EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达与应用
作者：潘卫东 王东升 李 燕 谷淑燕
单位：潘卫东 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；李燕 谷淑燕(中国预防医学科学院病毒所免疫室 北京 100052)
关键词：EB病毒；BALF4；β-半乳糖苷酶；融合蛋白；ELISA
河南医科大学学报990223 摘要 目的：获得足够的EB病毒壳抗原，建立ELISA方法用于鼻咽癌的诊断。方法：将BALF4基因克隆进入载体pUR291,在大肠杆菌中表达EB病毒壳抗原与β-半乳糖苷酶的融合蛋白，并通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析对融合蛋白进行纯化，将纯化的蛋白用于ELISA方法检测人血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体，用带有pUR291质粒的宿主菌裂解液吸收待检血清中的抗β-半乳糖苷酶抗体。结果：ELISA方法与免疫荧光方法检测的结果呈正相关(r=0.6236，P<0.001；r=0.9225，P<0.001)。免疫荧光方法检测为阳性的血清,ELISA检测均为阳性；IgG/VCA和IgA/VCA抗体的几何平均滴度(GMT)分别是免疫荧光方法的13倍和15倍。在40份免疫荧光检测IgA/VCA阴性的血清中,ELISA检测有3例阳性,表明ELISA方法比免疫荧光方法更敏感。结论：在原核系统中表达抗原，为ELISA方法在鼻咽癌的诊断和大规模血清学普查中的应用提供了一个有效手段。
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中图分类号 R392.33
The expression of Epstein-Barr virus-associated viral capsid antigen (VCA) in E.coli and application in diagnosis
Pan Weidong1),Wang Dongsheng1), Li Yan2), Gu Shuyan2)
1)Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052 2)Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052
, 百拇医药
Abstract Aim:To obtain sufficient Epstein-Barr viral capsid antigen and apply it to the diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma based on ELISA.Methods:Using the recombinant DNA technique, a fragment of gene BALF4 was cloned into vect or plasmid pUR291 and a fusion protein consisting of β-galactosidase and the major polypeptide of Epstein-Barr viral capsid antigen(VCA) was expressed in E.coli.After determining the specificity of the fusion protein,the product was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow ion-exchange column chromatography.ELISAs were established with the purified product, using rabbit antiserum to block β-galact osidase of the fusion protein and using the supernant of the host which expresses β-galactosidase to absorb the nonspecific antibodies to β-galactosidase in human sera.Results:There was a close correlation between results of the immunofluorescence and ELISA (r=0.6236, P<0.001; r=0.9225,P<0.001).The IgG and IgA positive sera determined by immunofluorescence were also positive when determined by ELISAs, and GMT were respectively 13 times and 15 times as immunofluorescence.Three positive sera were detected by ELISA in 40 IgA negative sera determined by immunofluorescence, suggesting that ELISA is more sensitive than immunofluor escence assay.Conclusion: The Epstein-Barr viral capsid antigen expressed in prokaryotic is useful in the application of the diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma based on ELISA.
