Ras蛋白在中耳胆脂瘤上皮中的表达
作者：许昱 金康业 董卫国
单位：许昱、金康业 武汉 湖北医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科 430071；董卫国 湖北医科大学附属第一医院
关键词：胆脂瘤；中耳；RAS蛋白质类；；增生；；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志990203 【摘要】 目的 探讨Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤上皮中的表达，分析其与胆脂瘤上皮增生调节中的可能作用。方法 应用免疫组化SP染色法和计算机图像分析法, 检测22例胆脂瘤上皮和10例正常外耳道皮肤中Ras蛋白的表达情况。 结果 胆脂瘤上皮各层细胞均存在Ras蛋白的较强表达，其中15/22为胞膜着色，5/22胞膜胞浆均着色，2例仅胞浆着色，正常外耳道表皮中Ras蛋白主要表达于胞膜，以基底层显色为主；两种组织Ras蛋白阳性表达的平均积分吸光度分别为0.870和0.463 ，差异呈高度显著性。结论 中耳继发性胆脂瘤上皮中存在Ras蛋白的高表达，说明胆脂瘤上皮具有高度增生性。
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The expression of Ras protein in human middle ear cholesteatoma
XU Yu*, JIN Kangye,DONG Weiguo.*Department of Otorhinolaryngology, The Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071
【Abstract】 Objective To evaluate the possible role of Ras protein in acquired middle ear cholesteatoma.Methods The specimens from the acquired middle ear cholesteatoma tissue of 22 cases and the normal external ear skin of 10 cases were examined by immunohistochemical S-P method and computer image analysis. Results All epithelial layers of cholesteatoma revealed a relatively abundant expression of Ras protein, among which 15 cases showed an inner plasma membrane expression, 5 cases a cytoplasm and membrane expression, and 2 cases cytoplasm expression only. In contrast, the normal external ear skin revealed a sparse distribution of Ras protein in the inner plasma membrane of epithelial cells with a more intensely staining in the basal layer. The integral absorbency of Ras protein in the two types of tissues were 0.870 and 0.463 respectively with a significant difference between them. Conclusion There is an aberrant regulation of Ras protein in cholesteatoma. Ras protein plays a pivotal role during the aberrant growth and the differentiation of cholesteatoma.
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【Key words】 Cholesteatoma,middle ear Ras protein Hyperplasia Immunohistochemistry
近年来，胆脂瘤的发病机理成为耳科学家研究的热点，人们发现多种生长因子如表皮生长因子[1]、血小板源生长因子[2]、角化细胞生长因子[3]等在胆脂瘤中存在高表达，认为它们参与胆脂瘤上皮细胞增生分化的调节。在这些生长因子引起细胞增殖的信息传导通路上有一关键性调控蛋白：Ras蛋白。Ras蛋白由原癌基因Ras编码，是细胞生长分化信号传递通路上的分子开关蛋白。为了探讨Ras蛋白与胆脂瘤上皮细胞增生的关系，我们采用免疫组织化学技术和计算机图像分析法研究Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤中的表达。
