异体皮覆盖自体微粒皮治疗Ⅲ度烧伤的病理学研究
作者：高俊明 孙世荃 樊娅娜 陈承祜 李幼忱 苏宏昌 段俊奎
单位：高俊明 樊娅娜 陈承祜 (山西省人民医院烧伤整形科 太原 030012)；孙世荃 李幼忱 (山西省医用组织库)；苏宏昌 (山西省人民医院病理科)；段俊奎 (山西省静乐县人民医院)
关键词：皮肤移植；移植，同种 移植，自体；烧伤
山西医科大学学报990226 摘要 目的 了解断层的异体皮作为生物敷料与自体微粒皮移植治疗大面积深度烧伤中异体皮的表皮层与真皮层的作用，以期为合理利用和加工异体皮提供参考。方法 取复温后及移植后5～30 d的异体皮标本，少数病例同时获取异体皮下面的组织，石蜡切片、HE、Masson、PAS染色，光镜观察。结果 异体皮移植后5 d 其表皮层细胞出现泡状变性，逐渐与真皮层分离，形成水泡，然后剥脱。来源于创面的毛细血管长入异体真皮，并有炎症反应。手术后1～2 w，存活的自体微粒皮的表皮细胞在异体皮下方开始扩展，伴有新生的小血管。最后，异体真皮形成痂皮脱落，其下面新生的表皮覆盖创面。结论 异体皮覆盖烧伤创面后其表皮层很快出现泡状变性，形成水泡，溶解剥脱，因此在烧伤创面覆盖中不会起主要作用。起更大作用的是异体真皮，它不仅覆盖创面，而且当毛细血管长入异体真皮时可以为其下方的自体微粒皮的增殖和扩展提供营养环境。所以，在异体皮的制备过程中，不应该把断层后的真皮深层丢掉，而应该将其收集保存予以利用。
, 百拇医药
中图号 R622.1
Pathologic studies on the covered allogeneic skin grafts in the treatment
of full-thickness skin burns with autogenic micro-skin
Gao Junming, Sun Shiquan, Fan Yana,et al
(Dept.of Burns and Plastic Surgery,People's Hospital of Shanxi Province， Taiyuan 030012)
Abstract Objective To assess the role of epidermal and dermal layers of allogeneic skin covering in the treatment of extensive burns with autogenic microskin for the reasonable utilization and processing of skin grafts.Methods The covred skin allografts were harvested 0 and 5～30 days after operation.Tissues under the skin allografts were also harvested in some cases.Histological sections were stained with HE，Masson and PAS staining.Results From 5 days,there were vesicular degeneration,cleavage,blister and sloughing of allo-epidermis,ingrowth of capillaries from the wound bed into the allo-dermis with inflammatory reaction.From weeks 1～2,the survived auto-skin expanded underneath the allo-dermis in the area of capillary ingrowth.Finally,the sloughed allo-dermis as a crust was separated from the healed new epidermis.Conclusion In the covered skin allografts,its allo-epidermal layer was degraded,sloughed and detached few days after operation ,and did not play an important role as the allo-dermal layer in the covering of wound.So the deep layer of allo-dermal layer during the processing of split-skin allografts should not be discarded and could be collected and used for burn covering.Ingrowth of capillaries into the allo-dermis will provide nourishing enviroment for the proliferation and expanding of autogenic microskin underneath.
