叶酸的光化学行为及其应用
作者：赵慧春 张田蕾 张铁莉 冯瑞琴
单位：北京师范大学化学系，北京 100875
关键词：光化学荧光光度法；叶酸
药学学报990215 摘要 目的：研究叶酸的光化学行为并提出测定叶酸的光化学荧光分析方法。方法：叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中,经365 nm紫外光照射后，发生光化学反应，产物的荧光强度(λex 280 nm,λem 443 nm)较叶酸本身的增大了25倍。根据光化学反应产物的荧光强度测定叶酸的含量。结果：叶酸的浓度在1.0×10-5～1.0×10-7 mol.L-1范围内，荧光强度与浓度呈良好的线性关系，检出限为1.5×10-9 mol.L-1，相对标准偏差为1.6%。结论：本方法适用于片剂中叶酸的测定。
, 百拇医药
PHOTOCHEMICAL BEHAVIOUR OF FOLIC ACID AND ITS APPLICATION
Zhao Huichun(Zhao HC), Zhang Tianlei(Zhang TL), Zhang Tieli(Zhang TL) and Feng Ruiqin(Feng RQ)
(Department of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing 100875)
ABSTRACT AIM: To study the photochemical behaviour of folic acid and establish a photochemical fluorimetric method for folic acid determination. METHODS: In (CH2)6N4-HCl medium, a photochemical reaction takes place on irradiation of the folic acid with 365 nm ultravident light. The photochemical product showed an intense fluorescence intensity (λex 280 nm, λem 443 nm), which was 25 times higher than that of the original folic acid. On this basis, the determination of folic acid was carried out. RESULTS: The linear relationship between the fluorescence intensity and concentration of folic acid is over the range of 1.0×10-7～1.0×10-5 mol.L-1, the detection limit is 1.5 nmol.L-1 and relative standard deviation is 1.6%. The recoveries are in the range of (99.5～106.5)%. CONCLUSION: It can be applied to the determination of folic acid in tablets.
, 百拇医药
KEY WORDS photochemical fluorimetry; folic acid
叶酸(folic acid)亦称维生素Bc，蝶呤的衍生物，其分子由蝶啶、对氨基苯甲酸及谷氨酸组成，是抗贫血药，主要用于巨幼红细胞性贫血，也可用于恶性贫血的辅疗药物。本品在人体内参与氨基酸及核酸的合成，并能与维生素B12共同促进红细胞的生成。
用高效液相色谱法[1,2]、分光光度法[3]、吸附溶出伏安法[4]、微生物放射法[5]、荧光衍生法[6,7]测定叶酸的含量已见报道，但用光化学荧光法测定叶酸的含量至今未见报道。叶酸稀溶液的荧光较弱，直接荧光法测定灵敏度很低，但叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中经紫外光照射后，荧光强度增大了25倍，极大地提高了荧光法测定的灵敏度。此法突出的特点是简便、无需外加试剂、稳定性及重现性好、灵敏度高。
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实验部分
仪器及试剂 日立850荧光分光光度计,岛津UV-250紫外分光光度计，pHS-2型酸度计(上海第二分析仪器厂)，ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
叶酸(中国药品生物制品检定所)标准溶液(1.00 mmol.L-1)：称取纯叶酸44.14 mg加0.10 mol.L-1 NaOH溶液数滴溶解，于100 ml量瓶中定容。避光(0～4℃)冷藏保存。使用时用水逐级稀释为所需浓度。试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。
实验方法 取适量叶酸标准溶液于10 ml具塞刻度试管中，加入0.2 mol.L-1 (CH2)6N4—HCl缓冲溶液(pH 5.2) 1.0 ml，用水稀释至10 ml，摇匀。在365 nm(辐照度为30 mW.cm-2)紫外光下照射40 min后，放置10 min。在激发波长为280 nm、发射波长为443 nm、激发通带和荧光通带分别为8 nm和10 nm条件下，以试剂为参比测定其相对荧光强度。
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结果
1 吸收光谱及荧光光谱
叶酸体系的吸收光谱和荧光光谱如图1和图2所示。
由吸收光谱(图1)可见，叶酸本身在240 nm，280 nm，350 nm有3个吸收峰。当加入(CH2)6N4-HCl缓冲溶液后其240 nm的吸收峰消失，且经紫外光照射后，280 nm处吸收峰明显降低，365 nm处吸收峰略有紫移且峰强度有所升高，可见光照后体系发生了化学反应。由图2可见，体系的激发光谱和吸收光谱相似，光照与不光照体系的荧光光谱峰位基本不变，但叶酸在(CH2)6N4-HCl介质中光照后，体系的荧光强度大大提高了。叶酸浓度为1.0×10-5～1.0×10-7 mol.L-1时，光照与不光照体系的荧光强度相差25倍，说明光照后有强荧光物质生成。测定时选择激发波长为280 nm、荧光波长为443 nm，测定光照体系的荧光强度。
, 百拇医药
Fig 1 Adsorption spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0×10-5 mol.L-1. a. Folic acid, no irradiation; b. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, no irradiation; c. Folic acid, with irradiation; d. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, with irradiation.
