喜树碱固体脂质纳米粒的研究
作者：杨时成 朱家壁 梁秉文 杨昌正
单位：杨时成 杨昌正 南京大学化学化工学院，南京 210093；朱家壁 中国药科大学中昆药剂研究所，南京 210009；梁秉文 空军454医院，南京 210002
关键词：喜树碱；固体脂质纳米粒；靶向性
药学学报990216 摘要 目的：为提高喜树碱的疗效，降低毒副作用，制备了该药的固体脂质纳米粒。方法：采用热融分散技术制备了喜树碱固体脂质纳米粒，反相高效液相色谱—荧光检测法测定了体外和体内喜树碱的浓度。结果：纳米粒平均粒径为dln=196.8 nm，载药量为4.8%，包封率为99.5%，表面带有负电荷，在pH 7.4的磷酸缓冲溶液中体外释药符合Weibull方程。以喜树碱溶液为对照组，Poloxamer 188包衣的喜树碱固体脂质纳米粒静脉注射后药物在血液中的滞留时间显著延长，小鼠脑、心、肝、脾、血浆、肾和肺中的分布显著增加。结论：喜树碱固体脂质纳米粒在体内具有良好的靶向性，对提高药物的疗效，降低药物毒副作用等方面有重大意义。
, http://www.100md.com
STUDIES ON CAMPTOTHECIN SOLID LIPID NANOPARTICLES
Yang Shicheng (Yang SC),Yang Changzheng (Yang CZ)
(College of Chemistry and Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093;
Zhu Jiabi (Zhu JB)
1Zhongkun Pharmaceutical Research Institute, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009;
Liang Bingwen (Liang BW)2
, http://www.100md.com
2The 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002)
ABSTRACT AIM: To improve the treatment efficacy and reduce the side effect of camptothecin (CA), the antitumor drug was incorporated into solid lipid nanoparticles (SLN). METHODS: An innovative, injectable camptothecin preparation of solid lipid nanoparticles (CA-SLN) was prepared by hot dispersion technique. Concentrations of camptothecin in plasma and various organs were determined by reversed phase high performance liquid chromatography with fluorescence detection. RESULTS: The characteristic data showed that the mean particle size of the prepared CA-SLN was dln=196.8 nm, drug loading was 4.8%, entrapment efficiency was 99.5%, and the particles carried negative charge. In pH 7.4 phosphate buffer solution, the in vitro release characteristics were well in accord with Weibull distribution. Compared with camptothecin control solution, CA-SLN coated with Poloxamer 188 showed high concentration in brain, heart, liver, spleen, lung, kidney and plasma, leading to a prolonged plasma mean residence time (MRT). CONCLUSION: The results indicated that CA-SLN have a good targeting efficiency in vivo, and the biodegradable CA-SLN may decrease the camptothecin side effects and improve its treatment efficacy.