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Key words Epstein-Barr virus; BALF4; β-galactosidase; fusion protein; ELISA
国内外大量的研究证实，EB病毒IgA/VCA抗体与鼻咽癌(NPC)密切相关[1,2]，在NPC高发区人群进行IgA/VCA抗体普查对于NPC的早期发现和治疗有着重要的意义[3,4]。但目前用于EB病毒诊断的免疫荧光法费时、繁琐且难以标准化，也不便于用以大规模检测，因此人们试图以ELISA方法取代免疫荧光法用于大规模血清流行病学调查，现已获得一定进展[5～8]。但是，从自然表达抗原的类淋巴母细胞株，无法获得足够的抗原，限制了方法的实际应用。EB病毒壳抗原(VCA)是重要诊断抗原,其主要抗原多肽gp125由EB病毒基因组中BALF4基因编码[9]。作者在大肠杆菌中表达了BALF4基因的部分序列，证明了表达产物的特异性，建立了初步纯化方法，并建立ELISA方法，用于检查血清中的IgG和IgA抗体。
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1 材料与方法
1.1 菌株和质粒 宿主菌为E.coli JM103，载体pUR291和质粒pAxp1000由中国预防医学科学院病毒所免疫室提供。
1.2 酶及试剂 限制性内切酶BamHI、HindⅢ和T4DNA连接酶购自中国医学科学院基础所；DEAE-SepharoseFastFlow购自Phamacia公司；抗兔IgG酶标抗体购自Sigma公司；抗人IgG酶标抗体、抗人IgA酶标抗体购自中国军事医学科学院；抗人IgA荧光标记抗体、抗人IgG荧光标记抗体购自北京生物制品研究所。兔抗BALF4血清及兔抗β-半乳糖苷酶血清由病毒所免疫室提供。
1.3 血清标本 NPC患者血清及现场血清由病毒所免疫室提供。正常人血清购自北京市血站。
1.4 质粒DNA制备和重组质粒的构建、表达产物的Western-Blot检测 均按文献[10]进行。
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1.5 表达产物的纯化和检测 过夜培养的细菌1:100稀释后37℃振荡4h,1mmol/LIPTG诱导3h,5000r/min离心10min,STE洗3次，收集菌体。在冰浴中超声波处理20min(功率200W,工作时间30s,间隔10s)，4℃10000r/min离心30min,收集上清，经透析去盐后进行DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析。柱高10cm,横截面积1cm2，平衡缓冲液为20mmol/LTris.HCl(pH8.0)。上样量为10 mg，分别以0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L和1.0mol/LNaCl进行不连续梯度洗脱,收集各峰蛋白进行Western-Blot检测,最后以2.0mol/LNaCl溶液清洗柱。
1.6 人血清中IgG/VCA和IgA/VCA抗体检测 纯化抗原(200mg/L)包被ELISA板,每孔100μl(包被量为200ng/孔)。4℃过夜后,每孔加包被液稀释的体积分数为10%的牛血清100μl，37℃湿盒孵育2h。用洗涤液洗3次[20mmol/LTris(pH7.4),体积分数为0.05%的Tween-20]，每孔加100μl1∶100稀释的兔抗β-半乳糖苷酶血清(稀释液为pH 7.4的PBS,含体积分数为0.05%的Tween-20和体积分数为1%的牛血清)37℃湿盒孵育1h。分别与1∶100稀释的待测血清和过氧化物酶标记的抗人IgG或IgA抗体37℃湿盒孵育1h,洗涤液洗3次,OPD显色。
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2 结果
2.1 重组质粒pUR291BH1000的构建 编码EB病毒VCA主要抗原多肽gp125的基因BALF4,从ATG至终止密码全长2577bp。在质粒pAxp1000中,含有BALF4的XhoI至PstI约1000bp。用BamHI和HindⅢ双酶切下该片断后,转入pUR291载体,构成读码框架正确的重组质粒pUR291BH1000。质粒的构建及酶切鉴定结果见图1和图2。
图1 重组质粒pUR291BH1000的构建
图2 质粒pUR291BH1000的酶切鉴定
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1：λ/HindⅢ；2：pApx1000/BamHI+HindⅢ；3：pUR291/BamHI+HindⅢ；4：pUR291BH1000/BamHI+HindⅢ；5：pUR291BH1000/HindⅢ；6：pUR291BH1000/BamHI
2.2 表达产物的检测 在SDS-PAGE上有一条相对分子质量为150 000的条带，经Western-blot检测，特异性地与兔抗BALF4血清反应(图3a、b)。
图3a 质粒pUR291BH1000
表达产物的SDS-PAGE电泳结果
