三苯氧胺和白介素-6对人乳腺癌细胞凋亡的影响
作者：梁福佑 戎煜 王箐 陈莉 潘颖
单位：梁福佑 戎煜 陈莉 潘颖：首都医科大学细胞生物学教研室；王箐：北京联合大学
关键词：三苯氧胺；白细胞介素-6；细胞凋亡；流式细胞术；乳腺癌
首都医科大学学报990101 梁福佑 戎煜 王箐 陈莉 潘颖
提要：应用雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株(MCF-7细胞)，在体外培养条件下，观察三苯氧胺(TAM)和重组人白细胞介素-6(IL-6)对该细胞凋亡的影响。样品经碘化丙啶(PI)染色后用EPICS-ELITE流式细胞仪测定并分析。结果表明，TAM和IL-6皆可诱导MCF-7细胞凋亡，与对照组相比具显著性差异(P<0.01)。若将TAM和IL-6联合应用，其诱导MCF-7细胞凋亡数明显上升，与单药应用比较具非常显著性差异(P<0.01)，提示2药合用的效果不是简单的加成而是协同作用。
, 百拇医药
中图分类号： R737.9
Effect of Tamoxifen and
Interleukin-6 on Apoptosis in MCF-7
Human Breast Cancer Cells in Vitro
Liang Fuyou,Rong Yu,Chen Li,Pan Ying
Department of Biology,Capital University of Medical Sciences
Wang Qingyu*
Beijing Union University
, 百拇医药
Abstract:The effect of tamoxifen(TAM) and interleukin-6(IL-6) on apoptosis in estrogen receptor-positive human breast cancer cell line(MCF-7) was studied. The sample cells stained by propidium iodide(PI) were detected,analyzed and fitted by FCM. The result showed that TAM and IL-6 could induce apoptosis of MCF-7 cells,the difference of apoptotic ratio between the control group and the treatment group was significant respectively. The cell apoptosis was enhanced when combining treatment with TAM and IL-6 was performed. The increase rate is much higher than that of either TAM or IL-6 alone,the differences were significant. The data indicated that the effect of TAM combined IL-6 is not an additive interraction,but possibly a synergistic interraction.
, 百拇医药
Key words: TAM; IL-6; apoptosis; FCM; preast cncer
三苯氧胺(tamoxifen,TAM)是非激素类抗癌药，由于其能够封闭雌激素受体(ER)所中介的细胞增殖活性而呈现拮抗雌激素作用，故被广泛用于治疗雌激素依赖性乳腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤[1，2]。TAM的疗效机制还不十分清楚，但其诱导人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)等癌细胞凋亡作用已有多个实验证实[3，4]，国内尚缺乏类似研究报道。
白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能细胞因子，对造血系统、消化系统、内分泌系统、神经系统和免疫系统等具有广泛作用。Adams等的研究表明，IL-6对培养的MCF-7细胞增生有抑制作用[5，6]，这与IL-6可增强17β-羟基甾醇脱氢酶活性及调节细胞中雌激素受体和孕酮受体含量有关。但是国内外在IL-6影响MCF-7细胞凋亡方面的研究鲜见报道。因此，本资料研究了TAM和IL-6单独或合并用药对MCF-7细胞凋亡的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
细胞系：实验用MCF-7细胞为雌激素受体阳性人乳腺癌细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所范贤俊教授惠赠。
药品试剂：RPMI 1640购自GIBCO公司；胎牛血清(FCS)购自中国医学科学院血液学研究所；雌二醇(E2)、TAM和碘化丙啶(PI)均为Sigma公司产品；IL-6购自北京仁达保健品公司，比活性为每mg蛋白1×107 IU。
EPICS-ELITE流式细胞仪为美国Coulter公司产品，数据收集处理软件为该机所附。6孔培养板购自丹麦Nuclon公司。
细胞培养：培养基为RPMI 1640液，含有5% FCS、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/L)。接种MCF-7细胞后于100 mL培养瓶中，在37 ℃二氧化碳(5%)培养箱中培养待用。实验时取对数生长期的MCF-7细胞，制备成单细胞悬液(1×107 mL-1)，接种于6孔培养板中，每孔1×105，置温箱培养，第2天或第3天进行药物处理实验。
