我国彝族另一新的DR15(2)等位基因的核苷酸序列分析
作者：蒋伟宏 邹嫣琼 林标扬 陆嫣 费虹明 陈仁彪
单位：200025 上海第二医科大学生物学教研室
关键词：HLA抗原；聚合酶链反应；彝族；碱基序列
中华微生物学和免疫学杂志990229 【 摘要 】 目的 对在用PCR/SSO方法作我国彝族群体样本HLA D区寡核苷酸分型中发现的1例DRB1的杂合子进行等位基因序列分析。 方法 用DRB基因类引物扩增该特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。扩增产物经纯化转染大肠杆菌JM101，克隆后再经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。 结果 彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的DRB1基因阳性克隆，经序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2(暂定)等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC。 结论 在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)。在我国这样一个多民族国家中，就HLA系统而言，可能还有更多新等位基因有待鉴定。这样有助于完善群体遗传资料。
, 百拇医药
Nucleotide sequence of another novel DR15(2) allele in Yi Nationality Chinese JIANG Weihong,ZOU Yanqiong,LIN Biaoyang,et al.Department of Biology, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025
【 Abstract 】 Objective One special DRB1 heterozygote which was found in oligotyping of HLA D region in Chinese Yi population by using PCR/SSO method, was to be sequenced for the gene of the allele. Methods Amplification of exon 2 of DRB gene in this heterozygote was carried out with genomic DNA templet and generic primers and the amplicon was cloned in M13 for further sequencing. Results One allele was identified as DRB1*1202, another allele whose PCR/SSO hybridization pattern was similar to but different from DRB1*1502 was considered as DRB1*15 variant. Analysis of nucleotide sequence revealed that this allelic variant differed from DRB1*1502 at codon 47 (TAC instead of TTC), resulting in the substitution of a tyrosine for phenylalanine in the DRβ chain. Conclusion The DRB1 heterozygote allele gene could be nominated as DRB1*15Y2 temporarily.
, 百拇医药
【 Subject words 】 HLA antigen Polymerace chain reaction Chinese Yi Base sequenc
HLAⅡ类分子受控于HLA D区基因，主要包括DR、DQ和DP3个亚区。DR亚区的高度多态性归结于DRB基因，至今已鉴定有DRB1、DRB3、DRB4和DRB5基因座及几个假基因。因此，HLA分型已由血清学、细胞学的抗原特异性深入到DNA水平上的等位基因判别。国际上对这些基因座的等位基因进行了详细的群体研究，最终根据序列测定结果由WHO HLA 系统命名委员会正式命名。血清学分型的DR2有DR15和DR16两个亚型，DNA分型及序列分析已鉴定DRB1*1501-DRB1*1506和DRB1*1601-DRB1*1605、DRB1*1607、DRB1*1608等13个等位基因和11个DRB5等位基因〔1-3〕。我国是一个多民族国家，南北地区的汉族和少数民族间的HLA等位基因频率均有很大差异〔5〕。在对云南彝族样本进行HLA-DR亚区寡核苷酸分型中，费虹明等〔6〕发现了一个新的DR15(2)等位基因，经鉴定后与当时WHO命名委员会正式命名为DRB1*1504一致〔4〕，在我国为首次发现。本文报道在彝族样本中另有一例特殊的DRB1杂合子，其中一个等位基因是DRB1*1202，而另一等位基因的反应格局与已有的DR15(2)反应格局不同，可能是另一个新的等位基因。我们用DRB基因的类(generic)引物扩增该例杂合子细胞DR基因的第二外显子，对扩增产物进行克隆和序列测定，确认是另一新的DR15(2)等位基因，暂称之为DRB*15Y2。
, 百拇医药
材料与方法
1.PCR扩增：用国际组织相容性会议提供的DRB基因类引物(DRBAMP-A：CCCCACAGCACGTTTCTTG；DRBAMP-B：CCGCTGCACTGTGAAGCTCT)扩增特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。
2.扩增产物的克隆：扩增产物经纯化后通过T4连接酶连接于已用SamⅠ切成平整末端的M13mp18,转染大肠杆菌JM101，用β-半乳糖苷酶系统筛选含插入片段的阳性白色菌落。
3.序列分析：将阳性菌落在培养液中37℃培养过夜。12 000×g离心后取上清液，加入PEG-8000，冰浴后再次12 000×g离心10分钟，沉淀溶于TE缓冲液，经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。
结 果
, http://www.100md.com
彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的基因组DNA经DRB基因的类引物扩增后并克隆。经筛选，分别获得了DRB1、DRB3和DRB5基因的阳性克隆。序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型〔7〕一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC(图1)。该例细胞中DRB5基因为DRB5*02等位基因，但DRB3基因序列亦与已知者有差异(另文报道)。
图1 DRB1*15Y2和DRB1*1501-1506各等位基因第二外显子的核苷酸序列
Fig 1. The exon 2 nucleotide sequence of DRB1*15Y2 aligned with other DRB1*1501-1506 alleles
讨 论
, 百拇医药
HLA系统在人类基因组中具有高度多态性，可以作为遗传标志来研究人类的起源和迁移，在临床上也被用于疾病关联的研究和移植配型。HLA Ⅱ类抗原的分型从经典的血清学方法逐步深入到DNA水平的分型，通过PCR/SSO方法可以有效地鉴别仅有一个核苷酸之差的等位基因，且有更多的机会在群体中发现新的等位基因。我们在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)，且该例杂合子细胞中的DRB3基因也与已发表的序列有差异。HLA多样性研究必将进一步丰富我中华民族群体遗传资源数据库，为人类学研究以及HLA与疾病关联研究提供更为精确的遗传信息。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
[1]Bodmer JG,Marsh SGE,Albert ED,et al.Nomenclature for factors of the HLA system,1996,Human Immunology,1997,53∶98-108.