1：β-半乳糖苷酶；2～5：载体pUR291的不同克隆；6～10：重组质粒pUR291BH1000的不同克隆
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图3b 质粒pUR291BH1000
表达产物的Western-Blot检测结果
1～5：重组质粒pUR291BH1000的不同克隆；6～9：载体pUR291的不同克隆
2.3 表达产物的纯化 过夜培养的细菌经扩增、诱导后收集菌体，超声波处理裂解细胞，收集上清，经透析去盐，进行离子交换柱层析。经不同浓度的NaCl梯度洗脱，在0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L出现了3个洗脱峰，经Western-Blot检测，证明特异性蛋白存在于0.4 mol/L NaCl洗脱峰中(图4)。
图4 离子交换柱层析后各洗脱峰的Western-Blot结果
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1：载体水相对照；2：未过柱前样品水相对照；3：0.2mol/LNaCl洗脱峰；4：0.4mol/LNaCl洗脱峰；5：0.6mol/LNaCl洗脱峰
2.4 免疫荧光法和ELISA检测人血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体结果比较
用免疫荧光法和ELISA平行检测了100份正常献血者的血清中IgG/VCA抗体，阳性率均为100%。直线相关分析表明，免疫荧光法和ELISA测得的IgG/VCA抗体滴度呈正相关(r=0.6236，P<0.001)；ELISA和免疫荧光法测得的IgG/VCA抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶517与1∶39，前者是后者的13倍。
用免疫荧光法和ELISA平行检测了48例IgA/VCA抗体阳性血清和40例IgA/VCA阴性血清。免疫荧光法检测为IgA/VCA抗体阳性的48例血清中ELISA检测均为阳性，阳性率为100%。直线相关分析表明，免疫荧光法和ELISA测得的IgG/VCA抗体滴度呈正相关(r=0.9225，P<0.001)；ELISA和免疫荧光法测得的IgA/VCAGMT分别为1∶231与1∶15，前者是后者的15倍。免疫荧光法检侧IgA/VCA抗体阴性的40例血清中,ELISA检测有3例阳性,说明ELISA比免疫荧光法敏感。
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3 讨论
鼻咽癌(NPC)是我国南部最常见的肿瘤,国内外大量的研究证实，EB病毒IgA/VCA抗体与NPC密切相关[1，2]；在NPC患者中，IgA/VCA抗体阳性率可高达90%以上,而在其他头部肿瘤患者中则低于4%[3],并且IgA/VCA抗体滴度与病程和愈后有关[4],证明了IgA/VCA抗体在NPC的诊断中有重要意义。在我国广西NPC高发区进行的人群血清学普查,证明IgA/VCA可成功地用于早期发现鼻咽癌[3]。研究证实在Ⅰ期NPC发生前8～30个月即可检出IgA/VCA抗体[4]。由于NPC在Ⅰ期治疗,10年生存率可达到77%,因此在NPC高发区人群进行IgA/VCA抗体普查对于NPC的早期发现和治疗有着重要的意义。
目前EB病毒诊断的常规方法是免疫荧光法，费时繁琐且难以标准化，也不便于用以大规模检测，人们进行了大量研究,尝试建立ELISA方法取代免疫荧光法用于大规模血清流行病学调查，获得一定进展[5～8]。由于以往的研究都是从自然表达EB病毒相关抗原的类淋巴母细胞株获得抗原，受抗原来源及纯化方法的限制,无法获得足够的抗原用以大规模检测，因此限制了方法的实际应用。解决这一问题的一种简捷方法是运用DNA重组技术在原核细胞和真核细胞中高效表达EB病毒相关抗原[11]。
, 百拇医药
EB病毒壳抗原(VCA)是重要诊断抗原,其主要抗原多肽gp125由EB病毒基因组中BALF4基因编码[9]。作者在大肠杆菌中表达了BALF4基因的部分序列，对表达产物进行了初步纯化，并建立ELISA方法,用于检查血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体，结果显示ELISA方法与免疫荧光方法检测的结果呈正相关(P<0.001)，且更为敏感，表明重组蛋白可以有效地用于EB病毒相关抗原的检测。原核系统表达产物的高效和廉价,为ELISA方法用于NPC的诊断和血清流行病学调查及追踪提供有效的手段。
作者选择pUR291作为质粒载体,表达与β-半乳糖苷酶的融合蛋白,其特点是：①由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制,因而融合蛋白获高效表达;②外源蛋白与大肠杆菌自身的β-半乳糖苷酶的融合，蛋白更稳定;③融合蛋白要比大肠杆菌菌体蛋白大，易于鉴定和纯化，如利用β-半乳糖苷酶的亲和层析柱纯化。
通过兔抗β-半乳糖苷酶血清封闭,并以细菌裂解物吸附人血清中的抗β-半乳糖苷酶的抗体,增加了EB病毒抗体的特异性。