, 百拇医药
Key words skin transplantation; transplantation, homologous; transplantation, autologous; burns
大面积深度烧伤患者创面治疗采用自体微粒皮与异体皮移植可以取得较好的疗效[1]。本文收集9例临床病例，在自体微粒皮与异体皮移植后，对异体皮的变化及微粒皮的扩展进行了跟踪观察，重点了解断层异体皮的表皮层与真皮层的作用，为合理制备与应用异体皮提供临床证据。
1 材料与方法
本组9例大面积深度烧伤患者。男8例，女1例，年龄12～60岁，平均27岁；烧伤面积20%～87%，平均(52.88±35.20)%；Ⅲ度烧伤面积20%～77%，平均(35.10±20.88)%；创面于烧伤后5～8 d 切痂，平均6.3 d。切痂一般达深筋膜，如仍有坏死组织，则要彻底切除，充分止血，有条件时尽量保留浅静脉。其中1例因部分创面未达全层皮肤烧伤，故这些部位予以削痂。按张明良[1]方法移植自体微粒皮与异体断层皮。保持活性的异体断层皮由山西省医用组织库提供，厚度0.4～0.6 mm，取自合格的死亡供体，按美国组织库协会AATB的标准制备。移植前用40℃、0.9%无菌生理盐水复温，并取一小块异体皮做组织学检查。于移植术后5、10、20、30 d 分别取覆盖的异体皮，部分病例取异体皮下方的小块组织，经Bouin液固定，梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片，HE、Masson、PAS染色，光镜观察。复温前部分异体皮还进行新鲜组织冷冻切片，做琥珀酸脱氢酶(SDH)染色(nitro-BT法)，观察皮肤活性。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 异体皮植入前的组织学观察 复温后异体皮切片检查，可见表皮结构清晰，PAS阴性，基底膜PAS阳性，真皮胶原呈宽带状，Masson绿染，PAS弱阳性。复温前新鲜组织冷冻切片SDH染色显示异体表皮细胞蓝染，主要分布在基底细胞，说明异体皮保持活性，见图1。
图1 异体皮植入前的组织学观察 PAS ×130
2.2 异体皮与自体微粒皮移植后的临床观察 根据临床所见可以大体上分为以下三期。
2.2.1 异体表皮剥脱期(移植后3～14 d ) 术后5 d，出现散在的直径大约0.5～5 cm的形状不同的黄色水泡，水泡皮剥脱后露出异体真皮湿润、白色，以后逐渐变红；大致术后10 d，异体真皮开始退变死亡，出现散在黑色斑点。
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2.2.2 异体真皮干枯期(移植后10～30 d) 到术后20 d，干枯的黑褐色区域逐渐扩大，部分融合成片，黑色斑片之间仍为红色区域。
2.2.3 异体真皮剥脱期(移植后25～60 d) 干枯的异体真皮部分翘起，逐渐脱落，不伴有出血。术后大致60 d，覆盖的异体真皮完全脱落，其下方自体表皮生长扩展，创面愈合。
2.3 异体皮与自体微粒皮移植后的光镜观察
2.3.1 异体表皮剥脱期 术后5 d，异体表皮细胞泡状变性，水泡融合，与真皮面间形成裂隙，继而表皮剥脱，基底膜残留于真皮侧。真皮内有宿主血管长入伴有炎细胞浸润，异体真皮Masson染色仍为绿色，附着于真皮侧的基底膜仍为PAS阳性，真皮内增生的毛细血管周围有PAS阳性物质沉积。术后10 d，异体真皮内毛细血管增多。异体真皮下发现成活的来自自体微粒皮的表皮细胞团，伴有从宿主长入的小血管，表皮细胞团的周边部分为增生的基底细胞，中央部分出现角化，有时形成囊腔。此时，异体真皮胶原在Masson染色中呈红色或红、绿相间，说明真皮组织已经开始出现坏死。有时可见真皮乳头层为绿色，乳头下面的网状层呈红色，说明乳头层出现坏死的时间稍晚，见图2、3。
, 百拇医药
图2 异体皮植入术后 5 d PAS ×130
图3 异体皮植入术后 10 d HE ×130
2.3.2 异体真皮干枯期 术后20 d，异体真皮内血管减少，形成痂皮。新生自体表皮逐渐增生形成连续层，角质层呈现完全角化或不完全角化，后者在角质层内有残存的细胞核，缺乏颗粒层。
2.3.3 异体真皮剥脱期 术后30 d，真皮剥脱，新生自体表皮扩展，互联并覆盖创面(图4)。
图4 异体皮植入术后 30 d HE ×250
3 讨论
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大面积深度烧伤患者自体皮源不足[2]，而异体皮具有防止创面感染、保护体液丢失的作用[3]。张明良[1]采用异体皮与自体微粒皮结合治疗Ⅲ度烧伤切痂创面，这样，异体皮为自体微粒皮提供了一个具有一定温度、湿度，pH值和氧张力的最适“创面小气候”(wound microclimate)[4]，为自体皮的成活创造了条件[5]，从而使自体微粒皮成活、增殖、加速了创面愈合。
