整合型HBV-DNA前C区基因突变与肝细胞癌的相关性
作者：王修海 王培林 张杰 邱法波 王兰
单位：王修海 王培林 张杰(青岛医学院生物学教研室，青岛266021)；邱法波(青岛医学院附属医院普外科)；王兰(青岛市市北区医院五官科)
关键词：肝肿瘤；肝炎病毒，乙型；基因转变；聚合酶链反应
青岛医学院学报990201 【摘要】 ①目的 探讨整合型HBV-DNA前C区基因突变与肝细胞癌的关系。②方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态技术，对29例肝癌、12例慢性肝硬化和14例非肝病病人的肝组织内整合型HBV-DNA前C区进行突变分析。③结果 肝癌、肝硬化和正常肝组织中整合型HBV-DNA阳性率分别为96.55%，66.67%和14.29%，组间比较差异有显著性(χ2=29.43,P<0.001),3组整合型HBV-DNA前C区突变率分别为41.6%,25.0%和0，组间比较差异有显著性(χ2=12.44,P<0.05)。④结论肝组织中整合型HBV-DNA前C区突变与肝细胞癌的发生和发展相关。
, 百拇医药
中国图书馆分类法分类号 Q5
THE CORRELATION BETWEEN GENE MUTAT ION ON PRECORE REGION
OF HBV-DNA INTEGRATION AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA
Wang Xiuhai, Wang Peilin, Zhang Jie, et al
Department of Biology, Qin gdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To explore the relationship between the gene mutation on precore region of HBV-DNA integration and the hepatocellul ar carcinoma. Methods The gene mutation on precore region of HBV-DNA integrat ion in liver tissues of 29 cases with hepatocellular carcinoma, 12 cases with li ver cirrhosis and 14 cases with non-liver diseases were detected with PCR-SSC P technique. Results The positive rates of HBV-DNA integration among tumor li ver tissues, cirrhotic liver tissues and normal liver tissues were 96.55%, 66.67 % and 14.29%, respectively. The differences between the three groups were more s ignificant(χ2=29.43, P<0.001). The gene mutation rates on precore regio n of HBV-DNA integration in three groups were 41.6%, 25.0% and 0, respectiv ely. The differences between the three groups were significant(χ2=12.44, P<0.05). Conclusion The gene mutation on precore region of HBV-DNA inte gration in liver tissues was associated with the morigenesis and development of hepatocellular carcinoma.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 liver neoplasms; hepatitis B virus; gene conversion; polymerase chain rection
肝细胞癌(HCC)是消化系统常见的恶性肿瘤。众多的研究表明，HCC的发生和乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染有密切的关系。近几年的研究发现，HBV感染造成肝病进行性加重并导致HCC发生与HBV-DNA的基因突变有关。有学者已经在HCC病人血清和外周血单个核细胞中检测到变异的HBV.HBV在HCC病人肝细胞中的感染及基因变异情况的相关研究甚少。本研究应用聚合酶链反应-单链构象多态分析技术对正常肝组织、肝硬化组织和HCC肝组织内整合型HBV-DNA感染情况进行检测,并对HBV-DNA前C区基因突变情况进行分析，以探讨HBV-DNA整合及其基因突变在HCC发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
, http://www.100md.com
病人来自青岛医学院附属医院普外科。肝细胞癌病人(肝癌组)29例，其中男22例，女7例，年龄36～70岁。血清学检测HBsAg阳性者24例，术后取癌区、癌旁区(距癌边缘25cm)组织标本58份。慢性肝硬化(LC)病人(肝硬化组)12例，其中男8例，女4例，年龄23～73岁。血清学检测HBsAg阳性者8例，术中取肝硬化组织标本12份。非肝病手术病人(正常组)14例，其中男5例，女9例，年龄35～71岁。血清学检测HBsAg均为阴性，术中取正常肝组织标本14份。HCC和LC诊断均符合1990年全国第6届病毒性肝炎学术会议修订的临床诊断标准,并经病理检查证实。
1.2 试剂来源
PCR试剂购自上海生物工程有限公司，PCR引物由上海生物工程公司合成。
1.3 实验方法