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KEY WORDS camptothecin; solid lipid nanoparticles; targeting
喜树碱(camptothecin,CA)是从我国喜树(Camptotheca acuminata Decne)中提出的有抗癌活性的生物碱[1]，其抗癌活性与拓扑异构酶I(topoisomerase I)的作用有关，在作用过程中喜树碱内酯环打开，酰基与拓扑异构酶中的亲核部分相互作用，使拓扑异构酶的活性受到抑制[2]。由于喜树碱的脂溶性高，制备理想制剂较困难，并且在pH 6.5以上内酯环容易打开形成喜树碱盐[3]，其药效显著降低且毒副作用大，限制了临床应用[4]。选择毒性低于合成材料、体内可以降解且有良好生理相容性的天然脂质材料作为药物载体[5～7]，制成喜树碱固体脂质纳米粒(camptothecin solid lipid nanoparticles, CA-SLN)，阻止喜树碱的水解，延缓药物的释放，并以可静脉注射的Poloxamer 188为表面活性剂使之吸附在CA-SLN的表面，增加其亲水性，并且产生“立体位阻”效应，使CA-SLN在血液循环中的滞留时间延长，阻止单核吞噬系统(MPS)的摄取，在非MPS部位的靶向性增强，达到主动靶向作用[5,6,8,9]，以期望达到提高药物疗效，降低药物毒副作用。此项研究工作在国内外未见详细报道。
, 百拇医药
实验材料
仪器设备与药品 15M-8BA高压乳匀机(英国，APV公司)；752C紫外可见分光光度计(上海分析仪器三厂)；YZ-1型电泳仪(上海分析仪器厂)；UV-265型紫外可见扫描分光光度计(日本岛津)；H-7000透射电子显微镜(日本)；SS-5中空纤维超滤器(上海瑞丽分离仪器厂)；PHS-25酸度计(上海雷磁仪器厂)；NDJ-79型旋转式粘度计(同济大学机械厂)；RC药物溶出仪(天津医疗电子仪器公司，天津医疗器厂)；SP8800高效液相色谱泵，Data Get积分仪(Spectra Physics Analytical，USA)；Waters 470荧光扫描检测器(Millipore，USA)；色谱柱：P/N:EL 022-020 RP-18 10 μm，220 mm×4.6 mm，预柱：P/N:EL 050-020 RP-18 10 μm，PROT column (Elite Test，USA)。喜树碱(浙江黄岩制药厂)；喜树碱对照品(中国药科大学药物化学教研室)；Poloxamer 188(南京金陵石化公司表面活性剂研究所，药用规格)；硬脂酸(上海化学试剂采购供应站，分析纯)；卵磷脂(上海油脂一厂，注射用)。喜树碱对照药液：PEG 400—丙二醇—水—吐温80(40∶50∶8∶2)；甲醇为HPLC级；其他药品和试剂均为药用规格或分析纯；蒸馏水用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。
, 百拇医药
实验动物 昆明种小鼠，体重18～23 g，♀♂不分(中国药科大学动物房提供)。
方法与结果
1 喜树碱固体脂质纳米粒的制备
选择微乳法[10]、乳化-沉淀法[11]和热融分散法[5]对CA-SLN的制备工艺进行了研究，结果以热融分散法较好。经过单因素考察和正交试验设计优选，确定较优制备工艺为：按处方量称取喜树碱、豆磷脂和硬脂酸，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含甘油和Poloxamer 188的水溶液，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上41.4 MPa压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成CA-SLN混悬液。在4℃密封保存，供试验用。
2 CA-SLN的形态学研究
, 百拇医药
取CA-SLN混悬液适量加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0%磷钨酸钠液进行染色，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片(图1)，可见其外观为圆整的球粒，电镜下未见粒径大于330 nm的粒子。对电镜所拍摄的粒径数据(N=503)采用SAS软件进行正态统计分析，结果粒径呈非正态分布。粒径分布见图2。3批样品的平均粒径dln=(196.8±21.3) nm。
Fig 1 Microphotograph of camptothecin solid lipid nanoparticles (CA-SLN) by transmission electron microscope (×20 000).
Fig 2 Size distribution of CA-SLN prepared by hot dispersion technique.
3 CA-SLN的载药量(DL)及包封率(EE)测定
, 百拇医药
采用反相高效液相色谱-荧光检测法对喜树碱进行测定[3,12]，流动相：甲醇—水(60∶40)，冰醋酸调至pH 5.5±0.2；流速：1.0 ml.min-1；优化激发波长λex=360 nm，发射波长λem=430 nm。在浓度1.2～96.0 ng.ml-1时峰面积与浓度之间具有良好线性关系，回归方程为A=5.1784×105C+1.9489×104，γ=0.9998。高、中、低3个浓度的绝对和相对平均回收率分别为99.8%(RSD=2.2%)和100.1%(RSD=2.0%)。将CA-SLN混悬液采用SS-5中空纤维超滤器(截留平均分子量为10 000)进行超滤，弃去初滤液20 ml，将超滤液和CA-SLN混悬液用甲醇溶解并稀释至测定浓度，进样20 μl，在高效液相色谱仪上测定喜树碱的峰面积，根据标准曲线计算喜树碱的含量。算出CA-SLN的DL和EE，3批实验结果见表1。
, 百拇医药
Tab 1 The drug loading (DL) and entrapment efficiency (EE) of CA-SLN (n=3) Sample
DL±RSD/%
EE±RSD/%
1
4.92±0.21
99.43±0.32
2
4.76±0.32
99.56±0.24
3
4.64±0.25
, 百拇医药
99.53±0.28
4 电解质对CA-SLN的表面电动电位的影响
取CA-SLN混悬液适量，加入适量不同种类及用量的电解质后，以超滤液为辅助液，采用U型管电泳法测定纳米粒的电泳速度和电泳方向，粘度计测定CA-SLN混悬液的粘度。计算CA-SLN表面电动电位，结果见图3。
Fig 3 Effect of electrolyte concentrations on Zeta potential of CA-SLN.
