粉防己碱对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾通道的影响*
作者：骆红艳 唐明 吴克忠 钱悦 李守宾 别毕华 岳远坤 白润涛 胡新武
单位：骆红艳 唐明 白润涛 胡新武 同济医科大学基础医学院生理学教研室，武汉 430030；吴克忠 钱悦 李守宾 同济医科大学95级七年制临床医学班，武汉 430030；别毕华 岳远坤 同济医科大学附属同济医院内科，武汉 430030
关键词：粉防己碱；心室肌细胞；膜片钳全细胞记录；延迟整流钾电流
同济医科大学学报990207 摘要 应用膜片钳全细胞记录技术研究了粉防己碱(tetradrine,Tet)对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。结果发现：(1)Tet 10-6mol/L对心室肌细胞Ik的外向部分有显著的激活作用。(2) Tet对Ik外向部分的激活作用呈剂量依赖性。阈浓度为3×10-8 mol/L，最大有效浓度为3×10-5 mol/L。(3) Tet使心室肌细胞Ik的外向部分呈时间依赖性增加。结果提示：Tet对Ik的外向部分有激活作用，这种激活作用可能是其降低心肌收缩力、抗高血压和抗心律失常的作用机制之一。
, 百拇医药
中图法分类号 R322.1, R331.3
Effects of Tetradrine on Delayed Rectifier Potassium Channel Currents
in Isolated Ventricular Myocytes of Guinea Pig
Luo Hongyan1, Tang Ming1, Wu Kezhong2 et al
1 Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, http://www.100md.com 2 Seven-year Students of Grade 95, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The effects of tetradrine (Tet) on delayed rectifier potassium channel currents (Ik) in a single cell of ventricular myocytes in guinea pig were studied using the whole cell recording patch clamp technique. The results demonstrated that: (1) The out part of Ik was significantly activated by Tet (10-6 mol/L). (2) Tet caused a dose-dependent increase in Ik of the ventricular myocytes. The threshold concentration of Tet for Ik was 3×10-8 mol/L. And the maximum effective concentration of Tet for Ik was 3×10-5 mol/L. (3) Tet caused a time-dependent increase in Ik of the ventricular myocytes. The results suggested that Tet has an activitating effect on Ik, Which might be one of the molecular mechanisms of the actions of antihypertension, reducing contractility and antiarrhythmic.
, http://www.100md.com
Key words tetradrine; ventricular myocyte; whole cell recording; delayed rectifier potassium channel currents
粉防己碱(tetradrine,Tet)是从中药粉防己根(Stephnia tetrandra S.Moore)中提取的双苄基异喹啉类生物碱，对于心血管系统有抗高血压、降低心肌收缩力的作用[1]。并且对家兔实验性心肌缺血和再灌注损伤有保护作用[2]。有研究表明，Tet能浓度依赖性地阻滞豚鼠心室肌细胞钙电流[3]。本研究应用膜片钳全细胞记录技术观察了其对豚鼠单个心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验用成年豚鼠由同济医科大学实验动物学部提供，雌雄不拘，体重250～300 g。Tet由浙江省金华制药厂出品；胶原酶(Collagenase,Type I)、HEPES由美国Sigma公司出品；其余药品均为国产分析纯。溶液配方( mmol/L)：标准台氏液：NaCl 115，MgCl2 1.0，KCl 5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 1.0，HEPES 5，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.40后加NaHCO3 24，并通以950 ml/L的O2和50 ml/L的CO2混合气；无钙台氏液：NaCl 80，KCl 10，KH2PO4 1.0，MgSO4 5.0，葡萄糖20，牛胆素50，HEPES 5，NaHCO3 24，用NaOH调pH至7.4后加NaHCO3，并通以950 ml/L的O2和50 ml/L的CO2混合气；KB溶液：KOH 85，KCl 30，谷氨酸50，牛胆素20，KH2PO4 30，MgSO4 3，HEPES 10，葡萄糖10，EGTA 0.5，用KOH调pH至7.40，并通以纯氧；电极内液：KCl 50，天冬氨酸钾80，KH2PO4 10，MgSO4 1.0，Na2-ATP 3.0，EGTA 0.1，HEPES 5，用KOH调pH至7.40。