按常规蛋白酶K消化，苯酚氯仿提取方法进行肝组织细胞DNA提取〔1〕。在50μL反应体系中加入模板DNA200ng,Taq酶2U,4×dNTP(10mmol/L)3μL,引物(20pmoL/L)各1.5μL，MgCl2(25mmoL/L)3μL,10×PCR缓冲液5μL.PCR反应在热循环仪美国(PE公司)中进行。扩增条件为95℃变性5min后进入循环，94℃45s,65℃45s,72℃90s,30个循环后72℃5min终止反应。扩增产物经80g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，对确定扩增阳性的产物进行SSCP分析。取5μL阳性扩增产物混合于等体积的变性液(9.5g/L甲酰胺，10mmol/LEDTA,9.5g/L溴酚蓝，2.5g/L二甲苯氰蓝)中，95℃热变性5min后置湿冰上骤冷。取5μL变性PCR产物在80g/L聚丙烯酰胺凝胶(交联度为49∶1)上电泳，室温下，300V电泳3h,电泳结束后凝胶按银染方法染色〔2〕，摄影记录，判断结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 各种肝组织整合型HBV-DNA检出结果
结果表明，14例正常肝组织中2例为阳性，阳性率为14.29%；12例LC组织中8例为阳性，阳性率66.27%；29例HCC组织中28例为阳性，阳性率为96.55%.经χ2检验，3组间阳性率比较差异有极显著性(χ2=29.43,P<0.001)。
2.2 各种肝组织整合型HBV-DNA前C区PCR-SSCP分析结果
2例正常肝组织，8例LC组织，28例HCC组织的分析样品中SSCP阳性者分别为0，2，10例；阳性率分别为0，25.0%，41.6%,3组间阳性率比较差异有显著性(χ2=12.44,P<0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
早在1988年，Blumberg〔3〕提出，HCC的发生需要HBV的感染，它的发病过程是急性乙型肝炎治疗未愈转化为慢性肝炎，反复发作进而发展为肝硬化，最终导致原发性肝细胞癌的发生。以后的临床和基础研究结果基本上支持Blumberg的观点。我们对3组肝细胞内整合型HBV-DNA的检测结果也显示，HCC病人肝细胞内HBV感染率明显高于其他各组，并且3组整合型HBV-DNA的阳性率随着肝病的严重程度升高而相应增高。这与一些血清游离HBV和外周血单个核细胞中整合型HBV-DNA阳性率的观察结果一致〔4，5〕。
目前认为,HBV感染使肝病进行性加重并最终导致HCC的原因是HBV基因组发生了某些变异，逃避了人体的免疫清除〔6〕，其中HBV基因组前C区突变与肝病的发病及HCC的发生关系较为密切。国内外已经发现了一些HBV前C区基因突变类型和突变热点〔7〕。有研究者在HCC病人血清中检出了HBV前C区终止密码变异，但是检出率并未高出对照组，且例数较少〔7〕。本文研究结果显示，各实验组基因突变率不全一致,HCC病人肝细胞内整合型HBV-DNA前C区突变率明显增高，突变率随肝病严重程度升高而逐渐增加。表明HBV基因组前C区突变不仅与肝病的发展有关，而且和HCC的发生有明显的关系。
, http://www.100md.com
HBV感染是HCC的发病因素之一。有学者认为HBV-DNA感染人体并整合到肝细胞基因组时，使正常基因组造成损伤，既可引起原癌基因的激活，也可引起抑癌基因的非活化或缺失，这种平衡的破坏是HCC发生的分子生物学基础〔8〕。但有关前C区突变的HBV是如何引起癌基因和抑癌基因的变化目前还不清楚，有待进一步研究。
本文为山东省自然科学基金资助课题(批准号：91C0125)
参考文献
1 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning. 2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.304
2 Brandt B, Greger V, Yandell D, et al. A simple and non radioactive me thod for detecting the Rb1.20 DNA polymorphism in the retinoblastoma gene. Am J Hum Gene, 1992,51:1450
, 百拇医药
3 Blumberg BS. 关于乙型肝炎病毒致原发性肝细胞癌模式.国外医学流行病和传染病学分册，1988，13(5)：210
4 Leung N, John S, Lau G, et al. Hepatitis B virus DNA in peripheral bl ood leukocytes: a comparision between hepatocellular carcinoma and other hepatit is B virus related chronic liver disease. Cancer, 1994, 73:1143
5 光丽霞，顾长海.HBV感染的单个核细胞分泌TNF-α和PGE2的改变及其意义探讨.中华传染病杂志，1995，13：304
6 Ramiondo G, Greger V, Robinson W, et al. Latency and reactivation of a precore mutant hepatitis B virus in a chronically infected patient. J Hepato l, 1990, 11:374
7 邱望龙.乙型肝炎病毒前C区变异与临床.国外医学流行病学和传染病学分册，1996，23(1)：14
8 Hsu T, Moroy T, Etiemble J, et al. Activation of c-myc by woodchuck hepatitis virus insertion in hepatocellular carcinoma. Cell, 1988, 55:627
(1999-01-19收稿 1999-05-16修回), 百拇医药