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参考文献
[1] Henle G,Henle W. Epstein-Barr virus-specific IgA serum antibodies as an outstanding feature of Nasopharyngeal Carcinoma. Int J Cancer,1976,17(1):1
[2] Pearson GR,Weiland LH,Neel HB,et al. Application of Epstein-Barr virus (EBV) serology to the diagnosis of north American Nasopharyngeal Carcinoma. Cancer,1983,51(2):260
[3] Zeng Y,Liu Y,Liu C,et al. Application of animmunoenzymatic method and an immunoautoradiographic method for a mass survey of Nasopharyngeal Carcinoma. Intervirology,1980,13:162
, 百拇医药
[4] Lanier AP,Henle W,Bender TR,et al. Epstein-Barr virus specific antibody titers in seven Alaskan natives before and after diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma. Int J Cancer,1980,26(2):133
[5] Luka J,Chase RC,Pearson GR. A sensitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) against the major EBV-associated antigens. I. Correlation between ELISA and immunofluorescence titers using purified antigens. J Immuno Meth,1984,67(1):145
, http://www.100md.com [6] Dōlken G,Weitzmann U,Boldt C,et al. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for IgG antibodies to Epstein-Barr virus-associated early antigens and viral capsid antigen. J Immuno Meth,1984,67(2):225
[7] Dōlken G,Weitzmann U,Boldt C,et al. Detection of IgA antibodies to Epstein-Barr virus associated antigens by ELISA. J Immuno Meth,1984,68(2):331
[8] Uen WC,Luka J,Pearson GR. Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for detecting IgA antibodies to the Epstein-Barr virus. Int J Cancer,1988,41(4):479
, 百拇医药
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[10] 金冬雁,黎孟枫.分子克隆实验指南.第2版，北京：科学出版社,1992.
[11] Hrisoho MG,Hinderer W,Schickel HN,et al. Serodiagnosis of infectious mononucleosis by using recombinant Epstein-Barr virus antigens and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay technology. J Clin Microbiol,1990,28(10):2305
(1998-07-10收稿), 百拇医药
单位：潘卫东 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州 450052)；李燕 谷淑燕(中国预防医学科学院病毒所免疫室 北京 100052)
关键词：EB病毒；BALF4；β-半乳糖苷酶；融合蛋白；ELISA