, http://www.100md.com
1.2 心室肌细胞的分离
依参考文献[4]的方法，简介为：以戊巴比妥钠麻醉豚鼠(30 mg/kg)， 开胸取出心脏，在恒温37 ℃条件下进行主动脉逆行性灌流。先以标准台 氏液灌流洗净冠脉循环的残血。换以无钙台氏液灌流5 min，再用含胶原酶0.4 g/L的无钙台氏液(常称酶解液)灌流10～15 min，最后用“KB溶液”[5]灌流洗去胶原酶，剪碎心室，将含组织碎块的KB溶液悬液用筛网过滤，滤液中含单个心室肌细胞。将分离好的活细胞置室温中预孵1 h后低温保存(10 ℃条件下)。实验中选用横纹清淅、状态良好的细胞。
1.3 膜片钳全细胞记录
用微电极拉制仪(Narishige牌PB-7型，日本产)将中性玻璃毛细管分两步拉制成尖端内径1～2 μm的微电极，充灌电极内液后阻抗为2～4 MΩ。将细胞悬液滴于实验浴槽中，浴槽容积0.3 ml，恒温37 ℃，待细胞下沉并贴附于浴槽底部后，以3～4 ml/min的速度进行台氏液灌流。在倒置显微镜系统(Sony，日本产)监视下，依Hamill等所使用的方法[6]，通过三维微操纵器(Narishge牌，日本产)移动电极，使尖端轻压在细胞表面，施以1.5～3.0 kPa负压吸膜，使电极尖端与细胞表面紧紧吸附，待达到10～100 GΩ的高阻抗封接后，进一步升高负压使存在于电极内的那部分膜破裂而导通，经电容电流及电极串联阻抗补偿后，形成全细胞记录。膜电流信号经Ag/AgCl电极引出，通过膜片钳放大器(L/M EPC-7，德国产)放大，由示波器照像装置(SBR-1，厦门产)和磁带记录仪(RMG-5304，日本光电公司产)进行记录。
, http://www.100md.com
1.4 统计学方法
采用配对t检验，结果以±s表示。
2 结 果
2.1 Tet对Ik的激活作用
细胞膜保持电位为-80 mV,100 ms后跃升为-40 mV以失活快钠通道和T型钙通道，而后测试电位从-80 mV至+30 mV,每次递增10 mV,持续300 ms,测试频率为0.2 Hz，脉冲结尾处的膜电流值即Ik,见图1。
图1 Tet对Ik影响的电流电压关系
A. 各电压值的电流原始记录曲线
B. Tet对Ik影响的电流-电压关系曲线
, 百拇医药
2.2 Tet作用于Ik的量效关系
保持电位由-80 mV先提高到-40 mV，使快钠通道及T型钙通道电压依赖性失活。再进一步去极化使测试电压维持在0 mV，持续300 ms，该脉冲结尾处的电流值为Ik(此时由去极化时激活了的内向钙电流已完全失活)，测试频率0.2 Hz。以不同浓度的Tet灌流时，发现Ik呈剂量依赖性增加。产生此效应的最低Tet浓度为3×10-8 mol/L，最高效应浓度为3×10-5 mol/L，50 %最大效应浓度为10-6 mol/L，见图2。
图2 Tet对Ik影响的量效关系
A.不同Tet浓度下的原始电流记录曲线
B. Tet对Ik作用的量效关系曲线(n=5, ±s)
, 百拇医药
2.3 Tet作用于Ik的时间依从性
保持电位为-80 mV，第一个去极化脉冲使钳制电位升高到-40 mV，使快钠通道及T型钙通道先激活而后处在失活状态，第二个去极化脉冲将钳制电位提高至+10 mV作为测试电压。测试电压的持续时间由550 ms逐次延长，每次增加870 ms，共5次，第5次长达4030 ms，于是在对照实验中可见Ik值(测试脉冲结尾处的电流值)随测试脉冲持续时间的延长而延长。实验结果发现，在各种时间值，Tet 10-6 mol/L均使Ik的时间依赖性激活的作用更为显著，见图3。
图3 不同测试电压持续时间时Tet对Ik的影响
A.不同测试电压持续时间条件下原始电流记录曲线
B.Tet对Ik影响的电流-时间关系曲线(n=6, ±s)
, 百拇医药
3 讨 论
本实验结果证实Tet对豚鼠心室肌细胞延迟性外向整流钾通道有明显的激活作用，其作用呈浓度依赖性和时间依赖性增强。
目前认为，心房肌和心室肌细胞膜上的Ik主要在动作电位复极3期起作用。Tet对Ik的激活作用将导致3期复极加快，平台期时程变短，在平台期内流的钙减少，使心肌细胞的收缩能力下降；另一方面使细胞膜电位发生超极化变化，从而稳定生物膜，保护线粒体功能，对心肌缺血和再灌注损伤起保护作用[2]。
Ik通道也存在于慢反应自律细胞，该通道开放直接形成慢反应电位的复极相，达最大复极电位后，在动作电位4期呈进行性衰减，故Ik也是形成自律性细胞4期除极的主要离子流。本研究结果发现Tet对Ik有激活作用，因此Tet将引起自律细胞复极速度加快，最大复极电位增大，4期除极速度降低，这都会引起自律细胞的自律性降低，心跳减慢。
, 百拇医药
综上所述，Tet能使心肌产生负性变力、负性变时作用，并具有稳定生物膜，从而减少心输出量，因而起降低动脉血压的作用；另外Tet保护缺血心肌和防止灌注损伤起的作用可能也因此所致。这些效应与Tet有抗高血压、治疗室上性心动过速[7]以及保护缺血心肌的报道是一致的。这一研究结果与已有研究所表明的Tet对豚鼠心室肌细胞ICa的阻滞作用[3]一起，在通道水平上解释了Tet降低动脉血压、降低心肌收缩力和抗心律失常作用的发生机制。