单位：王修海 王培林 张杰(青岛医学院生物学教研室，青岛266021)；邱法波(青岛医学院附属医院普外科)；王兰(青岛市市北区医院五官科)
关键词：肝肿瘤；肝炎病毒，乙型；基因转变；聚合酶链反应
青岛医学院学报990201 【摘要】 ①目的 探讨整合型HBV-DNA前C区基因突变与肝细胞癌的关系。②方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态技术，对29例肝癌、12例慢性肝硬化和14例非肝病病人的肝组织内整合型HBV-DNA前C区进行突变分析。③结果 肝癌、肝硬化和正常肝组织中整合型HBV-DNA阳性率分别为96.55%，66.67%和14.29%，组间比较差异有显著性(χ2=29.43,P<0.001),3组整合型HBV-DNA前C区突变率分别为41.6%,25.0%和0，组间比较差异有显著性(χ2=12.44,P<0.05)。④结论肝组织中整合型HBV-DNA前C区突变与肝细胞癌的发生和发展相关。
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中国图书馆分类法分类号 Q5
THE CORRELATION BETWEEN GENE MUTAT ION ON PRECORE REGION
OF HBV-DNA INTEGRATION AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA
Wang Xiuhai, Wang Peilin, Zhang Jie, et al
Department of Biology, Qin gdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To explore the relationship between the gene mutation on precore region of HBV-DNA integration and the hepatocellul ar carcinoma. Methods The gene mutation on precore region of HBV-DNA integrat ion in liver tissues of 29 cases with hepatocellular carcinoma, 12 cases with li ver cirrhosis and 14 cases with non-liver diseases were detected with PCR-SSC P technique. Results The positive rates of HBV-DNA integration among tumor li ver tissues, cirrhotic liver tissues and normal liver tissues were 96.55%, 66.67 % and 14.29%, respectively. The differences between the three groups were more s ignificant(χ2=29.43, P<0.001). The gene mutation rates on precore regio n of HBV-DNA integration in three groups were 41.6%, 25.0% and 0, respectiv ely. The differences between the three groups were significant(χ2=12.44, P<0.05). Conclusion The gene mutation on precore region of HBV-DNA inte gration in liver tissues was associated with the morigenesis and development of hepatocellular carcinoma.
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【KEY WORDS】 liver neoplasms; hepatitis B virus; gene conversion; polymerase chain rection
肝细胞癌(HCC)是消化系统常见的恶性肿瘤。众多的研究表明，HCC的发生和乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染有密切的关系。近几年的研究发现，HBV感染造成肝病进行性加重并导致HCC发生与HBV-DNA的基因突变有关。有学者已经在HCC病人血清和外周血单个核细胞中检测到变异的HBV.HBV在HCC病人肝细胞中的感染及基因变异情况的相关研究甚少。本研究应用聚合酶链反应-单链构象多态分析技术对正常肝组织、肝硬化组织和HCC肝组织内整合型HBV-DNA感染情况进行检测,并对HBV-DNA前C区基因突变情况进行分析，以探讨HBV-DNA整合及其基因突变在HCC发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
, http://www.100md.com
病人来自青岛医学院附属医院普外科。肝细胞癌病人(肝癌组)29例，其中男22例，女7例，年龄36～70岁。血清学检测HBsAg阳性者24例，术后取癌区、癌旁区(距癌边缘25cm)组织标本58份。慢性肝硬化(LC)病人(肝硬化组)12例，其中男8例，女4例，年龄23～73岁。血清学检测HBsAg阳性者8例，术中取肝硬化组织标本12份。非肝病手术病人(正常组)14例，其中男5例，女9例，年龄35～71岁。血清学检测HBsAg均为阴性，术中取正常肝组织标本14份。HCC和LC诊断均符合1990年全国第6届病毒性肝炎学术会议修订的临床诊断标准,并经病理检查证实。
1.2 试剂来源
PCR试剂购自上海生物工程有限公司，PCR引物由上海生物工程公司合成。
1.3 实验方法