Fig 2 Excitation and emission spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1. a,a'. Folic acid, no irradiation; b,b'. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, no irradiation; c,c'. Folic acid, with irradiation; d,d'. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, with irradiation.
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2 酸度及缓冲溶液的选择
试验了pH 2～10不同缓冲体系HCl，HAc-NaAc，(CH2)6N4-HCl，NH4Ac-NH3,NH4Ac,Na2HPO4-NaH2PO4和Na2B4O7-NaOH对叶酸荧光强度的影响。发现，只有在(CH2)6N4-HCl介质中叶酸经光照后其荧光强度才明显增大。实验选用(CH2)6N4-HCl缓冲体系来控制溶液的pH值。pH值对荧光强度的影响如图3所示。由图可见，pH 5～6时荧光强度值大且稳定。实验时选择pH 5.2的(CH2)6N4-HCl缓冲介质，确定其用量以1.0 ml为宜。
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3 光照时间的影响
将配好的溶液避光放置2 d，荧光强度变化很小。同样的溶液在日光下放置时，发现随放置时间的增长荧光强度逐渐增大。将其置于365 nm(辐照度为30 mW.cm-2)紫外灯下照射，荧光强度随时间变化的关系曲线如图4所示。由图可见，光照40 min后荧光强度趋于平稳，而且放置50 h后其荧光值基本不变，故实验时选择光照时间为40 min。
Fig 3 Effect of pH of buffer solution on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1.
Fig 4 Effect of irradiation time on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1 (irradiation intensity: 30 mW.cm-2).
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4 干扰试验
以误差5%为限，100倍的VB1和20倍的Al3+及Zn2+等常见离子对测定无干扰，Vc对叶酸的测定有严重的干扰。
5 工作曲线
叶酸浓度为1.0×10-7～1.0×10-5 mol.L-1荧光强度ΔF与浓度C(mol.L-1)呈良好的线性关系。当叶酸浓度为1.0×10-7～1.0×10-6 mol.L-1时，其线性回归方程为：
ΔF=0.0229+3.24×106C， γ=0.9998
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当叶酸浓度为1.0×10-6～1.0×10-5 mol.L-1时，其线性回归方程为:
ΔF=0.0788+3.07×106C， γ=0.9996
6 精密度及检出限
按实验方法平行测定1.0 μmol.L-1叶酸标准溶液10份的相对荧光强度，计算相对标准偏差为1.6%，说明方法的重现性良好。
按照IUPAC规定(3 s)测定11份试剂空白溶液[8]，得到此法的检出下限为1.5 nmol.L-1。
7 样品测定
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取叶酸片剂(标示量为每片含叶酸5 mg)10片，研细混匀。称取相当于一片药片的质量，加入0.10 mol.L-1 NaOH 1 ml充分搅拌，再加水稀释过滤，洗涤滤渣数次并于500 ml量瓶中定容，然后取25.00 ml定容于250 ml量瓶中，即为样品溶液。取适量的样品溶液按实验方法测定，用工作曲线法测得片剂中叶酸含量每片为5.03 mg(n=3)，相当于标示值的100.6%。标准加入法测得回收率为(99.5～106.5)%(表1)。实验结果表明，片剂中的淀粉、糊精等辅料对测定无干扰。
Tab 1 Recovery experiments (n=3) Folic acid added
/ μmol.L-1
Folic acid found
, 百拇医药
/ μmol.L-1
Recovery
/ %
0
0.23
0.20
0.44
106.5
0.40
0.64
102.5
0.60
, 百拇医药
0.83
99.5
0.80
1.03
100.0
1.00
1.23
100.0
按片剂配比，精密称取叶酸纯品及辅料适量，混匀，按上述方法操作，测得回收率为100.4%(n=3)，测定结果表明该方法准确可靠。讨论
由叶酸体系的吸收光谱和荧光光谱的变化可知，叶酸在(CH2)6N4-HCl介质中经紫外光照射后发生了光化学反应，有强荧光物质产生。为了探讨(CH2)6N4-HCl介质在光化学反应中的作用，试验了叶酸光照前和光照后加入(CH2)6N4-HCl时体系的荧光强度的变化情况。发现光照前加入(CH2)6N4-HCl的体系其荧光强度比不加(CH2)6N4-HCl的增大了25倍，而光照后再加(CH2)6N4-HCl的体系其荧光强度与不加(CH2)6N4-HCl的基本一致，说明叶酸的光化学反应只有在(CH2)6N4-HCl存在的条件下才能发生。由此可见，体系中的(CH2)6N4-HCl不仅起到了缓冲溶液的作用，而且还促进了光化学反应的进行。
