吸入糖皮质激素对哮喘患者血小板活化作用的研究
作者：杜永成 孔晓梅 王予思
单位：(山西医科大学第一临床医学院呼吸内科 太原 030001)
关键词：哮喘；血小板活化；肾上腺皮质激素类；呼吸疗法
山西医科大学学报990204 摘要 目的 探讨缓解期哮喘患者血小板活化状态及糖皮质激素的影响。方法 采用流式细胞仪单抗检测方法，观察正常人及缓解期哮喘患者吸入二丙酸倍氯米松治疗6个月前后血小板膜糖蛋白(GP)的变化及与FEV1变化的关系。结果 缓解期哮喘患者治疗前 GPⅠb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa和GMP-140 较正常人升高 (均为P<0.05)。吸入二丙酸倍氯米松治疗后，哮喘GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GMP-140比治疗前降低(P<0.05)，而且GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 的变化均与FEV1的变化呈正相关关系。结论 缓解期哮喘患者存在血小板活化现象，吸入二丙酸倍氯米松可通过抑制血小板活化而减低气道阻力及气道慢性炎症；GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 可作为判定吸入糖皮质激素疗效的指标之一。
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中图号 R562.25 R977.11
Effect of corticosteroid aerosol on platelet activation
in patients with asthma
Du Yongcheng, Kong Xiaomei,Wang Yusi
(1st Clinical Medical College, Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract Objective To implore the platelet activation in patients with asthma and the effect of beclomethasone dipropionate inhalation aerosol (BDP).Methods By using flow cytometry the mean mode of glycoprotein GPⅠb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa、granule membrane protein-140(GMP-140) on platelets were measured in normal controls and asthmatic patients in remission before and after treatment with BDP. Meanwhile,the interrelation between GP and forced expiratory volume in one second to forced vital capacity ratio(FEV1) was studied.Results The GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX and GMP-140 in asthmatic patients in remission before treatment were significantly increased than those of normal subjects (P<0.05，respectively).GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX and GMP-140 of asthmatic patients after therapy were significantly lower than those before therapy (P<0.05，respectively). Multivariate general linear regression analysis demonstrated that the change of GPⅡb/Ⅲa and GMP-140 before and after therapy were positively associated with the change of FEV1. Conclusion The platelet activation exists in asthmatic patients in remission. Corticosteroid aerosol could inhibited the platelet activation and airway resistance.GPⅡb/Ⅲa and GMP-140 may be one of the indicator of corticosteroid treatment.
, 百拇医药
Key words asthma; platelet activation; adrenal cortexhormones; respiratory therapy
支气管哮喘(哮喘)主要表现为气道慢性变态反应性炎症，研究证实，即使在缓解期亦存在多种炎性细胞参与哮喘的慢性炎症过程[1]。但有关缓解期哮喘患者持续吸入糖皮质激素对血小板活化的作用及其应用的必要性尚少见报道。本研究采用流式细胞仪技术对血小板活化的有关指标进行测试，并对吸入二丙酸倍氯米松前后其变化与1秒用力呼气容积FEV1占用力肺活量比值间的关系进行了观察。
1 对象与方法
1.1 研究对象 缓解期哮喘患者 33 例，男 12 例，女 21 例，年龄 17～56岁，平均37±9.6岁，均符合1997年中华医学会呼吸分会哮喘诊断标准[2]，正常对照组 17 例，男 6 例，女 11 例，平均年龄34.1±9.2岁，哮喘患者均于吸入二丙酸倍氯米松800 μg/d前后采肘静脉血，同时测定FEV1的变化，正常对照组在抽血前测定FEV1。