自体皮在活体内培养中，异体皮的质量非常重要[1]。特别是异体皮在移植后1w内保持成活[5]，才能有利于自体微粒皮得到所需要的营养。通常使用的异体皮包括表皮层与真皮浅层。本文所见，异体表皮在术后1w内剥脱，说明在治疗中不会起主要作用。这可能与异体表皮免疫原性较高有关，而异体真皮免疫原性较低[6]，保留较长时间。实验证明，异体成纤维细胞与胶原纤维免疫原性微弱，真皮基质移植后不会引起明显的免疫排斥反应[7]。临床组织学观察也发现异体真皮移植后不被排斥。相反异体真皮可以促进宿主成纤维细胞和内皮细胞移行进入异体真皮中[2,3,7]，并促进表皮生长[8]。本文所见，覆盖的异体真皮中有来自宿主的小血管，血管周围出现粘多糖(PAS阳性)沉积，这是早期异体皮成活的证据。本文还看到，异体皮基底膜未随异体表皮脱落，残留于真皮侧，这样有利于异体皮的覆盖作用。分析其原因可能是因为基底膜通常由Ⅶ型胶原为主要成分的锚状纤维将自己固定于真皮上；半桥粒横跨基底膜，凭借其中的Ⅳ型胶原及层粘连蛋白和锚状纤维将表皮固定于真皮上。Ⅳ型胶原和层粘连蛋白是角朊细胞合成的，而锚状纤维则是由真皮细胞合成的[9]。表皮细胞被排斥后，Ⅳ型胶原及层粘连蛋白与基底膜的联系遭到破坏，而又无法重新合成修复，锚状纤维则仍将其底膜固定于真皮侧。
, http://www.100md.com
随着自体微粒皮的成活与增殖扩展，切断了异体真皮来自宿主的血液供应，加之免疫排斥的不能完全避免，结果异体真皮开始发生死亡，临床上出现散在的黑褐色斑点，光镜下出现Masson染色中的红染区。有时可见真皮网状层在Masson染色中着红色而其乳头层着绿色。这可能是由于乳头层毛细血管丰富，形成乳头下血管网[10]，因而可以暂时缓解缺血造成的影响。但当自体微粒皮进一步扩展，异体真皮坏死区进一步扩大后，终将导致全层真皮的坏死与剥脱。这时自体微粒皮已经基本上相互连接成片，覆盖创面，使烧伤得到较好的愈合。
参考文献
1 Zhang ML,Chang ZD,Wang CY,et al.Microskin grafting in the treatment of extensive burns：a preliminary repoart.J Trauma, 1988, 28： 804～807
, http://www.100md.com
2 Medalia DA,Eming SA,Tompkins RG,et al. Evaluation of human skin reconstituted from composite grafts of cultured keratinocytes and human acellular dermis transplanted to athymic mice.J Invest Dermatol, 1996, 107： 121～127
3 Omi T,Kawanani O,Matsuda K,et al.Histological characteristics of the healing process of frozen skin allograft used in the treatment of burns.Burns, 1996, 22： 206～211
4 Kaufman T,Hirshowitz B.The influence of various microclimate conditions on the burn wound：a review.Burns,1983,9：84～88
, 百拇医药
5 Lin SD,Chou CK,Lai CS,et al.Microskin grafling of rabbits with pigskin xenograft overlay.Burns, 1991, 17： 473～477
6 Yukna RA,Turner DW,Robinson LJ.Variable antigenicity of lyphilized allogeneic and lyophilized xenogeneic skin in guinea pig.J Periodontal Res, 1977, 12： 197～201
7 Livesey SA,Herndon DW,Hollyoak MA,et al.Transplanted acellular allograft dermal matrix.Transplantation, 1995, 60： 1～9
, http://www.100md.com 8 Coulomb B,Lebreton C,Dubertret L.Influence of human dermal fibroblasts on epidermalization.J Invest Dermatol, 1989, 92： 122～125
9 Cuono CB,Langdon R,Birchall N,et al.Composite autologous-allogeneic skin replacement：development and clinical application.Plast Reconstr Surg, 1987, 80： 626～635
10 Cormack DH.Ham′s histology：blood supply of skin.9th ed.Philadelphia：JB Lippincott Co， 1987. 467～468
[1998-12-22收稿], 百拇医药