5 CA-SLN的体外释放动力学研究
将CA-SLN混悬液0.5 ml，置透析袋中，放入装有pH 7.4的0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液500 ml的溶出杯中，温度控制在(37±1)℃，搅拌速度为50 r.min-1。在不同时间取透析液0.5 ml加冰醋酸进行酸化，测定透析液中总的喜树碱浓度。待最后一取样点(154 h)时，将透析袋内的CA-SLN混悬液转移至10 ml量瓶中，加入冰醋酸0.5 ml，用甲醇定容。用高效液相色谱法按“CA-SLN的载药量及包封率测定”项下方法操作，测定喜树碱的含量。计算不同时间喜树碱的溶出百分率。结果见图4。在pH 7.4的0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液中，药物的体外释放符合Weibull方程：ln[-ln(1-Q)]=0.723 lnt-2.636,(γ=0.9936)，t63.2=38.25 h，t50=23.06 h。
, 百拇医药
Fig 4 In vitro release of camptothecin from CA-SLN in pH 7.4 phosphate-buffer solutio.
6 CA-SLN在小鼠体内的药代动力学及体内靶向分布
将CA-SLN混悬液和CA对照药液给禁食12 h的小鼠尾静脉注射，不同时间眼眶取血；处死后精密称取心、肝、脾、肺、肾和脑，置组织匀浆管加水研磨制成匀浆，吸取组织匀浆液0.2 ml加高氯酸10 μl和-20℃的甲醇0.8 ml，置振荡器上涡旋混合1 min后，3500 r.min-1离心10 min，取上清液20 μl供进样分析，高效液相色谱图见图5，喜树碱的保留时间为5.91 min。在1.44～36.0 ng.ml-1范围内喜树碱在血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中具有很好的线性关系，相关系数γ≥0.9990(n=5)，血浆和脏器中喜树碱测定方法的日内和日间精密度的RSD都小于5.0%，高、中、低3个剂量的绝对和相对回收率都在98.5%～104.2%之间，最低检测限为0.5 ng.ml-1。CA-SLN与CA对照液的药代动力学参数见表2，血药浓度—时间曲线见图6。CA-SLN和CA对照液在组织脏器中AUC/dose见图7。Poloxamer 188包衣的CA-SLN在心、肝、脾、肺、肾和脑中都有良好的靶向性。CA-SLN的AUC/dose与CA对照药液的AUC/dose比值F分别为：血浆(5.22)、全血(10.19)、心(10.60)、肝(8.76)、脾(7.12)、肺(2.04)、肾(2.59)和脑(10.49)，在单核吞噬细胞丰富的肝脏和脾脏中的靶向效率低于血液、心脏和脑。
, 百拇医药
Tab 2 Pharmacokinetic parameters of camptothecin in mice after intravenous administration Parameter
CA-Sol*
CA-SLN**
A/ng.ml-1
345.86
65.09
B/ng.ml-1
5.76
, 百拇医药 29.82
α/h-1
8.09
0.76
β/h-1
0.21
0.04
K21/h-1
0.34
0.27
K12/h-1
, 百拇医药
2.95
0.42
K10/h-1
5.01
0.12
T1/2α/h
0.09
0.91
T1/2β/h
3.30
17.09
MRT/h
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1.19
22.72
AUC/h.ng.ml-1
65.99
893.44
Cmax/ng.ml-1
351.62
94.91
*1.3 mg.kg-1 (n=4); **3.3 mg.kg-1 (n=6).