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1.2 仪器及试剂 糖蛋白(GP)Ⅰb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa和GMP-140的单克隆抗体CDW42、SZ-1、CDW41、CD62分别购自北京邦定生物医学公司及苏州医学院血栓室；鼠IgG及羊抗鼠免疫球蛋白G-异硫氰酸荧光素(IgG-FITC)抗体均为Sigma产品；其他试剂为国产标准生化试剂。流式细胞仪为美国Becton-Dickinson公司产品；DDL-5型低速冷冻离心机为上海安亭科学仪器厂产品；Chest 25 型肺功能测定仪为日本进口产品。
1.3 方法
1.3.1 血小板悬液制备 采肘静脉血5 ml，用枸橼酸钠抗凝，梯度离心制备血小板后，加入ACD抗凝剂使血小板悬浮，再加入1 ml Tyaode 液混匀，洗涤后用 TES 使血小板悬浮，再加入等体积2%多聚甲醛室温固定30 min，置4℃冰箱待测。
1.3.2 流式细胞仪检测血小板膜受体糖蛋白(GP) 固定后的血小板加入相应的单抗100 μl，室温孵育30 min；加入1 ml TES 悬浮液，再加入 1 ml Tyaode 液 2 500 r/min 离心10 min后，加入FITC羊抗鼠IgG 100 μl，室温闭光孵育30 min后，用同样方法洗涤血小板后，加入1 ml TES悬浮血小板，上机检测，主要观测指标用荧光道数(Mode)表示。
, 百拇医药
1.4 统计方法 数据以均数加减标准差(x±s)表示，分别用配对t检验、方差分析和逐步回归分析。
2 结果
2.1 哮喘组和正常组血小板膜GP变化 见表1。哮喘组治疗前GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX和GMP-140的水平均较正常人显著增高(均为P<0.05)，哮喘患者吸入二丙酸倍氯米松治疗后GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GMP-140比治疗前显著降低(P<0.05)。
表1 正常组和哮喘组GP的变化 (Mode，±s) 组别
n
GPⅠb
GPⅠb/ⅠX
GPⅡb/Ⅲa
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GMP-140
正常组
17
79.88±5.72
88.36±6.53
86.789±5.5
84.02±7.3
哮喘治疗前
33
83.33±7.09*
90.18±6.71*
87.42±6.81*
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90.48±9.05*
哮喘治疗后
33
82.35±5.59＃
87.6±6.58
86.83±5.77＃
85.65±6.71＃
注：与对照组相比P<0.05； 与治疗前相比#P<0.05
2.2 哮喘组吸入二丙酸倍氯米松后FEV1(96.2±15.9)%较治疗前(81.8±17.3)%增高(P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 多元回归结果提示，哮喘组治疗前后 GP 的变化中，以GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 的变化与FEV1的变化呈正相关(多元逐步回归方程：Y=-3.631-0.332 1 X1-0.207 5 X2-0.623 7 X3-0.627 7 X4) (P<0.05)。
3 讨论
哮喘气道慢性炎症的发病机制涉及多方面因素，其中有关血小板活化的状况是近年研究的热点，研究证实血小板活化与各种类型哮喘有关[3]，但有关缓解期哮喘的血小板活化状态的研究报道尚少见。研究表明，血小板质膜含有大量的糖蛋白(GP)，血小板活化时 GP 常发生显著性变化，成为活化血小板的分子标志物[4，5]，本研究采用流式细胞仪单抗标记测定哮喘患者血小板 GP 的变化，表现为GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX和GMP-140均明显增高，提示缓解期哮喘患者也存在一定程度的血小板活化，而参与其慢性炎症过程。血小板作为一种炎性细胞可直接引发炎症[6]。同时还可通过其活化后释放的生物活性物质，如花生四烯酸代谢产物及PAF、5-HT等促进嗜酸性粒细胞聚集而参与炎症反应的持续。
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糖皮质激素是最有效的抗炎药物，主要通过干扰花生四烯酸代谢，减少微血管渗漏，抑制细胞因子生成等而发挥作用。吸入糖皮质激素主要作用于呼吸道局部，因全身不良作用很少发生而被广泛应用，并受到重视。但有关其对血小板活化状态的影响及较长期应用吸入激素治疗对缓解期患者的疗效观察尚未见报道。本研究结果显示，连续吸入二丙酸倍氯米松6个月，哮喘患者的FEV1得到进一步改善，FEV1的变化与血小板受体糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GMP-140的变化呈显著正相关，提示持续吸入糖皮质激素确实可以改善哮喘患者的肺功能，并可能与减低血小板活化程度有关，同时也提示吸入糖皮质激素治疗缓解期哮喘的必要性。反映血小板活化状态的指标GPⅡb/Ⅲa和GMP-140可作为其监测指标之一。有关糖皮质激素活化血小板作用的机制尚不十分清楚，可能与下列原因有关：GPⅡb/Ⅲa和GMP-140均存在于活化血小板膜表面，并且在钙离子的存在下参与血小板聚集、粘附等功能，糖皮质激素可诱导合成脂质素作用于钙通道而减少钙内流，从而抑制血小板活化，但还需要进一步探讨。
, 百拇医药
综上所述，本研究结果显示，缓解期哮喘患者存在血小板活化现象，长期吸入糖皮质激素可减轻哮喘气道慢性炎症，GPⅡb/Ⅲa和GMP-140等可作为判定吸入糖皮质激素治疗疗效的指标之一。
山西省自然科学基金资助项目
参考文献
1 Willian WB, Robert LC, Coffman EW, et al.Mechanisms of persistent airway inflammation in asthma: A role for T cells and T cell products. Am J Respir Crit Care Med, 1995,152:388～393