单位：高俊明 樊娅娜 陈承祜 (山西省人民医院烧伤整形科 太原 030012)；孙世荃 李幼忱 (山西省医用组织库)；苏宏昌 (山西省人民医院病理科)；段俊奎 (山西省静乐县人民医院)
关键词：皮肤移植；移植，同种 移植，自体；烧伤
山西医科大学学报990226 摘要 目的 了解断层的异体皮作为生物敷料与自体微粒皮移植治疗大面积深度烧伤中异体皮的表皮层与真皮层的作用，以期为合理利用和加工异体皮提供参考。方法 取复温后及移植后5～30 d的异体皮标本，少数病例同时获取异体皮下面的组织，石蜡切片、HE、Masson、PAS染色，光镜观察。结果 异体皮移植后5 d 其表皮层细胞出现泡状变性，逐渐与真皮层分离，形成水泡，然后剥脱。来源于创面的毛细血管长入异体真皮，并有炎症反应。手术后1～2 w，存活的自体微粒皮的表皮细胞在异体皮下方开始扩展，伴有新生的小血管。最后，异体真皮形成痂皮脱落，其下面新生的表皮覆盖创面。结论 异体皮覆盖烧伤创面后其表皮层很快出现泡状变性，形成水泡，溶解剥脱，因此在烧伤创面覆盖中不会起主要作用。起更大作用的是异体真皮，它不仅覆盖创面，而且当毛细血管长入异体真皮时可以为其下方的自体微粒皮的增殖和扩展提供营养环境。所以，在异体皮的制备过程中，不应该把断层后的真皮深层丢掉，而应该将其收集保存予以利用。
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中图号 R622.1
Pathologic studies on the covered allogeneic skin grafts in the treatment
of full-thickness skin burns with autogenic micro-skin
Gao Junming, Sun Shiquan, Fan Yana,et al
(Dept.of Burns and Plastic Surgery,People's Hospital of Shanxi Province， Taiyuan 030012)
Abstract Objective To assess the role of epidermal and dermal layers of allogeneic skin covering in the treatment of extensive burns with autogenic microskin for the reasonable utilization and processing of skin grafts.Methods The covred skin allografts were harvested 0 and 5～30 days after operation.Tissues under the skin allografts were also harvested in some cases.Histological sections were stained with HE，Masson and PAS staining.Results From 5 days,there were vesicular degeneration,cleavage,blister and sloughing of allo-epidermis,ingrowth of capillaries from the wound bed into the allo-dermis with inflammatory reaction.From weeks 1～2,the survived auto-skin expanded underneath the allo-dermis in the area of capillary ingrowth.Finally,the sloughed allo-dermis as a crust was separated from the healed new epidermis.Conclusion In the covered skin allografts,its allo-epidermal layer was degraded,sloughed and detached few days after operation ,and did not play an important role as the allo-dermal layer in the covering of wound.So the deep layer of allo-dermal layer during the processing of split-skin allografts should not be discarded and could be collected and used for burn covering.Ingrowth of capillaries into the allo-dermis will provide nourishing enviroment for the proliferation and expanding of autogenic microskin underneath.