*湖北省科委资助项目(No.95JJ9-29)
作者简介：骆红艳，女，1967年生，主管技师
参考文献
1 李庆平，杨解人，饶曼人. 预先给予粉防己碱对大鼠工作心脏缺血再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1994，8(2)：114
, 百拇医药
2 任佐军，曾定尹，章新华等. 粉防己碱对家兔实验性心肌缺血及再灌注损伤的保护作用. 中国药理学与毒理学杂志，1995，9(4)：303
3 唐 明, 顾风明，唐晓青等. 粉防己碱对豚鼠心室肌细胞钙电流的影响. 同济医科大学学报，1996，25(4)：260
4 Iijima T, Irisawa H, Kameyama M. Membrane currents and their modification by acetylcholine in isolated single atrial cells of the guinea pig. J Physiol, 1985, 359:485
5 Isenberg G, Klockner U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflǔgers Arch, 1982,396:6
6 Hamill O P, Marty A, Neher E et al. Improved patch-clamp technique for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflǔgers Arch,1981,391:85
7 姚伟星，夏国瑾，郑 泉等.粉防己碱对犬缺血心肌的保护作用.药学学报，1995，30(9)：651
收稿日期：1998-06-18, 百拇医药
单位：骆红艳 唐明 白润涛 胡新武 同济医科大学基础医学院生理学教研室，武汉 430030；吴克忠 钱悦 李守宾 同济医科大学95级七年制临床医学班，武汉 430030；别毕华 岳远坤 同济医科大学附属同济医院内科，武汉 430030
关键词：粉防己碱；心室肌细胞；膜片钳全细胞记录；延迟整流钾电流
同济医科大学学报990207 摘要 应用膜片钳全细胞记录技术研究了粉防己碱(tetradrine,Tet)对豚鼠心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。结果发现：(1)Tet 10-6mol/L对心室肌细胞Ik的外向部分有显著的激活作用。(2) Tet对Ik外向部分的激活作用呈剂量依赖性。阈浓度为3×10-8 mol/L，最大有效浓度为3×10-5 mol/L。(3) Tet使心室肌细胞Ik的外向部分呈时间依赖性增加。结果提示：Tet对Ik的外向部分有激活作用，这种激活作用可能是其降低心肌收缩力、抗高血压和抗心律失常的作用机制之一。
, 百拇医药
中图法分类号 R322.1, R331.3
Effects of Tetradrine on Delayed Rectifier Potassium Channel Currents
in Isolated Ventricular Myocytes of Guinea Pig
Luo Hongyan1, Tang Ming1, Wu Kezhong2 et al
1 Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, http://www.100md.com 2 Seven-year Students of Grade 95, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract The effects of tetradrine (Tet) on delayed rectifier potassium channel currents (Ik) in a single cell of ventricular myocytes in guinea pig were studied using the whole cell recording patch clamp technique. The results demonstrated that: (1) The out part of Ik was significantly activated by Tet (10-6 mol/L). (2) Tet caused a dose-dependent increase in Ik of the ventricular myocytes. The threshold concentration of Tet for Ik was 3×10-8 mol/L. And the maximum effective concentration of Tet for Ik was 3×10-5 mol/L. (3) Tet caused a time-dependent increase in Ik of the ventricular myocytes. The results suggested that Tet has an activitating effect on Ik, Which might be one of the molecular mechanisms of the actions of antihypertension, reducing contractility and antiarrhythmic.
