③处于坏死后期的细胞会出现假阳性。
参考文献
1 Steller H .Mechanisms and genes of cellular suicide. Science, 1995，267(5203):1445
2 Vermelin L, Lecolle S, Septier D et al. Apoptosis in human and rat dental pulp. Eur J Oral Sci, 1996，104:547
, 百拇医药
3 Franquin JC, Remusat M, Abou Hashieh I et al. Immunocytochemical detection of apoptosis in human odontoblasts. Eur J Oral Sci, 1998，106(suppl 1):384
4 余擎，吴补领，肖明振等. 内毒素脂多糖等方法刺激大鼠牙髓的组织病理学反应. 牙体牙髓牙周病学杂志, 1999，9(1)：49
5 Kerr JFR, Winterford CM, Harman BV. Apoptosis: its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994，73:2013
6 文玲英，吴海珍. 现代牙髓免疫学. 安徽科学技术出版社, 1998.3
7 Bursch W, Kleine L, Tenniswood M. The biochemistry of cell death by apoptosis. Biochem Cell Biol, 1990，88:1073
收稿日期：1998-10-12
修回日期：1998-12-20, 百拇医药