河南医科大学学报990223 摘要 目的：获得足够的EB病毒壳抗原，建立ELISA方法用于鼻咽癌的诊断。方法：将BALF4基因克隆进入载体pUR291,在大肠杆菌中表达EB病毒壳抗原与β-半乳糖苷酶的融合蛋白，并通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析对融合蛋白进行纯化，将纯化的蛋白用于ELISA方法检测人血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体，用带有pUR291质粒的宿主菌裂解液吸收待检血清中的抗β-半乳糖苷酶抗体。结果：ELISA方法与免疫荧光方法检测的结果呈正相关(r=0.6236，P<0.001；r=0.9225，P<0.001)。免疫荧光方法检测为阳性的血清,ELISA检测均为阳性；IgG/VCA和IgA/VCA抗体的几何平均滴度(GMT)分别是免疫荧光方法的13倍和15倍。在40份免疫荧光检测IgA/VCA阴性的血清中,ELISA检测有3例阳性,表明ELISA方法比免疫荧光方法更敏感。结论：在原核系统中表达抗原，为ELISA方法在鼻咽癌的诊断和大规模血清学普查中的应用提供了一个有效手段。
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中图分类号 R392.33
The expression of Epstein-Barr virus-associated viral capsid antigen (VCA) in E.coli and application in diagnosis
Pan Weidong1),Wang Dongsheng1), Li Yan2), Gu Shuyan2)
1)Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052 2)Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052
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Abstract Aim:To obtain sufficient Epstein-Barr viral capsid antigen and apply it to the diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma based on ELISA.Methods:Using the recombinant DNA technique, a fragment of gene BALF4 was cloned into vect or plasmid pUR291 and a fusion protein consisting of β-galactosidase and the major polypeptide of Epstein-Barr viral capsid antigen(VCA) was expressed in E.coli.After determining the specificity of the fusion protein,the product was purified by DEAE-Sepharose Fast Flow ion-exchange column chromatography.ELISAs were established with the purified product, using rabbit antiserum to block β-galact osidase of the fusion protein and using the supernant of the host which expresses β-galactosidase to absorb the nonspecific antibodies to β-galactosidase in human sera.Results:There was a close correlation between results of the immunofluorescence and ELISA (r=0.6236, P<0.001; r=0.9225,P<0.001).The IgG and IgA positive sera determined by immunofluorescence were also positive when determined by ELISAs, and GMT were respectively 13 times and 15 times as immunofluorescence.Three positive sera were detected by ELISA in 40 IgA negative sera determined by immunofluorescence, suggesting that ELISA is more sensitive than immunofluor escence assay.Conclusion: The Epstein-Barr viral capsid antigen expressed in prokaryotic is useful in the application of the diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma based on ELISA.