, 百拇医药
Fig 5 Chromatograms of blank mouse plasma (A) and plasma of mouse spiked with CA-SLN (B). 1. Camptothecin.
Fig 6 Plasma concentration—time curves of parent camptothecin after iv administration of CA-SLN (3.3mg.kg-1) and CA-Sol (camptothecin solution)(1.3mg.kg-1).
Fig 7 Tissue distribution of camptothecin after iv administration.
讨论
, 百拇医药
在CA-SLN混悬液的制备过程中，对微乳法、乳化-沉淀法和热融分散法进行了单因素考察，结果表明热融分散法比较适合CA-SLN混悬液的制备；对热融分散法进行了不同分散方法、乳匀压力、乳匀次数、表面活性剂种类、表面活性剂用量、表面活性剂的HLB值、分散相与分散介质的体积比和分散相中药物的含量等因素进行了考察；在单因素考察的基础上，选择乳匀压力、表面活性剂种类、表面活性剂用量及分散相中药物的含量为4因素，进行4因素3水平L9(34)正交试验，以粒径大小为评价指标，对CA-SLN的制备工艺进行了优选，方差分析显示乳匀压力、表面活性剂用量对粒径具有显著性影响。
在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，喜树碱从固体脂质纳米粒中的释放符合Weibull方程，t50=23.06 h；喜树碱的内酯环在pH 6.5以上的水溶液极易打开形成喜树碱盐，疗效显著降低[3,4]；在pH 7.4的磷酸盐缓冲液和人血浆中，喜树碱的内酯环的开环半衰期分别为23.8 min和10.6 min[13]。将喜树碱包封在天然脂质材料中使药物的释放速度显著降低，体外释放154 h后，透析袋内的CA-SLN混悬液中喜树碱仍以闭环形式存在，说明固体脂质纳米粒能阻止喜树碱内酯环开环，可使药物的疗效增加。
, 百拇医药
CA-SLN表面带有负电荷，zeta电位低于-25 mV。为了提高CA-SLN混悬液的稳定性，对不同种类和不同浓度的电解质进行了试验，结果发现含有三价负离子的Na3PO4和Na3C6H5O7在低浓度时能显著提高CA-SLN表面的负电荷，使混悬液的稳定性提高。
将喜树碱制成Poloxamer 188包衣的固体脂质纳米粒混悬液，静脉注射后在体内器官中有良好的靶向作用。由于Poloxamer 188的亲水性和“立体位阻”作用[5,8,9]，降低了血液中调理素(opsonin)在纳米粒表面的吸附，使单核吞噬系统对纳米粒的吞噬降低，在血液中滞留时间延长，在血液、心、脑中的靶向效率高于单核吞噬细胞丰富的肝脏和脾脏，有一定主动靶向作用，有助于对淋巴癌和脑肿瘤等疾病的治疗。CA-SLN在肾脏中的靶向效率较低，最高药物浓度低于CA对照溶液，因此，CA-SLN可以降低喜树碱对肾脏的毒副作用。
, 百拇医药
Tel:(025)3317807
参考文献
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3 Fassberg J, Stella VJ. A kinetic and mechanistic study of the hydrolysis of camptothecin and some analogs. J Pharm Sci, 1992,81∶676
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6 Mller RH, Maassen S, Schwarz C, et al. Solid lipid nanoparticles (SLN) as potential carrier for human use: interaction with human granulocytes. J Control Release, 1997,47∶261
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9 Lenaerts V, Labib A, Chouinard F, et al. Nanocapsules with a reduced liver uptake: targeting of phthalocyanines to EMT-6 mouse mammary tumour in vivo. Eur J Pharm Biopharm, 1995,41∶38
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12 Lon JP, Ahmed AE. Determination of camptothecin in biological fluids using reversed phase high performance liquid chromatography with fluorescence detection. J Chromatogr B. Biomed Appl, 1990,530∶367