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E2处理实验：将E2溶于无水乙醇中，使成浓度10 mmol/L的贮存液，-20 ℃冰柜保存。在细胞满接种第3天分别加入E2液，浓度梯度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L，每一浓度平行3孔，使各浓度孔的乙醇体积分数不超过0.1%。同时设空白对照组3孔，其不加E2但含相应体积分数的乙醇。置孵箱培养72 h后收集细胞，用台盼蓝排斥法计数细胞。
TAM和IL-6处理实验：TAM贮存液的制备同E2。IL-6于临用时以三蒸水溶解。MCF-7细胞在6孔板中培养24 h后用E2预处理(E2终浓度为1×10-9 mol/L)，处理24 h后离心洗涤，换入含有TAM和(或)IL-6的新鲜培养液，继续培养24 h，收集各组细胞测定凋亡。
, 百拇医药
本研究使用双因素实验设计，分以下6组：对照组；TAM 1×10-6 mol/L组；TAM 1×10-5 mol/L组；IL-6 1×104 IU/mL组；TAM(1×10-6 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)组；TAM(1×10-5 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)组。对所得结果使用有交互作用的双因素方差分析方法进行统计学处理。各组溶液的乙醇体积分数皆不超过0.1%。
MCF-7细胞凋亡的检测：使用EPICS-ELITE型流式细胞仪对MCF-7细胞进行流式细胞术(FCM)检测。激光波长488 nm，输出功率100 mW，对每个样品取1万个细胞。样品制备：收取各孔细胞，分别用PBS(pH 7.2)离心洗涤2次，用70%冷乙醇(4 ℃)固定细胞12 h以上置冰箱保存。测试时取出乙醇固定的细胞，用PBS洗涤2次后用PI(终质量浓度10 mg/L)染DNA，15 min后上机检测。用随机所带专用软件包存贮和分析数据。
, 百拇医药
2 结果和讨论
E2对MCF-7细胞增殖的影响见表1。激素依赖的人乳腺癌MCF-7细胞在不同浓度E2作用下，呈现不同的生长反应：低浓度(1×10-10～1×10-9 mol/L)E2可以刺激细胞增殖，高浓度(1×10-8～1×10-6 mol/L)则抑制细胞增殖。
表1 E2对MCF-7细胞增殖的影响 c(E2)/(mol.L-1)
每孔细胞数/×104
0(对照组)
, 百拇医药
33.1±0.7
1×10-10
40.8±1.3
1×10-9
35.4±1.8
1×10-8
31.4±0.5
1×10-7
27.4±1.2*
1×10-6
10.3±1.4**
, 百拇医药
各组n=3；与对照组比较*P<0.01，**P<0.001 流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡的计算机拟合图表明，经药物处理过的或对照细胞样品经固定和PI染色后上机进行FCM检测，由于凋亡细胞内DNA含量降低，在检测到二倍体细胞DNA峰(G1峰)之前出现1个亚峰即凋亡峰(Ap峰)。Ap峰的高低表示发生凋亡细胞数的多少，以所占被测细胞总数的百分比表示。
FCM检测MCF-7细胞凋亡结果的比较见表2。TAM和IL-6对凋亡都有显著作用(P<0.01)，并且TAM与IL-6具有协同作用(P<0.01)。从表2可以看出，当IL-6(1×104 IU/mL)与TAM(1×10-6 mol/L)合并用药作用于MCF-7细胞时，其诱导细胞凋亡百分率最高。
表2 TAM和IL-6对MCF-7细胞凋亡的诱导作用 组别
凋亡/%
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对照组
2.6±2.2
TAM(1×10-6 mol/L)
13.9±3.6**
TAM(1×10-5 mol/L)
6.2±3.3**
IL-6(1×104 IU/mL)
14.9±3.6**
TAM(1×10-6 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)
, 百拇医药
42.9±3.3△△
TAM(1×10-5 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)
29.5±1.3△△
**与对照组比较P<0.01；△ △与其他4组比较P<0.01 TAM是很有前途的非激素类抗乳腺癌药，但其作用机制尚不十分清楚。近年来，TAM诱导MCF-7等细胞凋亡的作用逐渐成为研究热点之一，但国内缺乏应用流式细胞术(FCM)检测TAM对MCF-7细胞凋亡的研究报告[1～4]。Perry等的研究表明，TAM的作用与抑制MCF-7细胞生长、细胞形态学特异性改变和细胞凋亡密切相关，转化生长因子β1(TGFβ1)可能是TAM诱导细胞凋亡的中介物质[4]。本研究结果也证实，TAM可以对抗E2，诱导MCF-7细胞凋亡，1×10-6 mol/L的TAM诱导细胞凋亡百分率可达13.9%，而1×10-5 mol/L浓度时，凋亡率反而下降(6.2%)，可能TAM在较高浓度时通过其他机制杀伤MCF-7细胞。
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IL-6作为一种多功能细胞因子，参与MCF-7细胞代谢而发挥抑制作用[7]。IL-6(1×104 IU/mL)单独应用对MCF-7细胞生长的抑制率为29.2%，当用E2(1×10-9 mol/L)预处理MCF-7细胞，能够中和E2，抑制率仍达23.2%，IL-6与IL-1合并作用则明显高于分别单独应用[7]。本研究结果表明，IL-6(1×104 IU/mL)可以诱导MCF-7细胞凋亡，其作用强度与TAM(1×10-6 mol/L)相当。如果IL-6和TAM联合用药，2者的作用显著增强，凋亡诱导率(42.9%和29.5%)明显高于2者单独应用时诱导率之和，表明IL-6和TAM合并用药非一般的加成作用而表现为协同(synergy)作用。这将给临床提供新的联合用药方案，其作用机制有待进一步研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Taiyesimi I A,Buzuar A U,Decker D A. Use of tamoxifen for breast cancer: Twenty-eight years later. J Clin Oncol,1995,13:513～529