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Key words Epstein-Barr virus; BALF4; β-galactosidase; fusion protein; ELISA
国内外大量的研究证实，EB病毒IgA/VCA抗体与鼻咽癌(NPC)密切相关[1,2]，在NPC高发区人群进行IgA/VCA抗体普查对于NPC的早期发现和治疗有着重要的意义[3,4]。但目前用于EB病毒诊断的免疫荧光法费时、繁琐且难以标准化，也不便于用以大规模检测，因此人们试图以ELISA方法取代免疫荧光法用于大规模血清流行病学调查，现已获得一定进展[5～8]。但是，从自然表达抗原的类淋巴母细胞株，无法获得足够的抗原，限制了方法的实际应用。EB病毒壳抗原(VCA)是重要诊断抗原,其主要抗原多肽gp125由EB病毒基因组中BALF4基因编码[9]。作者在大肠杆菌中表达了BALF4基因的部分序列，证明了表达产物的特异性，建立了初步纯化方法，并建立ELISA方法，用于检查血清中的IgG和IgA抗体。
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1 材料与方法
1.1 菌株和质粒 宿主菌为E.coli JM103，载体pUR291和质粒pAxp1000由中国预防医学科学院病毒所免疫室提供。
1.2 酶及试剂 限制性内切酶BamHI、HindⅢ和T4DNA连接酶购自中国医学科学院基础所；DEAE-SepharoseFastFlow购自Phamacia公司；抗兔IgG酶标抗体购自Sigma公司；抗人IgG酶标抗体、抗人IgA酶标抗体购自中国军事医学科学院；抗人IgA荧光标记抗体、抗人IgG荧光标记抗体购自北京生物制品研究所。兔抗BALF4血清及兔抗β-半乳糖苷酶血清由病毒所免疫室提供。
1.3 血清标本 NPC患者血清及现场血清由病毒所免疫室提供。正常人血清购自北京市血站。
1.4 质粒DNA制备和重组质粒的构建、表达产物的Western-Blot检测 均按文献[10]进行。
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1.5 表达产物的纯化和检测 过夜培养的细菌1:100稀释后37℃振荡4h,1mmol/LIPTG诱导3h,5000r/min离心10min,STE洗3次，收集菌体。在冰浴中超声波处理20min(功率200W,工作时间30s,间隔10s)，4℃10000r/min离心30min,收集上清，经透析去盐后进行DEAE-SepharoseFF离子交换柱层析。柱高10cm,横截面积1cm2，平衡缓冲液为20mmol/LTris.HCl(pH8.0)。上样量为10 mg，分别以0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L和1.0mol/LNaCl进行不连续梯度洗脱,收集各峰蛋白进行Western-Blot检测,最后以2.0mol/LNaCl溶液清洗柱。
1.6 人血清中IgG/VCA和IgA/VCA抗体检测 纯化抗原(200mg/L)包被ELISA板,每孔100μl(包被量为200ng/孔)。4℃过夜后,每孔加包被液稀释的体积分数为10%的牛血清100μl，37℃湿盒孵育2h。用洗涤液洗3次[20mmol/LTris(pH7.4),体积分数为0.05%的Tween-20]，每孔加100μl1∶100稀释的兔抗β-半乳糖苷酶血清(稀释液为pH 7.4的PBS,含体积分数为0.05%的Tween-20和体积分数为1%的牛血清)37℃湿盒孵育1h。分别与1∶100稀释的待测血清和过氧化物酶标记的抗人IgG或IgA抗体37℃湿盒孵育1h,洗涤液洗3次,OPD显色。
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2 结果
2.1 重组质粒pUR291BH1000的构建 编码EB病毒VCA主要抗原多肽gp125的基因BALF4,从ATG至终止密码全长2577bp。在质粒pAxp1000中,含有BALF4的XhoI至PstI约1000bp。用BamHI和HindⅢ双酶切下该片断后,转入pUR291载体,构成读码框架正确的重组质粒pUR291BH1000。质粒的构建及酶切鉴定结果见图1和图2。
图1 重组质粒pUR291BH1000的构建
图2 质粒pUR291BH1000的酶切鉴定
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1：λ/HindⅢ；2：pApx1000/BamHI+HindⅢ；3：pUR291/BamHI+HindⅢ；4：pUR291BH1000/BamHI+HindⅢ；5：pUR291BH1000/HindⅢ；6：pUR291BH1000/BamHI
2.2 表达产物的检测 在SDS-PAGE上有一条相对分子质量为150 000的条带，经Western-blot检测，特异性地与兔抗BALF4血清反应(图3a、b)。
图3a 质粒pUR291BH1000
表达产物的SDS-PAGE电泳结果