13 Mi Z, Burke TG. Marked interspecies variations concerning the interactions of camptothecin with serum albumins: a frequency-domain fluorescence spectroscopic study. Biochemistry, 1994,33∶12540
收稿日期：1998-06-16, http://www.100md.com
单位：杨时成 杨昌正 南京大学化学化工学院，南京 210093；朱家壁 中国药科大学中昆药剂研究所，南京 210009；梁秉文 空军454医院，南京 210002
关键词：喜树碱；固体脂质纳米粒；靶向性
药学学报990216 摘要 目的：为提高喜树碱的疗效，降低毒副作用，制备了该药的固体脂质纳米粒。方法：采用热融分散技术制备了喜树碱固体脂质纳米粒，反相高效液相色谱—荧光检测法测定了体外和体内喜树碱的浓度。结果：纳米粒平均粒径为dln=196.8 nm，载药量为4.8%，包封率为99.5%，表面带有负电荷，在pH 7.4的磷酸缓冲溶液中体外释药符合Weibull方程。以喜树碱溶液为对照组，Poloxamer 188包衣的喜树碱固体脂质纳米粒静脉注射后药物在血液中的滞留时间显著延长，小鼠脑、心、肝、脾、血浆、肾和肺中的分布显著增加。结论：喜树碱固体脂质纳米粒在体内具有良好的靶向性，对提高药物的疗效，降低药物毒副作用等方面有重大意义。
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STUDIES ON CAMPTOTHECIN SOLID LIPID NANOPARTICLES
Yang Shicheng (Yang SC),Yang Changzheng (Yang CZ)
(College of Chemistry and Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093;
Zhu Jiabi (Zhu JB)
1Zhongkun Pharmaceutical Research Institute, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009;
Liang Bingwen (Liang BW)2
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2The 454 Hospital of PLA, Nanjing 210002)
ABSTRACT AIM: To improve the treatment efficacy and reduce the side effect of camptothecin (CA), the antitumor drug was incorporated into solid lipid nanoparticles (SLN). METHODS: An innovative, injectable camptothecin preparation of solid lipid nanoparticles (CA-SLN) was prepared by hot dispersion technique. Concentrations of camptothecin in plasma and various organs were determined by reversed phase high performance liquid chromatography with fluorescence detection. RESULTS: The characteristic data showed that the mean particle size of the prepared CA-SLN was dln=196.8 nm, drug loading was 4.8%, entrapment efficiency was 99.5%, and the particles carried negative charge. In pH 7.4 phosphate buffer solution, the in vitro release characteristics were well in accord with Weibull distribution. Compared with camptothecin control solution, CA-SLN coated with Poloxamer 188 showed high concentration in brain, heart, liver, spleen, lung, kidney and plasma, leading to a prolonged plasma mean residence time (MRT). CONCLUSION: The results indicated that CA-SLN have a good targeting efficiency in vivo, and the biodegradable CA-SLN may decrease the camptothecin side effects and improve its treatment efficacy.