, http://www.100md.com
Key words tetradrine; ventricular myocyte; whole cell recording; delayed rectifier potassium channel currents
粉防己碱(tetradrine,Tet)是从中药粉防己根(Stephnia tetrandra S.Moore)中提取的双苄基异喹啉类生物碱，对于心血管系统有抗高血压、降低心肌收缩力的作用[1]。并且对家兔实验性心肌缺血和再灌注损伤有保护作用[2]。有研究表明，Tet能浓度依赖性地阻滞豚鼠心室肌细胞钙电流[3]。本研究应用膜片钳全细胞记录技术观察了其对豚鼠单个心室肌细胞延迟整流钾电流(Ik)的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, http://www.100md.com
实验用成年豚鼠由同济医科大学实验动物学部提供，雌雄不拘，体重250～300 g。Tet由浙江省金华制药厂出品；胶原酶(Collagenase,Type I)、HEPES由美国Sigma公司出品；其余药品均为国产分析纯。溶液配方( mmol/L)：标准台氏液：NaCl 115，MgCl2 1.0，KCl 5.4，CaCl2 1.8，NaH2PO4 1.0，HEPES 5，葡萄糖10，用NaOH调pH至7.40后加NaHCO3 24，并通以950 ml/L的O2和50 ml/L的CO2混合气；无钙台氏液：NaCl 80，KCl 10，KH2PO4 1.0，MgSO4 5.0，葡萄糖20，牛胆素50，HEPES 5，NaHCO3 24，用NaOH调pH至7.4后加NaHCO3，并通以950 ml/L的O2和50 ml/L的CO2混合气；KB溶液：KOH 85，KCl 30，谷氨酸50，牛胆素20，KH2PO4 30，MgSO4 3，HEPES 10，葡萄糖10，EGTA 0.5，用KOH调pH至7.40，并通以纯氧；电极内液：KCl 50，天冬氨酸钾80，KH2PO4 10，MgSO4 1.0，Na2-ATP 3.0，EGTA 0.1，HEPES 5，用KOH调pH至7.40。
, http://www.100md.com
1.2 心室肌细胞的分离
依参考文献[4]的方法，简介为：以戊巴比妥钠麻醉豚鼠(30 mg/kg)， 开胸取出心脏，在恒温37 ℃条件下进行主动脉逆行性灌流。先以标准台 氏液灌流洗净冠脉循环的残血。换以无钙台氏液灌流5 min，再用含胶原酶0.4 g/L的无钙台氏液(常称酶解液)灌流10～15 min，最后用“KB溶液”[5]灌流洗去胶原酶，剪碎心室，将含组织碎块的KB溶液悬液用筛网过滤，滤液中含单个心室肌细胞。将分离好的活细胞置室温中预孵1 h后低温保存(10 ℃条件下)。实验中选用横纹清淅、状态良好的细胞。
1.3 膜片钳全细胞记录
用微电极拉制仪(Narishige牌PB-7型，日本产)将中性玻璃毛细管分两步拉制成尖端内径1～2 μm的微电极，充灌电极内液后阻抗为2～4 MΩ。将细胞悬液滴于实验浴槽中，浴槽容积0.3 ml，恒温37 ℃，待细胞下沉并贴附于浴槽底部后，以3～4 ml/min的速度进行台氏液灌流。在倒置显微镜系统(Sony，日本产)监视下，依Hamill等所使用的方法[6]，通过三维微操纵器(Narishge牌，日本产)移动电极，使尖端轻压在细胞表面，施以1.5～3.0 kPa负压吸膜，使电极尖端与细胞表面紧紧吸附，待达到10～100 GΩ的高阻抗封接后，进一步升高负压使存在于电极内的那部分膜破裂而导通，经电容电流及电极串联阻抗补偿后，形成全细胞记录。膜电流信号经Ag/AgCl电极引出，通过膜片钳放大器(L/M EPC-7，德国产)放大，由示波器照像装置(SBR-1，厦门产)和磁带记录仪(RMG-5304，日本光电公司产)进行记录。
, http://www.100md.com
1.4 统计学方法
采用配对t检验，结果以±s表示。
2 结 果
2.1 Tet对Ik的激活作用
细胞膜保持电位为-80 mV,100 ms后跃升为-40 mV以失活快钠通道和T型钙通道，而后测试电位从-80 mV至+30 mV,每次递增10 mV,持续300 ms,测试频率为0.2 Hz，脉冲结尾处的膜电流值即Ik,见图1。
图1 Tet对Ik影响的电流电压关系
A. 各电压值的电流原始记录曲线
B. Tet对Ik影响的电流-电压关系曲线
, 百拇医药
2.2 Tet作用于Ik的量效关系