2 支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案).中华结核和呼吸杂志，1997，20(4)：261～267
, http://www.100md.com
3 吴国新.哮喘发作时血小板活化程度的研究.中华结核和呼吸杂志，1992，2(1)：1
4 Corash L. Measurement of platelet activation by fluorescence-activated flow cytometry. Blood,1990,16:97～100
5 Abrams C, Shattil SJ. Immunological detection of activation platelets in clinical disorders. Thromb Haemost, 1991，65:467～470
6 Nachman RE. The platelet as an inflammation cell. J Cell Biol, 1980,20:145～149
[1999-03-27 收稿], 百拇医药
单位：(山西医科大学第一临床医学院呼吸内科 太原 030001)
关键词：哮喘；血小板活化；肾上腺皮质激素类；呼吸疗法
山西医科大学学报990204 摘要 目的 探讨缓解期哮喘患者血小板活化状态及糖皮质激素的影响。方法 采用流式细胞仪单抗检测方法，观察正常人及缓解期哮喘患者吸入二丙酸倍氯米松治疗6个月前后血小板膜糖蛋白(GP)的变化及与FEV1变化的关系。结果 缓解期哮喘患者治疗前 GPⅠb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa和GMP-140 较正常人升高 (均为P<0.05)。吸入二丙酸倍氯米松治疗后，哮喘GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GMP-140比治疗前降低(P<0.05)，而且GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 的变化均与FEV1的变化呈正相关关系。结论 缓解期哮喘患者存在血小板活化现象，吸入二丙酸倍氯米松可通过抑制血小板活化而减低气道阻力及气道慢性炎症；GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 可作为判定吸入糖皮质激素疗效的指标之一。
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中图号 R562.25 R977.11
Effect of corticosteroid aerosol on platelet activation
in patients with asthma
Du Yongcheng, Kong Xiaomei,Wang Yusi
(1st Clinical Medical College, Shanxi Medical University,Taiyuan 030001)
Abstract Objective To implore the platelet activation in patients with asthma and the effect of beclomethasone dipropionate inhalation aerosol (BDP).Methods By using flow cytometry the mean mode of glycoprotein GPⅠb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa、granule membrane protein-140(GMP-140) on platelets were measured in normal controls and asthmatic patients in remission before and after treatment with BDP. Meanwhile,the interrelation between GP and forced expiratory volume in one second to forced vital capacity ratio(FEV1) was studied.Results The GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX and GMP-140 in asthmatic patients in remission before treatment were significantly increased than those of normal subjects (P<0.05，respectively).GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX and GMP-140 of asthmatic patients after therapy were significantly lower than those before therapy (P<0.05，respectively). Multivariate general linear regression analysis demonstrated that the change of GPⅡb/Ⅲa and GMP-140 before and after therapy were positively associated with the change of FEV1. Conclusion The platelet activation exists in asthmatic patients in remission. Corticosteroid aerosol could inhibited the platelet activation and airway resistance.GPⅡb/Ⅲa and GMP-140 may be one of the indicator of corticosteroid treatment.