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KEY WORDS camptothecin; solid lipid nanoparticles; targeting
喜树碱(camptothecin,CA)是从我国喜树(Camptotheca acuminata Decne)中提出的有抗癌活性的生物碱[1]，其抗癌活性与拓扑异构酶I(topoisomerase I)的作用有关，在作用过程中喜树碱内酯环打开，酰基与拓扑异构酶中的亲核部分相互作用，使拓扑异构酶的活性受到抑制[2]。由于喜树碱的脂溶性高，制备理想制剂较困难，并且在pH 6.5以上内酯环容易打开形成喜树碱盐[3]，其药效显著降低且毒副作用大，限制了临床应用[4]。选择毒性低于合成材料、体内可以降解且有良好生理相容性的天然脂质材料作为药物载体[5～7]，制成喜树碱固体脂质纳米粒(camptothecin solid lipid nanoparticles, CA-SLN)，阻止喜树碱的水解，延缓药物的释放，并以可静脉注射的Poloxamer 188为表面活性剂使之吸附在CA-SLN的表面，增加其亲水性，并且产生“立体位阻”效应，使CA-SLN在血液循环中的滞留时间延长，阻止单核吞噬系统(MPS)的摄取，在非MPS部位的靶向性增强，达到主动靶向作用[5,6,8,9]，以期望达到提高药物疗效，降低药物毒副作用。此项研究工作在国内外未见详细报道。
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仪器设备与药品 15M-8BA高压乳匀机(英国，APV公司)；752C紫外可见分光光度计(上海分析仪器三厂)；YZ-1型电泳仪(上海分析仪器厂)；UV-265型紫外可见扫描分光光度计(日本岛津)；H-7000透射电子显微镜(日本)；SS-5中空纤维超滤器(上海瑞丽分离仪器厂)；PHS-25酸度计(上海雷磁仪器厂)；NDJ-79型旋转式粘度计(同济大学机械厂)；RC药物溶出仪(天津医疗电子仪器公司，天津医疗器厂)；SP8800高效液相色谱泵，Data Get积分仪(Spectra Physics Analytical，USA)；Waters 470荧光扫描检测器(Millipore，USA)；色谱柱：P/N:EL 022-020 RP-18 10 μm，220 mm×4.6 mm，预柱：P/N:EL 050-020 RP-18 10 μm，PROT column (Elite Test，USA)。喜树碱(浙江黄岩制药厂)；喜树碱对照品(中国药科大学药物化学教研室)；Poloxamer 188(南京金陵石化公司表面活性剂研究所，药用规格)；硬脂酸(上海化学试剂采购供应站，分析纯)；卵磷脂(上海油脂一厂，注射用)。喜树碱对照药液：PEG 400—丙二醇—水—吐温80(40∶50∶8∶2)；甲醇为HPLC级；其他药品和试剂均为药用规格或分析纯；蒸馏水用前用0.45 μm微孔滤膜过滤。
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实验动物 昆明种小鼠，体重18～23 g，♀♂不分(中国药科大学动物房提供)。
方法与结果
1 喜树碱固体脂质纳米粒的制备
选择微乳法[10]、乳化-沉淀法[11]和热融分散法[5]对CA-SLN的制备工艺进行了研究，结果以热融分散法较好。经过单因素考察和正交试验设计优选，确定较优制备工艺为：按处方量称取喜树碱、豆磷脂和硬脂酸，在通氮气条件下加热至(80±5)℃，然后在搅拌条件下加入相同温度含甘油和Poloxamer 188的水溶液，制成粗乳；在(80±5)℃通氮气条件下在高压乳匀机上41.4 MPa压力下乳匀5次，充氮气分装后，迅速冷却形成CA-SLN混悬液。在4℃密封保存，供试验用。
2 CA-SLN的形态学研究
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取CA-SLN混悬液适量加水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2.0%磷钨酸钠液进行染色，在透射电镜下观察粒径大小和形态并拍摄照片(图1)，可见其外观为圆整的球粒，电镜下未见粒径大于330 nm的粒子。对电镜所拍摄的粒径数据(N=503)采用SAS软件进行正态统计分析，结果粒径呈非正态分布。粒径分布见图2。3批样品的平均粒径dln=(196.8±21.3) nm。
Fig 1 Microphotograph of camptothecin solid lipid nanoparticles (CA-SLN) by transmission electron microscope (×20 000).
Fig 2 Size distribution of CA-SLN prepared by hot dispersion technique.