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以硫酸奎宁(0.20 mol.L-1 H2SO4溶液)为标准物(Q=0.55)，测定了(CH2)6N4-HCl(pH 5.2)介质中叶酸不光照和光照后体系的相对荧光量子效率(Q)，测得值分别为0.0022和0.153。显然，光照后所得产物比叶酸具有更强的荧光。
据Wittle等报道[9]，叶酸与KMnO4反应生成强荧光产物蝶呤(C7H4N5O3)，其荧光强度比叶酸增大很多。本实验采用紫外灯作光化学反应的光源,叶酸光化学反应产物的紫外吸收光谱等实验现象与报道的很类似，因此我们推测在(CH2)6N4-HCl(pH 5.2)介质条件下，叶酸光照后生成了强荧光物质蝶呤。
, 百拇医药
Tel:(010)62207843, Fax:(010)62200567
参考文献
1 时绢,胡树静.用高效液相法测定叶酸片的含量.药物分析杂志,1985,5∶226
2 Schieffer GW, Wheeler GP, Cimino CO. Determination of folic acid in commercial diets by anion-exchange solid-phase extraction and subsequent reversed-phase HPLC. J Liq Chromatogr, 1984,7∶2659
3 Reddy MN, Viswanadham N, Sastry CSP. Spectrophotometric methods for the determination of folic acid. Indian Drugs, 1984,21∶460
, 百拇医药
4 Le Gall AC, Van den Berg CMG. Determination of folic acid in sea water using adsorptive cathodic stropping voltammetry. Anal Chim Acta, 1993,282∶459
5 Chen MF, Hill JW, Mclnyre PA. The folacin contents of foods as measured by a radiometric microbiologic method. J Nutr, 1983,113∶2192
6 Cruces BC, Segura CA, Ferna'ndez GA, et al. Fluorometric determination of folic acid based on its reaction with the fluorogenic reagent fluorescamine. Anal Lett, 1994,27∶1339
, 百拇医药
7 Cruces BC, Segura CA. Micellar-enhanced sychronous-derivative fluorescence determination of derivatized folic acid in pharmaceutical preparations. J Pharm Biomed Anal, 1995,13∶1019
8 郑用熙.分析化学中的数理统计方法.北京：科学出版社,1991.116
9 Wittle EL, O'Dell BL, Vandenbelt JM, et al. Oxidative degradation of vitamin Bc (pteroylglutamic acid). J Am Chem Soc, 1947,69∶1786
收稿日期：1998-07-08, http://www.100md.com
单位：北京师范大学化学系，北京 100875
关键词：光化学荧光光度法；叶酸
药学学报990215 摘要 目的：研究叶酸的光化学行为并提出测定叶酸的光化学荧光分析方法。方法：叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中,经365 nm紫外光照射后，发生光化学反应，产物的荧光强度(λex 280 nm,λem 443 nm)较叶酸本身的增大了25倍。根据光化学反应产物的荧光强度测定叶酸的含量。结果：叶酸的浓度在1.0×10-5～1.0×10-7 mol.L-1范围内，荧光强度与浓度呈良好的线性关系，检出限为1.5×10-9 mol.L-1，相对标准偏差为1.6%。结论：本方法适用于片剂中叶酸的测定。
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PHOTOCHEMICAL BEHAVIOUR OF FOLIC ACID AND ITS APPLICATION
Zhao Huichun(Zhao HC), Zhang Tianlei(Zhang TL), Zhang Tieli(Zhang TL) and Feng Ruiqin(Feng RQ)
(Department of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing 100875)