2 Markman M,Iseminger K A,Hatch K D. Tamoxifen in platinum-refractory ovarian cancer: A gynecologic oncology group ancillary report. Gynecol Oncol,1996,62:4～6
3 Ercoli A,Scambia G,Fattorossi A. Comparative study on the induction of cytostasis and apoptosis by ICI182780 and tamoxifen in an estrogen receptor-negative ovarian cancer cell line. Int J Cancer,1998,76:47～54
, 百拇医药
4 Perry R R,Kang Y,Greaves B R. Relationship between tamoxifen-induced transforming growth factor expression,cytostasis and apoptosis in humen breast cancer cells. Br J Cancer,1995,72:1441～1446
5 Adams E F,Rafferty B,White M C. Interleukin-6 is secreted by breast possible paracrine regulation of breast 17β-oestradiol levels. Int J Cancer,1991,49:118～121
6 Speirs V,Adams E F,White M C. Interactive effects of interleukin-6,17β-estradiol and progesterone on growth and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activity in human breast carcinoma cells. J Steroid Biochem Molec Biol,1993,46:11～15
7 David N,Danforth J,Magdalene K S. Interleukin-1a and interleukin-6 act additively to inhibit growth of MCF-7 breast cancer cells in vivtro. Cancer Res,1993,53:1538～1545
收稿日期：1999-01-11, http://www.100md.com
单位：梁福佑 戎煜 陈莉 潘颖：首都医科大学细胞生物学教研室；王箐：北京联合大学
关键词：三苯氧胺；白细胞介素-6；细胞凋亡；流式细胞术；乳腺癌
首都医科大学学报990101 梁福佑 戎煜 王箐 陈莉 潘颖
提要：应用雌激素受体阳性的人乳腺癌细胞株(MCF-7细胞)，在体外培养条件下，观察三苯氧胺(TAM)和重组人白细胞介素-6(IL-6)对该细胞凋亡的影响。样品经碘化丙啶(PI)染色后用EPICS-ELITE流式细胞仪测定并分析。结果表明，TAM和IL-6皆可诱导MCF-7细胞凋亡，与对照组相比具显著性差异(P<0.01)。若将TAM和IL-6联合应用，其诱导MCF-7细胞凋亡数明显上升，与单药应用比较具非常显著性差异(P<0.01)，提示2药合用的效果不是简单的加成而是协同作用。
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中图分类号： R737.9
Effect of Tamoxifen and
Interleukin-6 on Apoptosis in MCF-7
Human Breast Cancer Cells in Vitro
Liang Fuyou,Rong Yu,Chen Li,Pan Ying
Department of Biology,Capital University of Medical Sciences
Wang Qingyu*
Beijing Union University
, 百拇医药
Abstract:The effect of tamoxifen(TAM) and interleukin-6(IL-6) on apoptosis in estrogen receptor-positive human breast cancer cell line(MCF-7) was studied. The sample cells stained by propidium iodide(PI) were detected,analyzed and fitted by FCM. The result showed that TAM and IL-6 could induce apoptosis of MCF-7 cells,the difference of apoptotic ratio between the control group and the treatment group was significant respectively. The cell apoptosis was enhanced when combining treatment with TAM and IL-6 was performed. The increase rate is much higher than that of either TAM or IL-6 alone,the differences were significant. The data indicated that the effect of TAM combined IL-6 is not an additive interraction,but possibly a synergistic interraction.