保持电位由-80 mV先提高到-40 mV，使快钠通道及T型钙通道电压依赖性失活。再进一步去极化使测试电压维持在0 mV，持续300 ms，该脉冲结尾处的电流值为Ik(此时由去极化时激活了的内向钙电流已完全失活)，测试频率0.2 Hz。以不同浓度的Tet灌流时，发现Ik呈剂量依赖性增加。产生此效应的最低Tet浓度为3×10-8 mol/L，最高效应浓度为3×10-5 mol/L，50 %最大效应浓度为10-6 mol/L，见图2。
图2 Tet对Ik影响的量效关系
A.不同Tet浓度下的原始电流记录曲线
B. Tet对Ik作用的量效关系曲线(n=5, ±s)
, 百拇医药
2.3 Tet作用于Ik的时间依从性
保持电位为-80 mV，第一个去极化脉冲使钳制电位升高到-40 mV，使快钠通道及T型钙通道先激活而后处在失活状态，第二个去极化脉冲将钳制电位提高至+10 mV作为测试电压。测试电压的持续时间由550 ms逐次延长，每次增加870 ms，共5次，第5次长达4030 ms，于是在对照实验中可见Ik值(测试脉冲结尾处的电流值)随测试脉冲持续时间的延长而延长。实验结果发现，在各种时间值，Tet 10-6 mol/L均使Ik的时间依赖性激活的作用更为显著，见图3。
图3 不同测试电压持续时间时Tet对Ik的影响
A.不同测试电压持续时间条件下原始电流记录曲线
B.Tet对Ik影响的电流-时间关系曲线(n=6, ±s)
, 百拇医药
3 讨 论
本实验结果证实Tet对豚鼠心室肌细胞延迟性外向整流钾通道有明显的激活作用，其作用呈浓度依赖性和时间依赖性增强。
目前认为，心房肌和心室肌细胞膜上的Ik主要在动作电位复极3期起作用。Tet对Ik的激活作用将导致3期复极加快，平台期时程变短，在平台期内流的钙减少，使心肌细胞的收缩能力下降；另一方面使细胞膜电位发生超极化变化，从而稳定生物膜，保护线粒体功能，对心肌缺血和再灌注损伤起保护作用[2]。
Ik通道也存在于慢反应自律细胞，该通道开放直接形成慢反应电位的复极相，达最大复极电位后，在动作电位4期呈进行性衰减，故Ik也是形成自律性细胞4期除极的主要离子流。本研究结果发现Tet对Ik有激活作用，因此Tet将引起自律细胞复极速度加快，最大复极电位增大，4期除极速度降低，这都会引起自律细胞的自律性降低，心跳减慢。
, 百拇医药
综上所述，Tet能使心肌产生负性变力、负性变时作用，并具有稳定生物膜，从而减少心输出量，因而起降低动脉血压的作用；另外Tet保护缺血心肌和防止灌注损伤起的作用可能也因此所致。这些效应与Tet有抗高血压、治疗室上性心动过速[7]以及保护缺血心肌的报道是一致的。这一研究结果与已有研究所表明的Tet对豚鼠心室肌细胞ICa的阻滞作用[3]一起，在通道水平上解释了Tet降低动脉血压、降低心肌收缩力和抗心律失常作用的发生机制。
*湖北省科委资助项目(No.95JJ9-29)
作者简介：骆红艳，女，1967年生，主管技师
参考文献
1 李庆平，杨解人，饶曼人. 预先给予粉防己碱对大鼠工作心脏缺血再灌注损伤的保护作用.中国药理学与毒理学杂志，1994，8(2)：114
, 百拇医药
2 任佐军，曾定尹，章新华等. 粉防己碱对家兔实验性心肌缺血及再灌注损伤的保护作用. 中国药理学与毒理学杂志，1995，9(4)：303
3 唐 明, 顾风明，唐晓青等. 粉防己碱对豚鼠心室肌细胞钙电流的影响. 同济医科大学学报，1996，25(4)：260
4 Iijima T, Irisawa H, Kameyama M. Membrane currents and their modification by acetylcholine in isolated single atrial cells of the guinea pig. J Physiol, 1985, 359:485
5 Isenberg G, Klockner U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a “KB medium”. Pflǔgers Arch, 1982,396:6
6 Hamill O P, Marty A, Neher E et al. Improved patch-clamp technique for high resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflǔgers Arch,1981,391:85
7 姚伟星，夏国瑾，郑 泉等.粉防己碱对犬缺血心肌的保护作用.药学学报，1995，30(9)：651
收稿日期：1998-06-18, 百拇医药