ABSTRACT AIM: To study the photochemical behaviour of folic acid and establish a photochemical fluorimetric method for folic acid determination. METHODS: In (CH2)6N4-HCl medium, a photochemical reaction takes place on irradiation of the folic acid with 365 nm ultravident light. The photochemical product showed an intense fluorescence intensity (λex 280 nm, λem 443 nm), which was 25 times higher than that of the original folic acid. On this basis, the determination of folic acid was carried out. RESULTS: The linear relationship between the fluorescence intensity and concentration of folic acid is over the range of 1.0×10-7～1.0×10-5 mol.L-1, the detection limit is 1.5 nmol.L-1 and relative standard deviation is 1.6%. The recoveries are in the range of (99.5～106.5)%. CONCLUSION: It can be applied to the determination of folic acid in tablets.
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KEY WORDS photochemical fluorimetry; folic acid
叶酸(folic acid)亦称维生素Bc，蝶呤的衍生物，其分子由蝶啶、对氨基苯甲酸及谷氨酸组成，是抗贫血药，主要用于巨幼红细胞性贫血，也可用于恶性贫血的辅疗药物。本品在人体内参与氨基酸及核酸的合成，并能与维生素B12共同促进红细胞的生成。
用高效液相色谱法[1,2]、分光光度法[3]、吸附溶出伏安法[4]、微生物放射法[5]、荧光衍生法[6,7]测定叶酸的含量已见报道，但用光化学荧光法测定叶酸的含量至今未见报道。叶酸稀溶液的荧光较弱，直接荧光法测定灵敏度很低，但叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中经紫外光照射后，荧光强度增大了25倍，极大地提高了荧光法测定的灵敏度。此法突出的特点是简便、无需外加试剂、稳定性及重现性好、灵敏度高。
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实验部分
仪器及试剂 日立850荧光分光光度计,岛津UV-250紫外分光光度计，pHS-2型酸度计(上海第二分析仪器厂)，ZF-I型三用紫外分析仪(上海顾村电光仪器厂)。
叶酸(中国药品生物制品检定所)标准溶液(1.00 mmol.L-1)：称取纯叶酸44.14 mg加0.10 mol.L-1 NaOH溶液数滴溶解，于100 ml量瓶中定容。避光(0～4℃)冷藏保存。使用时用水逐级稀释为所需浓度。试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。
实验方法 取适量叶酸标准溶液于10 ml具塞刻度试管中，加入0.2 mol.L-1 (CH2)6N4—HCl缓冲溶液(pH 5.2) 1.0 ml，用水稀释至10 ml，摇匀。在365 nm(辐照度为30 mW.cm-2)紫外光下照射40 min后，放置10 min。在激发波长为280 nm、发射波长为443 nm、激发通带和荧光通带分别为8 nm和10 nm条件下，以试剂为参比测定其相对荧光强度。
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结果
1 吸收光谱及荧光光谱
叶酸体系的吸收光谱和荧光光谱如图1和图2所示。
由吸收光谱(图1)可见，叶酸本身在240 nm，280 nm，350 nm有3个吸收峰。当加入(CH2)6N4-HCl缓冲溶液后其240 nm的吸收峰消失，且经紫外光照射后，280 nm处吸收峰明显降低，365 nm处吸收峰略有紫移且峰强度有所升高，可见光照后体系发生了化学反应。由图2可见，体系的激发光谱和吸收光谱相似，光照与不光照体系的荧光光谱峰位基本不变，但叶酸在(CH2)6N4-HCl介质中光照后，体系的荧光强度大大提高了。叶酸浓度为1.0×10-5～1.0×10-7 mol.L-1时，光照与不光照体系的荧光强度相差25倍，说明光照后有强荧光物质生成。测定时选择激发波长为280 nm、荧光波长为443 nm，测定光照体系的荧光强度。
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Fig 1 Adsorption spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0×10-5 mol.L-1. a. Folic acid, no irradiation; b. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, no irradiation; c. Folic acid, with irradiation; d. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, with irradiation.