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Key words skin transplantation; transplantation, homologous; transplantation, autologous; burns
大面积深度烧伤患者创面治疗采用自体微粒皮与异体皮移植可以取得较好的疗效[1]。本文收集9例临床病例，在自体微粒皮与异体皮移植后，对异体皮的变化及微粒皮的扩展进行了跟踪观察，重点了解断层异体皮的表皮层与真皮层的作用，为合理制备与应用异体皮提供临床证据。
1 材料与方法
本组9例大面积深度烧伤患者。男8例，女1例，年龄12～60岁，平均27岁；烧伤面积20%～87%，平均(52.88±35.20)%；Ⅲ度烧伤面积20%～77%，平均(35.10±20.88)%；创面于烧伤后5～8 d 切痂，平均6.3 d。切痂一般达深筋膜，如仍有坏死组织，则要彻底切除，充分止血，有条件时尽量保留浅静脉。其中1例因部分创面未达全层皮肤烧伤，故这些部位予以削痂。按张明良[1]方法移植自体微粒皮与异体断层皮。保持活性的异体断层皮由山西省医用组织库提供，厚度0.4～0.6 mm，取自合格的死亡供体，按美国组织库协会AATB的标准制备。移植前用40℃、0.9%无菌生理盐水复温，并取一小块异体皮做组织学检查。于移植术后5、10、20、30 d 分别取覆盖的异体皮，部分病例取异体皮下方的小块组织，经Bouin液固定，梯度酒精脱水、石蜡包埋、切片，HE、Masson、PAS染色，光镜观察。复温前部分异体皮还进行新鲜组织冷冻切片，做琥珀酸脱氢酶(SDH)染色(nitro-BT法)，观察皮肤活性。
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2 结果
2.1 异体皮植入前的组织学观察 复温后异体皮切片检查，可见表皮结构清晰，PAS阴性，基底膜PAS阳性，真皮胶原呈宽带状，Masson绿染，PAS弱阳性。复温前新鲜组织冷冻切片SDH染色显示异体表皮细胞蓝染，主要分布在基底细胞，说明异体皮保持活性，见图1。
图1 异体皮植入前的组织学观察 PAS ×130
2.2 异体皮与自体微粒皮移植后的临床观察 根据临床所见可以大体上分为以下三期。
2.2.1 异体表皮剥脱期(移植后3～14 d ) 术后5 d，出现散在的直径大约0.5～5 cm的形状不同的黄色水泡，水泡皮剥脱后露出异体真皮湿润、白色，以后逐渐变红；大致术后10 d，异体真皮开始退变死亡，出现散在黑色斑点。
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2.2.2 异体真皮干枯期(移植后10～30 d) 到术后20 d，干枯的黑褐色区域逐渐扩大，部分融合成片，黑色斑片之间仍为红色区域。
2.2.3 异体真皮剥脱期(移植后25～60 d) 干枯的异体真皮部分翘起，逐渐脱落，不伴有出血。术后大致60 d，覆盖的异体真皮完全脱落，其下方自体表皮生长扩展，创面愈合。
2.3 异体皮与自体微粒皮移植后的光镜观察
2.3.1 异体表皮剥脱期 术后5 d，异体表皮细胞泡状变性，水泡融合，与真皮面间形成裂隙，继而表皮剥脱，基底膜残留于真皮侧。真皮内有宿主血管长入伴有炎细胞浸润，异体真皮Masson染色仍为绿色，附着于真皮侧的基底膜仍为PAS阳性，真皮内增生的毛细血管周围有PAS阳性物质沉积。术后10 d，异体真皮内毛细血管增多。异体真皮下发现成活的来自自体微粒皮的表皮细胞团，伴有从宿主长入的小血管，表皮细胞团的周边部分为增生的基底细胞，中央部分出现角化，有时形成囊腔。此时，异体真皮胶原在Masson染色中呈红色或红、绿相间，说明真皮组织已经开始出现坏死。有时可见真皮乳头层为绿色，乳头下面的网状层呈红色，说明乳头层出现坏死的时间稍晚，见图2、3。
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图2 异体皮植入术后 5 d PAS ×130
图3 异体皮植入术后 10 d HE ×130
2.3.2 异体真皮干枯期 术后20 d，异体真皮内血管减少，形成痂皮。新生自体表皮逐渐增生形成连续层，角质层呈现完全角化或不完全角化，后者在角质层内有残存的细胞核，缺乏颗粒层。
2.3.3 异体真皮剥脱期 术后30 d，真皮剥脱，新生自体表皮扩展，互联并覆盖创面(图4)。
图4 异体皮植入术后 30 d HE ×250
3 讨论
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大面积深度烧伤患者自体皮源不足[2]，而异体皮具有防止创面感染、保护体液丢失的作用[3]。张明良[1]采用异体皮与自体微粒皮结合治疗Ⅲ度烧伤切痂创面，这样，异体皮为自体微粒皮提供了一个具有一定温度、湿度，pH值和氧张力的最适“创面小气候”(wound microclimate)[4]，为自体皮的成活创造了条件[5]，从而使自体微粒皮成活、增殖、加速了创面愈合。