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Key words: TAM; IL-6; apoptosis; FCM; preast cncer
三苯氧胺(tamoxifen,TAM)是非激素类抗癌药，由于其能够封闭雌激素受体(ER)所中介的细胞增殖活性而呈现拮抗雌激素作用，故被广泛用于治疗雌激素依赖性乳腺癌和卵巢癌等恶性肿瘤[1，2]。TAM的疗效机制还不十分清楚，但其诱导人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)等癌细胞凋亡作用已有多个实验证实[3，4]，国内尚缺乏类似研究报道。
白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能细胞因子，对造血系统、消化系统、内分泌系统、神经系统和免疫系统等具有广泛作用。Adams等的研究表明，IL-6对培养的MCF-7细胞增生有抑制作用[5，6]，这与IL-6可增强17β-羟基甾醇脱氢酶活性及调节细胞中雌激素受体和孕酮受体含量有关。但是国内外在IL-6影响MCF-7细胞凋亡方面的研究鲜见报道。因此，本资料研究了TAM和IL-6单独或合并用药对MCF-7细胞凋亡的影响。
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1 材料和方法
细胞系：实验用MCF-7细胞为雌激素受体阳性人乳腺癌细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所范贤俊教授惠赠。
药品试剂：RPMI 1640购自GIBCO公司；胎牛血清(FCS)购自中国医学科学院血液学研究所；雌二醇(E2)、TAM和碘化丙啶(PI)均为Sigma公司产品；IL-6购自北京仁达保健品公司，比活性为每mg蛋白1×107 IU。
EPICS-ELITE流式细胞仪为美国Coulter公司产品，数据收集处理软件为该机所附。6孔培养板购自丹麦Nuclon公司。
细胞培养：培养基为RPMI 1640液，含有5% FCS、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 mg/L)。接种MCF-7细胞后于100 mL培养瓶中，在37 ℃二氧化碳(5%)培养箱中培养待用。实验时取对数生长期的MCF-7细胞，制备成单细胞悬液(1×107 mL-1)，接种于6孔培养板中，每孔1×105，置温箱培养，第2天或第3天进行药物处理实验。
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E2处理实验：将E2溶于无水乙醇中，使成浓度10 mmol/L的贮存液，-20 ℃冰柜保存。在细胞满接种第3天分别加入E2液，浓度梯度分别为1×10-10、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L，每一浓度平行3孔，使各浓度孔的乙醇体积分数不超过0.1%。同时设空白对照组3孔，其不加E2但含相应体积分数的乙醇。置孵箱培养72 h后收集细胞，用台盼蓝排斥法计数细胞。
TAM和IL-6处理实验：TAM贮存液的制备同E2。IL-6于临用时以三蒸水溶解。MCF-7细胞在6孔板中培养24 h后用E2预处理(E2终浓度为1×10-9 mol/L)，处理24 h后离心洗涤，换入含有TAM和(或)IL-6的新鲜培养液，继续培养24 h，收集各组细胞测定凋亡。
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本研究使用双因素实验设计，分以下6组：对照组；TAM 1×10-6 mol/L组；TAM 1×10-5 mol/L组；IL-6 1×104 IU/mL组；TAM(1×10-6 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)组；TAM(1×10-5 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)组。对所得结果使用有交互作用的双因素方差分析方法进行统计学处理。各组溶液的乙醇体积分数皆不超过0.1%。
MCF-7细胞凋亡的检测：使用EPICS-ELITE型流式细胞仪对MCF-7细胞进行流式细胞术(FCM)检测。激光波长488 nm，输出功率100 mW，对每个样品取1万个细胞。样品制备：收取各孔细胞，分别用PBS(pH 7.2)离心洗涤2次，用70%冷乙醇(4 ℃)固定细胞12 h以上置冰箱保存。测试时取出乙醇固定的细胞，用PBS洗涤2次后用PI(终质量浓度10 mg/L)染DNA，15 min后上机检测。用随机所带专用软件包存贮和分析数据。
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2 结果和讨论
E2对MCF-7细胞增殖的影响见表1。激素依赖的人乳腺癌MCF-7细胞在不同浓度E2作用下，呈现不同的生长反应：低浓度(1×10-10～1×10-9 mol/L)E2可以刺激细胞增殖，高浓度(1×10-8～1×10-6 mol/L)则抑制细胞增殖。
表1 E2对MCF-7细胞增殖的影响 c(E2)/(mol.L-1)
每孔细胞数/×104
0(对照组)
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33.1±0.7
1×10-10
40.8±1.3
1×10-9
35.4±1.8
1×10-8
31.4±0.5
1×10-7
27.4±1.2*
1×10-6
10.3±1.4**
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各组n=3；与对照组比较*P<0.01，**P<0.001 流式细胞仪检测MCF-7细胞凋亡的计算机拟合图表明，经药物处理过的或对照细胞样品经固定和PI染色后上机进行FCM检测，由于凋亡细胞内DNA含量降低，在检测到二倍体细胞DNA峰(G1峰)之前出现1个亚峰即凋亡峰(Ap峰)。Ap峰的高低表示发生凋亡细胞数的多少，以所占被测细胞总数的百分比表示。