Fig 2 Excitation and emission spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1. a,a'. Folic acid, no irradiation; b,b'. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, no irradiation; c,c'. Folic acid, with irradiation; d,d'. Folic acid+(CH2)6N4-HCl, with irradiation.
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2 酸度及缓冲溶液的选择
试验了pH 2～10不同缓冲体系HCl，HAc-NaAc，(CH2)6N4-HCl，NH4Ac-NH3,NH4Ac,Na2HPO4-NaH2PO4和Na2B4O7-NaOH对叶酸荧光强度的影响。发现，只有在(CH2)6N4-HCl介质中叶酸经光照后其荧光强度才明显增大。实验选用(CH2)6N4-HCl缓冲体系来控制溶液的pH值。pH值对荧光强度的影响如图3所示。由图可见，pH 5～6时荧光强度值大且稳定。实验时选择pH 5.2的(CH2)6N4-HCl缓冲介质，确定其用量以1.0 ml为宜。
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3 光照时间的影响
将配好的溶液避光放置2 d，荧光强度变化很小。同样的溶液在日光下放置时，发现随放置时间的增长荧光强度逐渐增大。将其置于365 nm(辐照度为30 mW.cm-2)紫外灯下照射，荧光强度随时间变化的关系曲线如图4所示。由图可见，光照40 min后荧光强度趋于平稳，而且放置50 h后其荧光值基本不变，故实验时选择光照时间为40 min。
Fig 3 Effect of pH of buffer solution on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1.
Fig 4 Effect of irradiation time on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol.L-1 (irradiation intensity: 30 mW.cm-2).
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4 干扰试验
以误差5%为限，100倍的VB1和20倍的Al3+及Zn2+等常见离子对测定无干扰，Vc对叶酸的测定有严重的干扰。
5 工作曲线
叶酸浓度为1.0×10-7～1.0×10-5 mol.L-1荧光强度ΔF与浓度C(mol.L-1)呈良好的线性关系。当叶酸浓度为1.0×10-7～1.0×10-6 mol.L-1时，其线性回归方程为：
ΔF=0.0229+3.24×106C， γ=0.9998
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当叶酸浓度为1.0×10-6～1.0×10-5 mol.L-1时，其线性回归方程为:
ΔF=0.0788+3.07×106C， γ=0.9996
6 精密度及检出限
按实验方法平行测定1.0 μmol.L-1叶酸标准溶液10份的相对荧光强度，计算相对标准偏差为1.6%，说明方法的重现性良好。
按照IUPAC规定(3 s)测定11份试剂空白溶液[8]，得到此法的检出下限为1.5 nmol.L-1。
7 样品测定
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取叶酸片剂(标示量为每片含叶酸5 mg)10片，研细混匀。称取相当于一片药片的质量，加入0.10 mol.L-1 NaOH 1 ml充分搅拌，再加水稀释过滤，洗涤滤渣数次并于500 ml量瓶中定容，然后取25.00 ml定容于250 ml量瓶中，即为样品溶液。取适量的样品溶液按实验方法测定，用工作曲线法测得片剂中叶酸含量每片为5.03 mg(n=3)，相当于标示值的100.6%。标准加入法测得回收率为(99.5～106.5)%(表1)。实验结果表明，片剂中的淀粉、糊精等辅料对测定无干扰。
Tab 1 Recovery experiments (n=3) Folic acid added
/ μmol.L-1
Folic acid found
, 百拇医药
/ μmol.L-1
Recovery
/ %
0
0.23
0.20
0.44
106.5
0.40
0.64
102.5
0.60
, 百拇医药
0.83
99.5
0.80
1.03
100.0
1.00
1.23
100.0