自体皮在活体内培养中，异体皮的质量非常重要[1]。特别是异体皮在移植后1w内保持成活[5]，才能有利于自体微粒皮得到所需要的营养。通常使用的异体皮包括表皮层与真皮浅层。本文所见，异体表皮在术后1w内剥脱，说明在治疗中不会起主要作用。这可能与异体表皮免疫原性较高有关，而异体真皮免疫原性较低[6]，保留较长时间。实验证明，异体成纤维细胞与胶原纤维免疫原性微弱，真皮基质移植后不会引起明显的免疫排斥反应[7]。临床组织学观察也发现异体真皮移植后不被排斥。相反异体真皮可以促进宿主成纤维细胞和内皮细胞移行进入异体真皮中[2,3,7]，并促进表皮生长[8]。本文所见，覆盖的异体真皮中有来自宿主的小血管，血管周围出现粘多糖(PAS阳性)沉积，这是早期异体皮成活的证据。本文还看到，异体皮基底膜未随异体表皮脱落，残留于真皮侧，这样有利于异体皮的覆盖作用。分析其原因可能是因为基底膜通常由Ⅶ型胶原为主要成分的锚状纤维将自己固定于真皮上；半桥粒横跨基底膜，凭借其中的Ⅳ型胶原及层粘连蛋白和锚状纤维将表皮固定于真皮上。Ⅳ型胶原和层粘连蛋白是角朊细胞合成的，而锚状纤维则是由真皮细胞合成的[9]。表皮细胞被排斥后，Ⅳ型胶原及层粘连蛋白与基底膜的联系遭到破坏，而又无法重新合成修复，锚状纤维则仍将其底膜固定于真皮侧。
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随着自体微粒皮的成活与增殖扩展，切断了异体真皮来自宿主的血液供应，加之免疫排斥的不能完全避免，结果异体真皮开始发生死亡，临床上出现散在的黑褐色斑点，光镜下出现Masson染色中的红染区。有时可见真皮网状层在Masson染色中着红色而其乳头层着绿色。这可能是由于乳头层毛细血管丰富，形成乳头下血管网[10]，因而可以暂时缓解缺血造成的影响。但当自体微粒皮进一步扩展，异体真皮坏死区进一步扩大后，终将导致全层真皮的坏死与剥脱。这时自体微粒皮已经基本上相互连接成片，覆盖创面，使烧伤得到较好的愈合。
参考文献
1 Zhang ML,Chang ZD,Wang CY,et al.Microskin grafting in the treatment of extensive burns：a preliminary repoart.J Trauma, 1988, 28： 804～807
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2 Medalia DA,Eming SA,Tompkins RG,et al. Evaluation of human skin reconstituted from composite grafts of cultured keratinocytes and human acellular dermis transplanted to athymic mice.J Invest Dermatol, 1996, 107： 121～127
3 Omi T,Kawanani O,Matsuda K,et al.Histological characteristics of the healing process of frozen skin allograft used in the treatment of burns.Burns, 1996, 22： 206～211
4 Kaufman T,Hirshowitz B.The influence of various microclimate conditions on the burn wound：a review.Burns,1983,9：84～88
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5 Lin SD,Chou CK,Lai CS,et al.Microskin grafling of rabbits with pigskin xenograft overlay.Burns, 1991, 17： 473～477
6 Yukna RA,Turner DW,Robinson LJ.Variable antigenicity of lyphilized allogeneic and lyophilized xenogeneic skin in guinea pig.J Periodontal Res, 1977, 12： 197～201
7 Livesey SA,Herndon DW,Hollyoak MA,et al.Transplanted acellular allograft dermal matrix.Transplantation, 1995, 60： 1～9
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9 Cuono CB,Langdon R,Birchall N,et al.Composite autologous-allogeneic skin replacement：development and clinical application.Plast Reconstr Surg, 1987, 80： 626～635
10 Cormack DH.Ham′s histology：blood supply of skin.9th ed.Philadelphia：JB Lippincott Co， 1987. 467～468
[1998-12-22收稿], 百拇医药