FCM检测MCF-7细胞凋亡结果的比较见表2。TAM和IL-6对凋亡都有显著作用(P<0.01)，并且TAM与IL-6具有协同作用(P<0.01)。从表2可以看出，当IL-6(1×104 IU/mL)与TAM(1×10-6 mol/L)合并用药作用于MCF-7细胞时，其诱导细胞凋亡百分率最高。
表2 TAM和IL-6对MCF-7细胞凋亡的诱导作用 组别
凋亡/%
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对照组
2.6±2.2
TAM(1×10-6 mol/L)
13.9±3.6**
TAM(1×10-5 mol/L)
6.2±3.3**
IL-6(1×104 IU/mL)
14.9±3.6**
TAM(1×10-6 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)
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42.9±3.3△△
TAM(1×10-5 mol/L)+IL-6(1×104 IU/mL)
29.5±1.3△△
**与对照组比较P<0.01；△ △与其他4组比较P<0.01 TAM是很有前途的非激素类抗乳腺癌药，但其作用机制尚不十分清楚。近年来，TAM诱导MCF-7等细胞凋亡的作用逐渐成为研究热点之一，但国内缺乏应用流式细胞术(FCM)检测TAM对MCF-7细胞凋亡的研究报告[1～4]。Perry等的研究表明，TAM的作用与抑制MCF-7细胞生长、细胞形态学特异性改变和细胞凋亡密切相关，转化生长因子β1(TGFβ1)可能是TAM诱导细胞凋亡的中介物质[4]。本研究结果也证实，TAM可以对抗E2，诱导MCF-7细胞凋亡，1×10-6 mol/L的TAM诱导细胞凋亡百分率可达13.9%，而1×10-5 mol/L浓度时，凋亡率反而下降(6.2%)，可能TAM在较高浓度时通过其他机制杀伤MCF-7细胞。
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IL-6作为一种多功能细胞因子，参与MCF-7细胞代谢而发挥抑制作用[7]。IL-6(1×104 IU/mL)单独应用对MCF-7细胞生长的抑制率为29.2%，当用E2(1×10-9 mol/L)预处理MCF-7细胞，能够中和E2，抑制率仍达23.2%，IL-6与IL-1合并作用则明显高于分别单独应用[7]。本研究结果表明，IL-6(1×104 IU/mL)可以诱导MCF-7细胞凋亡，其作用强度与TAM(1×10-6 mol/L)相当。如果IL-6和TAM联合用药，2者的作用显著增强，凋亡诱导率(42.9%和29.5%)明显高于2者单独应用时诱导率之和，表明IL-6和TAM合并用药非一般的加成作用而表现为协同(synergy)作用。这将给临床提供新的联合用药方案，其作用机制有待进一步研究。
参考文献
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1 Taiyesimi I A,Buzuar A U,Decker D A. Use of tamoxifen for breast cancer: Twenty-eight years later. J Clin Oncol,1995,13:513～529
2 Markman M,Iseminger K A,Hatch K D. Tamoxifen in platinum-refractory ovarian cancer: A gynecologic oncology group ancillary report. Gynecol Oncol,1996,62:4～6
3 Ercoli A,Scambia G,Fattorossi A. Comparative study on the induction of cytostasis and apoptosis by ICI182780 and tamoxifen in an estrogen receptor-negative ovarian cancer cell line. Int J Cancer,1998,76:47～54
, 百拇医药
4 Perry R R,Kang Y,Greaves B R. Relationship between tamoxifen-induced transforming growth factor expression,cytostasis and apoptosis in humen breast cancer cells. Br J Cancer,1995,72:1441～1446
5 Adams E F,Rafferty B,White M C. Interleukin-6 is secreted by breast possible paracrine regulation of breast 17β-oestradiol levels. Int J Cancer,1991,49:118～121
6 Speirs V,Adams E F,White M C. Interactive effects of interleukin-6,17β-estradiol and progesterone on growth and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase activity in human breast carcinoma cells. J Steroid Biochem Molec Biol,1993,46:11～15
7 David N,Danforth J,Magdalene K S. Interleukin-1a and interleukin-6 act additively to inhibit growth of MCF-7 breast cancer cells in vivtro. Cancer Res,1993,53:1538～1545
收稿日期：1999-01-11, http://www.100md.com