按常规蛋白酶K消化，苯酚氯仿提取方法进行肝组织细胞DNA提取〔1〕。在50μL反应体系中加入模板DNA200ng,Taq酶2U,4×dNTP(10mmol/L)3μL,引物(20pmoL/L)各1.5μL，MgCl2(25mmoL/L)3μL,10×PCR缓冲液5μL.PCR反应在热循环仪美国(PE公司)中进行。扩增条件为95℃变性5min后进入循环，94℃45s,65℃45s,72℃90s,30个循环后72℃5min终止反应。扩增产物经80g/L非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，对确定扩增阳性的产物进行SSCP分析。取5μL阳性扩增产物混合于等体积的变性液(9.5g/L甲酰胺，10mmol/LEDTA,9.5g/L溴酚蓝，2.5g/L二甲苯氰蓝)中，95℃热变性5min后置湿冰上骤冷。取5μL变性PCR产物在80g/L聚丙烯酰胺凝胶(交联度为49∶1)上电泳，室温下，300V电泳3h,电泳结束后凝胶按银染方法染色〔2〕，摄影记录，判断结果。
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2 结果
2.1 各种肝组织整合型HBV-DNA检出结果
结果表明，14例正常肝组织中2例为阳性，阳性率为14.29%；12例LC组织中8例为阳性，阳性率66.27%；29例HCC组织中28例为阳性，阳性率为96.55%.经χ2检验，3组间阳性率比较差异有极显著性(χ2=29.43,P<0.001)。
2.2 各种肝组织整合型HBV-DNA前C区PCR-SSCP分析结果
2例正常肝组织，8例LC组织，28例HCC组织的分析样品中SSCP阳性者分别为0，2，10例；阳性率分别为0，25.0%，41.6%,3组间阳性率比较差异有显著性(χ2=12.44,P<0.05)。
3 讨论
, 百拇医药
早在1988年，Blumberg〔3〕提出，HCC的发生需要HBV的感染，它的发病过程是急性乙型肝炎治疗未愈转化为慢性肝炎，反复发作进而发展为肝硬化，最终导致原发性肝细胞癌的发生。以后的临床和基础研究结果基本上支持Blumberg的观点。我们对3组肝细胞内整合型HBV-DNA的检测结果也显示，HCC病人肝细胞内HBV感染率明显高于其他各组，并且3组整合型HBV-DNA的阳性率随着肝病的严重程度升高而相应增高。这与一些血清游离HBV和外周血单个核细胞中整合型HBV-DNA阳性率的观察结果一致〔4，5〕。
目前认为,HBV感染使肝病进行性加重并最终导致HCC的原因是HBV基因组发生了某些变异，逃避了人体的免疫清除〔6〕，其中HBV基因组前C区突变与肝病的发病及HCC的发生关系较为密切。国内外已经发现了一些HBV前C区基因突变类型和突变热点〔7〕。有研究者在HCC病人血清中检出了HBV前C区终止密码变异，但是检出率并未高出对照组，且例数较少〔7〕。本文研究结果显示，各实验组基因突变率不全一致,HCC病人肝细胞内整合型HBV-DNA前C区突变率明显增高，突变率随肝病严重程度升高而逐渐增加。表明HBV基因组前C区突变不仅与肝病的发展有关，而且和HCC的发生有明显的关系。
, http://www.100md.com
HBV感染是HCC的发病因素之一。有学者认为HBV-DNA感染人体并整合到肝细胞基因组时，使正常基因组造成损伤，既可引起原癌基因的激活，也可引起抑癌基因的非活化或缺失，这种平衡的破坏是HCC发生的分子生物学基础〔8〕。但有关前C区突变的HBV是如何引起癌基因和抑癌基因的变化目前还不清楚，有待进一步研究。
本文为山东省自然科学基金资助课题(批准号：91C0125)
参考文献
1 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, et al. Molecular cloning. 2nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.304
2 Brandt B, Greger V, Yandell D, et al. A simple and non radioactive me thod for detecting the Rb1.20 DNA polymorphism in the retinoblastoma gene. Am J Hum Gene, 1992,51:1450
, 百拇医药
3 Blumberg BS. 关于乙型肝炎病毒致原发性肝细胞癌模式.国外医学流行病和传染病学分册，1988，13(5)：210
4 Leung N, John S, Lau G, et al. Hepatitis B virus DNA in peripheral bl ood leukocytes: a comparision between hepatocellular carcinoma and other hepatit is B virus related chronic liver disease. Cancer, 1994, 73:1143
5 光丽霞，顾长海.HBV感染的单个核细胞分泌TNF-α和PGE2的改变及其意义探讨.中华传染病杂志，1995，13：304
6 Ramiondo G, Greger V, Robinson W, et al. Latency and reactivation of a precore mutant hepatitis B virus in a chronically infected patient. J Hepato l, 1990, 11:374
7 邱望龙.乙型肝炎病毒前C区变异与临床.国外医学流行病学和传染病学分册，1996，23(1)：14
8 Hsu T, Moroy T, Etiemble J, et al. Activation of c-myc by woodchuck hepatitis virus insertion in hepatocellular carcinoma. Cell, 1988, 55:627
(1999-01-19收稿 1999-05-16修回), 百拇医药