3 CA-SLN的载药量(DL)及包封率(EE)测定
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采用反相高效液相色谱-荧光检测法对喜树碱进行测定[3,12]，流动相：甲醇—水(60∶40)，冰醋酸调至pH 5.5±0.2；流速：1.0 ml.min-1；优化激发波长λex=360 nm，发射波长λem=430 nm。在浓度1.2～96.0 ng.ml-1时峰面积与浓度之间具有良好线性关系，回归方程为A=5.1784×105C+1.9489×104，γ=0.9998。高、中、低3个浓度的绝对和相对平均回收率分别为99.8%(RSD=2.2%)和100.1%(RSD=2.0%)。将CA-SLN混悬液采用SS-5中空纤维超滤器(截留平均分子量为10 000)进行超滤，弃去初滤液20 ml，将超滤液和CA-SLN混悬液用甲醇溶解并稀释至测定浓度，进样20 μl，在高效液相色谱仪上测定喜树碱的峰面积，根据标准曲线计算喜树碱的含量。算出CA-SLN的DL和EE，3批实验结果见表1。
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Tab 1 The drug loading (DL) and entrapment efficiency (EE) of CA-SLN (n=3) Sample
DL±RSD/%
EE±RSD/%
1
4.92±0.21
99.43±0.32
2
4.76±0.32
99.56±0.24
3
4.64±0.25
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99.53±0.28
4 电解质对CA-SLN的表面电动电位的影响
取CA-SLN混悬液适量，加入适量不同种类及用量的电解质后，以超滤液为辅助液，采用U型管电泳法测定纳米粒的电泳速度和电泳方向，粘度计测定CA-SLN混悬液的粘度。计算CA-SLN表面电动电位，结果见图3。
Fig 3 Effect of electrolyte concentrations on Zeta potential of CA-SLN.
5 CA-SLN的体外释放动力学研究
将CA-SLN混悬液0.5 ml，置透析袋中，放入装有pH 7.4的0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液500 ml的溶出杯中，温度控制在(37±1)℃，搅拌速度为50 r.min-1。在不同时间取透析液0.5 ml加冰醋酸进行酸化，测定透析液中总的喜树碱浓度。待最后一取样点(154 h)时，将透析袋内的CA-SLN混悬液转移至10 ml量瓶中，加入冰醋酸0.5 ml，用甲醇定容。用高效液相色谱法按“CA-SLN的载药量及包封率测定”项下方法操作，测定喜树碱的含量。计算不同时间喜树碱的溶出百分率。结果见图4。在pH 7.4的0.1 mol.L-1磷酸盐缓冲液中，药物的体外释放符合Weibull方程：ln[-ln(1-Q)]=0.723 lnt-2.636,(γ=0.9936)，t63.2=38.25 h，t50=23.06 h。
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Fig 4 In vitro release of camptothecin from CA-SLN in pH 7.4 phosphate-buffer solutio.
6 CA-SLN在小鼠体内的药代动力学及体内靶向分布
将CA-SLN混悬液和CA对照药液给禁食12 h的小鼠尾静脉注射，不同时间眼眶取血；处死后精密称取心、肝、脾、肺、肾和脑，置组织匀浆管加水研磨制成匀浆，吸取组织匀浆液0.2 ml加高氯酸10 μl和-20℃的甲醇0.8 ml，置振荡器上涡旋混合1 min后，3500 r.min-1离心10 min，取上清液20 μl供进样分析，高效液相色谱图见图5，喜树碱的保留时间为5.91 min。在1.44～36.0 ng.ml-1范围内喜树碱在血浆、心、肝、脾、肺、肾和脑中具有很好的线性关系，相关系数γ≥0.9990(n=5)，血浆和脏器中喜树碱测定方法的日内和日间精密度的RSD都小于5.0%，高、中、低3个剂量的绝对和相对回收率都在98.5%～104.2%之间，最低检测限为0.5 ng.ml-1。CA-SLN与CA对照液的药代动力学参数见表2，血药浓度—时间曲线见图6。CA-SLN和CA对照液在组织脏器中AUC/dose见图7。Poloxamer 188包衣的CA-SLN在心、肝、脾、肺、肾和脑中都有良好的靶向性。CA-SLN的AUC/dose与CA对照药液的AUC/dose比值F分别为：血浆(5.22)、全血(10.19)、心(10.60)、肝(8.76)、脾(7.12)、肺(2.04)、肾(2.59)和脑(10.49)，在单核吞噬细胞丰富的肝脏和脾脏中的靶向效率低于血液、心脏和脑。
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Tab 2 Pharmacokinetic parameters of camptothecin in mice after intravenous administration Parameter
CA-Sol*
CA-SLN**
A/ng.ml-1
345.86
65.09
B/ng.ml-1
5.76
, 百拇医药 29.82
α/h-1
8.09
0.76
β/h-1
0.21
0.04
K21/h-1
0.34
0.27
K12/h-1
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2.95
0.42
K10/h-1
5.01
0.12
T1/2α/h
0.09
0.91
T1/2β/h
3.30
17.09
MRT/h
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1.19
22.72
AUC/h.ng.ml-1
65.99
893.44
Cmax/ng.ml-1
351.62
94.91
*1.3 mg.kg-1 (n=4); **3.3 mg.kg-1 (n=6).