1：β-半乳糖苷酶；2～5：载体pUR291的不同克隆；6～10：重组质粒pUR291BH1000的不同克隆
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图3b 质粒pUR291BH1000
表达产物的Western-Blot检测结果
1～5：重组质粒pUR291BH1000的不同克隆；6～9：载体pUR291的不同克隆
2.3 表达产物的纯化 过夜培养的细菌经扩增、诱导后收集菌体，超声波处理裂解细胞，收集上清，经透析去盐，进行离子交换柱层析。经不同浓度的NaCl梯度洗脱，在0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L出现了3个洗脱峰，经Western-Blot检测，证明特异性蛋白存在于0.4 mol/L NaCl洗脱峰中(图4)。
图4 离子交换柱层析后各洗脱峰的Western-Blot结果
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1：载体水相对照；2：未过柱前样品水相对照；3：0.2mol/LNaCl洗脱峰；4：0.4mol/LNaCl洗脱峰；5：0.6mol/LNaCl洗脱峰
2.4 免疫荧光法和ELISA检测人血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体结果比较
用免疫荧光法和ELISA平行检测了100份正常献血者的血清中IgG/VCA抗体，阳性率均为100%。直线相关分析表明，免疫荧光法和ELISA测得的IgG/VCA抗体滴度呈正相关(r=0.6236，P<0.001)；ELISA和免疫荧光法测得的IgG/VCA抗体几何平均滴度(GMT)分别为1∶517与1∶39，前者是后者的13倍。
用免疫荧光法和ELISA平行检测了48例IgA/VCA抗体阳性血清和40例IgA/VCA阴性血清。免疫荧光法检测为IgA/VCA抗体阳性的48例血清中ELISA检测均为阳性，阳性率为100%。直线相关分析表明，免疫荧光法和ELISA测得的IgG/VCA抗体滴度呈正相关(r=0.9225，P<0.001)；ELISA和免疫荧光法测得的IgA/VCAGMT分别为1∶231与1∶15，前者是后者的15倍。免疫荧光法检侧IgA/VCA抗体阴性的40例血清中,ELISA检测有3例阳性,说明ELISA比免疫荧光法敏感。
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3 讨论
鼻咽癌(NPC)是我国南部最常见的肿瘤,国内外大量的研究证实，EB病毒IgA/VCA抗体与NPC密切相关[1，2]；在NPC患者中，IgA/VCA抗体阳性率可高达90%以上,而在其他头部肿瘤患者中则低于4%[3],并且IgA/VCA抗体滴度与病程和愈后有关[4],证明了IgA/VCA抗体在NPC的诊断中有重要意义。在我国广西NPC高发区进行的人群血清学普查,证明IgA/VCA可成功地用于早期发现鼻咽癌[3]。研究证实在Ⅰ期NPC发生前8～30个月即可检出IgA/VCA抗体[4]。由于NPC在Ⅰ期治疗,10年生存率可达到77%,因此在NPC高发区人群进行IgA/VCA抗体普查对于NPC的早期发现和治疗有着重要的意义。
目前EB病毒诊断的常规方法是免疫荧光法，费时繁琐且难以标准化，也不便于用以大规模检测，人们进行了大量研究,尝试建立ELISA方法取代免疫荧光法用于大规模血清流行病学调查，获得一定进展[5～8]。由于以往的研究都是从自然表达EB病毒相关抗原的类淋巴母细胞株获得抗原，受抗原来源及纯化方法的限制,无法获得足够的抗原用以大规模检测，因此限制了方法的实际应用。解决这一问题的一种简捷方法是运用DNA重组技术在原核细胞和真核细胞中高效表达EB病毒相关抗原[11]。
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EB病毒壳抗原(VCA)是重要诊断抗原,其主要抗原多肽gp125由EB病毒基因组中BALF4基因编码[9]。作者在大肠杆菌中表达了BALF4基因的部分序列，对表达产物进行了初步纯化，并建立ELISA方法,用于检查血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体，结果显示ELISA方法与免疫荧光方法检测的结果呈正相关(P<0.001)，且更为敏感，表明重组蛋白可以有效地用于EB病毒相关抗原的检测。原核系统表达产物的高效和廉价,为ELISA方法用于NPC的诊断和血清流行病学调查及追踪提供有效的手段。
作者选择pUR291作为质粒载体,表达与β-半乳糖苷酶的融合蛋白,其特点是：①由于转录和翻译的起始由正常的大肠杆菌序列所控制,因而融合蛋白获高效表达;②外源蛋白与大肠杆菌自身的β-半乳糖苷酶的融合，蛋白更稳定;③融合蛋白要比大肠杆菌菌体蛋白大，易于鉴定和纯化，如利用β-半乳糖苷酶的亲和层析柱纯化。
通过兔抗β-半乳糖苷酶血清封闭,并以细菌裂解物吸附人血清中的抗β-半乳糖苷酶的抗体,增加了EB病毒抗体的特异性。
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(1998-07-10收稿), 百拇医药