, 百拇医药
[2]Shinno K,Tsuboyama K,Mine H,et al.Nucleotide sequence of a new DRB1*15 variant,1505,in a Japanese family.Tissue Antigens,1995,46∶411-413.
[3]van den Berg-Loonen E,Rani R,Singal D,et al.A new DRB1*15 allele (DRB1*1506) identified by sequence-based typing.Tissue Antigens,1997,49∶189-191.
[4]Bodmer JG,Marsh SGE,Albert ED,et al.Nomenclature for factors of the HLA system,1995,Tissue Antigen,1995,46∶1-18.
[5]陈仁彪，叶根耀，庚镇城，等.我国大陆主要少数民族HLA多态性聚类分析和频率分布对中华民族起源的启示.遗传学报，1993，20(5)∶389-398.
[6]费虹明，陆嫣，林标扬，等.我国彝族一个新的DRB15(2)等位基因的核苷酸序列分析.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15 (1)∶45-48.
[7]费虹明，蒋伟宏，陆嫣，等.我国彝族HLA D区基因的寡核苷酸分型.中华微生物学和免疫学杂志，1993，13(4)∶219-225.
(收稿：1997-11-14 修回：1998-06-29), 百拇医药
单位：200025 上海第二医科大学生物学教研室
关键词：HLA抗原；聚合酶链反应；彝族；碱基序列
中华微生物学和免疫学杂志990229 【 摘要 】 目的 对在用PCR/SSO方法作我国彝族群体样本HLA D区寡核苷酸分型中发现的1例DRB1的杂合子进行等位基因序列分析。 方法 用DRB基因类引物扩增该特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。扩增产物经纯化转染大肠杆菌JM101，克隆后再经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。 结果 彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的DRB1基因阳性克隆，经序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2(暂定)等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC。 结论 在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)。在我国这样一个多民族国家中，就HLA系统而言，可能还有更多新等位基因有待鉴定。这样有助于完善群体遗传资料。
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Nucleotide sequence of another novel DR15(2) allele in Yi Nationality Chinese JIANG Weihong,ZOU Yanqiong,LIN Biaoyang,et al.Department of Biology, Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025
【 Abstract 】 Objective One special DRB1 heterozygote which was found in oligotyping of HLA D region in Chinese Yi population by using PCR/SSO method, was to be sequenced for the gene of the allele. Methods Amplification of exon 2 of DRB gene in this heterozygote was carried out with genomic DNA templet and generic primers and the amplicon was cloned in M13 for further sequencing. Results One allele was identified as DRB1*1202, another allele whose PCR/SSO hybridization pattern was similar to but different from DRB1*1502 was considered as DRB1*15 variant. Analysis of nucleotide sequence revealed that this allelic variant differed from DRB1*1502 at codon 47 (TAC instead of TTC), resulting in the substitution of a tyrosine for phenylalanine in the DRβ chain. Conclusion The DRB1 heterozygote allele gene could be nominated as DRB1*15Y2 temporarily.