按片剂配比，精密称取叶酸纯品及辅料适量，混匀，按上述方法操作，测得回收率为100.4%(n=3)，测定结果表明该方法准确可靠。讨论
由叶酸体系的吸收光谱和荧光光谱的变化可知，叶酸在(CH2)6N4-HCl介质中经紫外光照射后发生了光化学反应，有强荧光物质产生。为了探讨(CH2)6N4-HCl介质在光化学反应中的作用，试验了叶酸光照前和光照后加入(CH2)6N4-HCl时体系的荧光强度的变化情况。发现光照前加入(CH2)6N4-HCl的体系其荧光强度比不加(CH2)6N4-HCl的增大了25倍，而光照后再加(CH2)6N4-HCl的体系其荧光强度与不加(CH2)6N4-HCl的基本一致，说明叶酸的光化学反应只有在(CH2)6N4-HCl存在的条件下才能发生。由此可见，体系中的(CH2)6N4-HCl不仅起到了缓冲溶液的作用，而且还促进了光化学反应的进行。
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以硫酸奎宁(0.20 mol.L-1 H2SO4溶液)为标准物(Q=0.55)，测定了(CH2)6N4-HCl(pH 5.2)介质中叶酸不光照和光照后体系的相对荧光量子效率(Q)，测得值分别为0.0022和0.153。显然，光照后所得产物比叶酸具有更强的荧光。
据Wittle等报道[9]，叶酸与KMnO4反应生成强荧光产物蝶呤(C7H4N5O3)，其荧光强度比叶酸增大很多。本实验采用紫外灯作光化学反应的光源,叶酸光化学反应产物的紫外吸收光谱等实验现象与报道的很类似，因此我们推测在(CH2)6N4-HCl(pH 5.2)介质条件下，叶酸光照后生成了强荧光物质蝶呤。
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参考文献
1 时绢,胡树静.用高效液相法测定叶酸片的含量.药物分析杂志,1985,5∶226
2 Schieffer GW, Wheeler GP, Cimino CO. Determination of folic acid in commercial diets by anion-exchange solid-phase extraction and subsequent reversed-phase HPLC. J Liq Chromatogr, 1984,7∶2659
3 Reddy MN, Viswanadham N, Sastry CSP. Spectrophotometric methods for the determination of folic acid. Indian Drugs, 1984,21∶460
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4 Le Gall AC, Van den Berg CMG. Determination of folic acid in sea water using adsorptive cathodic stropping voltammetry. Anal Chim Acta, 1993,282∶459
5 Chen MF, Hill JW, Mclnyre PA. The folacin contents of foods as measured by a radiometric microbiologic method. J Nutr, 1983,113∶2192
6 Cruces BC, Segura CA, Ferna'ndez GA, et al. Fluorometric determination of folic acid based on its reaction with the fluorogenic reagent fluorescamine. Anal Lett, 1994,27∶1339
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7 Cruces BC, Segura CA. Micellar-enhanced sychronous-derivative fluorescence determination of derivatized folic acid in pharmaceutical preparations. J Pharm Biomed Anal, 1995,13∶1019
8 郑用熙.分析化学中的数理统计方法.北京：科学出版社,1991.116
9 Wittle EL, O'Dell BL, Vandenbelt JM, et al. Oxidative degradation of vitamin Bc (pteroylglutamic acid). J Am Chem Soc, 1947,69∶1786
收稿日期：1998-07-08, http://www.100md.com