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Fig 5 Chromatograms of blank mouse plasma (A) and plasma of mouse spiked with CA-SLN (B). 1. Camptothecin.
Fig 6 Plasma concentration—time curves of parent camptothecin after iv administration of CA-SLN (3.3mg.kg-1) and CA-Sol (camptothecin solution)(1.3mg.kg-1).
Fig 7 Tissue distribution of camptothecin after iv administration.
讨论
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在CA-SLN混悬液的制备过程中，对微乳法、乳化-沉淀法和热融分散法进行了单因素考察，结果表明热融分散法比较适合CA-SLN混悬液的制备；对热融分散法进行了不同分散方法、乳匀压力、乳匀次数、表面活性剂种类、表面活性剂用量、表面活性剂的HLB值、分散相与分散介质的体积比和分散相中药物的含量等因素进行了考察；在单因素考察的基础上，选择乳匀压力、表面活性剂种类、表面活性剂用量及分散相中药物的含量为4因素，进行4因素3水平L9(34)正交试验，以粒径大小为评价指标，对CA-SLN的制备工艺进行了优选，方差分析显示乳匀压力、表面活性剂用量对粒径具有显著性影响。
在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，喜树碱从固体脂质纳米粒中的释放符合Weibull方程，t50=23.06 h；喜树碱的内酯环在pH 6.5以上的水溶液极易打开形成喜树碱盐，疗效显著降低[3,4]；在pH 7.4的磷酸盐缓冲液和人血浆中，喜树碱的内酯环的开环半衰期分别为23.8 min和10.6 min[13]。将喜树碱包封在天然脂质材料中使药物的释放速度显著降低，体外释放154 h后，透析袋内的CA-SLN混悬液中喜树碱仍以闭环形式存在，说明固体脂质纳米粒能阻止喜树碱内酯环开环，可使药物的疗效增加。
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CA-SLN表面带有负电荷，zeta电位低于-25 mV。为了提高CA-SLN混悬液的稳定性，对不同种类和不同浓度的电解质进行了试验，结果发现含有三价负离子的Na3PO4和Na3C6H5O7在低浓度时能显著提高CA-SLN表面的负电荷，使混悬液的稳定性提高。
将喜树碱制成Poloxamer 188包衣的固体脂质纳米粒混悬液，静脉注射后在体内器官中有良好的靶向作用。由于Poloxamer 188的亲水性和“立体位阻”作用[5,8,9]，降低了血液中调理素(opsonin)在纳米粒表面的吸附，使单核吞噬系统对纳米粒的吞噬降低，在血液中滞留时间延长，在血液、心、脑中的靶向效率高于单核吞噬细胞丰富的肝脏和脾脏，有一定主动靶向作用，有助于对淋巴癌和脑肿瘤等疾病的治疗。CA-SLN在肾脏中的靶向效率较低，最高药物浓度低于CA对照溶液，因此，CA-SLN可以降低喜树碱对肾脏的毒副作用。
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Tel:(025)3317807
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收稿日期：1998-06-16, http://www.100md.com