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【 Subject words 】 HLA antigen Polymerace chain reaction Chinese Yi Base sequenc
HLAⅡ类分子受控于HLA D区基因，主要包括DR、DQ和DP3个亚区。DR亚区的高度多态性归结于DRB基因，至今已鉴定有DRB1、DRB3、DRB4和DRB5基因座及几个假基因。因此，HLA分型已由血清学、细胞学的抗原特异性深入到DNA水平上的等位基因判别。国际上对这些基因座的等位基因进行了详细的群体研究，最终根据序列测定结果由WHO HLA 系统命名委员会正式命名。血清学分型的DR2有DR15和DR16两个亚型，DNA分型及序列分析已鉴定DRB1*1501-DRB1*1506和DRB1*1601-DRB1*1605、DRB1*1607、DRB1*1608等13个等位基因和11个DRB5等位基因〔1-3〕。我国是一个多民族国家，南北地区的汉族和少数民族间的HLA等位基因频率均有很大差异〔5〕。在对云南彝族样本进行HLA-DR亚区寡核苷酸分型中，费虹明等〔6〕发现了一个新的DR15(2)等位基因，经鉴定后与当时WHO命名委员会正式命名为DRB1*1504一致〔4〕，在我国为首次发现。本文报道在彝族样本中另有一例特殊的DRB1杂合子，其中一个等位基因是DRB1*1202，而另一等位基因的反应格局与已有的DR15(2)反应格局不同，可能是另一个新的等位基因。我们用DRB基因的类(generic)引物扩增该例杂合子细胞DR基因的第二外显子，对扩增产物进行克隆和序列测定，确认是另一新的DR15(2)等位基因，暂称之为DRB*15Y2。
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材料与方法
1.PCR扩增：用国际组织相容性会议提供的DRB基因类引物(DRBAMP-A：CCCCACAGCACGTTTCTTG；DRBAMP-B：CCGCTGCACTGTGAAGCTCT)扩增特殊的DRB1杂合子细胞基因组的DRB基因的第二外显子。
2.扩增产物的克隆：扩增产物经纯化后通过T4连接酶连接于已用SamⅠ切成平整末端的M13mp18,转染大肠杆菌JM101，用β-半乳糖苷酶系统筛选含插入片段的阳性白色菌落。
3.序列分析：将阳性菌落在培养液中37℃培养过夜。12 000×g离心后取上清液，加入PEG-8000，冰浴后再次12 000×g离心10分钟，沉淀溶于TE缓冲液，经酚/氯仿抽提后得到单链M13 DNA。利用ABI 377测序仪自动测序。
结 果
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彝族这一特殊的DRB1杂合子细胞的基因组DNA经DRB基因的类引物扩增后并克隆。经筛选，分别获得了DRB1、DRB3和DRB5基因的阳性克隆。序列分析证实了该DRB1杂合子中一个等位基因确为DRB1*1202，与PCR/SSO分型〔7〕一致；另一个新等位基因DRB1*15Y2等位基因在第二外显子的47位由编码苯丙氨酸的TTC(DRB1*1502)变为编码酪氨酸的TAC(图1)。该例细胞中DRB5基因为DRB5*02等位基因，但DRB3基因序列亦与已知者有差异(另文报道)。
图1 DRB1*15Y2和DRB1*1501-1506各等位基因第二外显子的核苷酸序列
Fig 1. The exon 2 nucleotide sequence of DRB1*15Y2 aligned with other DRB1*1501-1506 alleles
讨 论
, 百拇医药
HLA系统在人类基因组中具有高度多态性，可以作为遗传标志来研究人类的起源和迁移，在临床上也被用于疾病关联的研究和移植配型。HLA Ⅱ类抗原的分型从经典的血清学方法逐步深入到DNA水平的分型，通过PCR/SSO方法可以有效地鉴别仅有一个核苷酸之差的等位基因，且有更多的机会在群体中发现新的等位基因。我们在云南彝族样本中发现的DRB1*15Y2，其47位由TAC(酪氨酸)置换了相应于DRB1*1502的TTC(苯丙氨酸)，且该例杂合子细胞中的DRB3基因也与已发表的序列有差异。HLA多样性研究必将进一步丰富我中华民族群体遗传资源数据库，为人类学研究以及HLA与疾病关联研究提供更为精确的遗传信息。
本课题受国家自然科学基金资助
参考文献
[1]Bodmer JG,Marsh SGE,Albert ED,et al.Nomenclature for factors of the HLA system,1996,Human Immunology,1997,53∶98-108.
, 百拇医药
[2]Shinno K,Tsuboyama K,Mine H,et al.Nucleotide sequence of a new DRB1*15 variant,1505,in a Japanese family.Tissue Antigens,1995,46∶411-413.
[3]van den Berg-Loonen E,Rani R,Singal D,et al.A new DRB1*15 allele (DRB1*1506) identified by sequence-based typing.Tissue Antigens,1997,49∶189-191.
[4]Bodmer JG,Marsh SGE,Albert ED,et al.Nomenclature for factors of the HLA system,1995,Tissue Antigen,1995,46∶1-18.
[5]陈仁彪，叶根耀，庚镇城，等.我国大陆主要少数民族HLA多态性聚类分析和频率分布对中华民族起源的启示.遗传学报，1993，20(5)∶389-398.
[6]费虹明，陆嫣，林标扬，等.我国彝族一个新的DRB15(2)等位基因的核苷酸序列分析.中华微生物学和免疫学杂志，1995，15 (1)∶45-48.
[7]费虹明，蒋伟宏，陆嫣，等.我国彝族HLA D区基因的寡核苷酸分型.中华微生物学和免疫学杂志，1993，13(4)∶219-225.
(收稿：1997-11-14 修回：1998-06-29), 百拇医药