, 百拇医药
Key words asthma; platelet activation; adrenal cortexhormones; respiratory therapy
支气管哮喘(哮喘)主要表现为气道慢性变态反应性炎症，研究证实，即使在缓解期亦存在多种炎性细胞参与哮喘的慢性炎症过程[1]。但有关缓解期哮喘患者持续吸入糖皮质激素对血小板活化的作用及其应用的必要性尚少见报道。本研究采用流式细胞仪技术对血小板活化的有关指标进行测试，并对吸入二丙酸倍氯米松前后其变化与1秒用力呼气容积FEV1占用力肺活量比值间的关系进行了观察。
1 对象与方法
1.1 研究对象 缓解期哮喘患者 33 例，男 12 例，女 21 例，年龄 17～56岁，平均37±9.6岁，均符合1997年中华医学会呼吸分会哮喘诊断标准[2]，正常对照组 17 例，男 6 例，女 11 例，平均年龄34.1±9.2岁，哮喘患者均于吸入二丙酸倍氯米松800 μg/d前后采肘静脉血，同时测定FEV1的变化，正常对照组在抽血前测定FEV1。
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1.2 仪器及试剂 糖蛋白(GP)Ⅰb、GPⅠb/ⅠX、GPⅡb/Ⅲa和GMP-140的单克隆抗体CDW42、SZ-1、CDW41、CD62分别购自北京邦定生物医学公司及苏州医学院血栓室；鼠IgG及羊抗鼠免疫球蛋白G-异硫氰酸荧光素(IgG-FITC)抗体均为Sigma产品；其他试剂为国产标准生化试剂。流式细胞仪为美国Becton-Dickinson公司产品；DDL-5型低速冷冻离心机为上海安亭科学仪器厂产品；Chest 25 型肺功能测定仪为日本进口产品。
1.3 方法
1.3.1 血小板悬液制备 采肘静脉血5 ml，用枸橼酸钠抗凝，梯度离心制备血小板后，加入ACD抗凝剂使血小板悬浮，再加入1 ml Tyaode 液混匀，洗涤后用 TES 使血小板悬浮，再加入等体积2%多聚甲醛室温固定30 min，置4℃冰箱待测。
1.3.2 流式细胞仪检测血小板膜受体糖蛋白(GP) 固定后的血小板加入相应的单抗100 μl，室温孵育30 min；加入1 ml TES 悬浮液，再加入 1 ml Tyaode 液 2 500 r/min 离心10 min后，加入FITC羊抗鼠IgG 100 μl，室温闭光孵育30 min后，用同样方法洗涤血小板后，加入1 ml TES悬浮血小板，上机检测，主要观测指标用荧光道数(Mode)表示。
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1.4 统计方法 数据以均数加减标准差(x±s)表示，分别用配对t检验、方差分析和逐步回归分析。
2 结果
2.1 哮喘组和正常组血小板膜GP变化 见表1。哮喘组治疗前GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX和GMP-140的水平均较正常人显著增高(均为P<0.05)，哮喘患者吸入二丙酸倍氯米松治疗后GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GMP-140比治疗前显著降低(P<0.05)。
表1 正常组和哮喘组GP的变化 (Mode，±s) 组别
n
GPⅠb
GPⅠb/ⅠX
GPⅡb/Ⅲa
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GMP-140
正常组
17
79.88±5.72
88.36±6.53
86.789±5.5
84.02±7.3
哮喘治疗前
33
83.33±7.09*
90.18±6.71*
87.42±6.81*
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90.48±9.05*
哮喘治疗后
33
82.35±5.59＃
87.6±6.58
86.83±5.77＃
85.65±6.71＃
注：与对照组相比P<0.05； 与治疗前相比#P<0.05
2.2 哮喘组吸入二丙酸倍氯米松后FEV1(96.2±15.9)%较治疗前(81.8±17.3)%增高(P<0.05)。
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2.3 多元回归结果提示，哮喘组治疗前后 GP 的变化中，以GPⅡb/Ⅲa、GMP-140 的变化与FEV1的变化呈正相关(多元逐步回归方程：Y=-3.631-0.332 1 X1-0.207 5 X2-0.623 7 X3-0.627 7 X4) (P<0.05)。
3 讨论
哮喘气道慢性炎症的发病机制涉及多方面因素，其中有关血小板活化的状况是近年研究的热点，研究证实血小板活化与各种类型哮喘有关[3]，但有关缓解期哮喘的血小板活化状态的研究报道尚少见。研究表明，血小板质膜含有大量的糖蛋白(GP)，血小板活化时 GP 常发生显著性变化，成为活化血小板的分子标志物[4，5]，本研究采用流式细胞仪单抗标记测定哮喘患者血小板 GP 的变化，表现为GPⅠb、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/ⅠX和GMP-140均明显增高，提示缓解期哮喘患者也存在一定程度的血小板活化，而参与其慢性炎症过程。血小板作为一种炎性细胞可直接引发炎症[6]。同时还可通过其活化后释放的生物活性物质，如花生四烯酸代谢产物及PAF、5-HT等促进嗜酸性粒细胞聚集而参与炎症反应的持续。
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糖皮质激素是最有效的抗炎药物，主要通过干扰花生四烯酸代谢，减少微血管渗漏，抑制细胞因子生成等而发挥作用。吸入糖皮质激素主要作用于呼吸道局部，因全身不良作用很少发生而被广泛应用，并受到重视。但有关其对血小板活化状态的影响及较长期应用吸入激素治疗对缓解期患者的疗效观察尚未见报道。本研究结果显示，连续吸入二丙酸倍氯米松6个月，哮喘患者的FEV1得到进一步改善，FEV1的变化与血小板受体糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GMP-140的变化呈显著正相关，提示持续吸入糖皮质激素确实可以改善哮喘患者的肺功能，并可能与减低血小板活化程度有关，同时也提示吸入糖皮质激素治疗缓解期哮喘的必要性。反映血小板活化状态的指标GPⅡb/Ⅲa和GMP-140可作为其监测指标之一。有关糖皮质激素活化血小板作用的机制尚不十分清楚，可能与下列原因有关：GPⅡb/Ⅲa和GMP-140均存在于活化血小板膜表面，并且在钙离子的存在下参与血小板聚集、粘附等功能，糖皮质激素可诱导合成脂质素作用于钙通道而减少钙内流，从而抑制血小板活化，但还需要进一步探讨。
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综上所述，本研究结果显示，缓解期哮喘患者存在血小板活化现象，长期吸入糖皮质激素可减轻哮喘气道慢性炎症，GPⅡb/Ⅲa和GMP-140等可作为判定吸入糖皮质激素治疗疗效的指标之一。
山西省自然科学基金资助项目
参考文献
1 Willian WB, Robert LC, Coffman EW, et al.Mechanisms of persistent airway inflammation in asthma: A role for T cells and T cell products. Am J Respir Crit Care Med, 1995,152:388～393
2 支气管哮喘防治指南(支气管哮喘的定义、诊断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案).中华结核和呼吸杂志，1997，20(4)：261～267
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3 吴国新.哮喘发作时血小板活化程度的研究.中华结核和呼吸杂志，1992，2(1)：1
4 Corash L. Measurement of platelet activation by fluorescence-activated flow cytometry. Blood,1990,16:97～100
5 Abrams C, Shattil SJ. Immunological detection of activation platelets in clinical disorders. Thromb Haemost, 1991，65:467～470
6 Nachman RE. The platelet as an inflammation cell. J Cell Biol, 1980,20:145～149
[1999-03-27 收稿], 百拇医药