材料和方法 1.材料：均取自1995～1998年22例胆脂瘤型慢性化脓性中耳炎患者，每例均取出一块较典型的胆脂瘤组织，并从中随机选取10例各取一块外耳道骨部正常皮肤组织作为对照。胆脂瘤组织男女之比为13∶9；年龄11～57岁；其中有2例为复发者，标本取自第2次手术。标本于中耳手术中取出，立即用10 %甲醛固定，常规石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，其中之一作HE染色。胆脂瘤组织标本经有经验的病理医师阅片证实原诊断无误。
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2.试剂：单克隆抗体pan-ras(Ab-3)为小鼠抗人和大鼠广谱癌基因蛋白IgG抗体(Oncogene Research公司，美国)，购自武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。
3.方法：采用免疫组化SP染色方法，步骤如下：切片脱蜡入水；滴加3 %过氧化氢溶液10 min，以阻断内源性过氧化物酶；双蒸水洗2次，磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline, PBS，pH 7.4)洗3次；置入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液，微波处理10 min，双蒸水洗2次，PBS洗3次，滴加非免疫的动物血清15 min，吸去多余液体；滴加一抗(Ras单抗)孵育2 h，PBS洗3次；加生物素标记的二抗15 min，PBS洗3次，加链霉素抗生物素-过氧化物酶(三抗)15 min，PBS洗3次；加3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(3,3-Diaminobenaidine hydrogen, DAB)显色；自来水冲洗，苏木素复染；脱水，透明，中性树胶封片。以上步骤均在常温(37℃)下进行。用已知的阳性片作阳性对照，用PBS取代一抗作阴性对照，以排除非特异性染色。
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4.结果判断：细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为Ras阳性细胞，根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)，中等阳性(棕色)，强阳性(棕褐色)。
5.计算机图像分析：采用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统(同济医科大学太阳蜻蜓公司)对染色结果进行定量分析。每张切片于100倍视野选取不相重叠的5个代表性部位，在(1.718×105)μm2测量窗下，测量上皮阳性细胞的平均积分吸光度(A)，取其均值为该标本的测量结果。
6.统计分析：采用两样本均数的t检验进行差异性检验。结果中所列数据用
±s表示。
结果 1.Ras蛋白阳性染色为棕黄色颗粒状。胆脂瘤上皮各层细胞均为阳性，着色较深，颗粒较粗，多数为胞膜着色(15/22，图1)，5例胞膜、胞浆均有着色，2例仅胞浆着色(图2)；基底层细胞与其它上皮层相比无特别强的染色；胆脂瘤上皮下组织中未见阳性反应。外耳道表皮细胞主要为胞膜染色，着色浅淡，颗粒稀疏，以基底层细胞显色为主(图3)；真皮层的一些腺上皮细胞亦呈阳性反应。阴性对照片未显色，说明无非特异性染色。
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2.经计算机图像分析，胆脂瘤上皮组织中Ras蛋白的积分吸光度为0.870±0.078，正常外耳道表皮为0.463±0.104，两者差异有高度显著性(t=7.025，P<0.001)。
图1 Ras蛋白在胆脂瘤组织上皮全层中的强阳性表达，以胞膜显色为主。免疫组化SP染色 ×132
图2 胆脂瘤上皮中Ras蛋白的胞浆表达。免疫组化SP染色 ×132
图3 Ras蛋白在正常外耳道皮肤表皮中的弱阳性表达，主要为胞膜着色，以基底层显色为主。免疫组化SP染色 ×132
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讨论 原癌基因是一类高度保守的正常细胞基因，通过编码关键性调控蛋白，在细胞信号传导的不同水平调节细胞增殖分化。在已发现的100多种癌基因中，Ras癌基因被认为是最经典的原癌基因。Ras基因家族均编码相对分子量为21 000的结构相似的蛋白质——Ras蛋白或称P21蛋白。Ras蛋白是一种鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，具内源性GTP酶活性。它有2种鸟苷酸结合形式：有活性的RasGTP和失活的RasGDP，这两种结合状态的转化使之在细胞信号传导通路上起着类似分子开关的极为重要的作用[4]。Ras信号系统以Ras蛋白为中心，接受其上游信号分子如生长因子受体等传递的生长和分化信号，通过下游效应分子的磷酸化级联反应，引起核内有关基因的表达，从而调节细胞生长和分化[5]。
由于Ras蛋白在细胞生长分化调节中的关键作用，很多肿瘤组织中均发现有Ras蛋白的过度表达。近期研究显示增高表达的Ras蛋白也存在于银屑病等增生性皮肤疾病中[6]。中耳继发性胆脂瘤的角质细胞高度增生及角质鳞屑大量脱落的特点与银屑病非常类似，Ras蛋白是否在胆脂瘤中也存在异常表达呢？1996年，Huang等[7]采用免疫组化方法对15例中耳继发性胆脂瘤、3例中耳原发性胆脂瘤及3例正常外耳道组织中Ras蛋白的表达进行了研究，结果为原发性和继发性胆脂瘤的上皮各层角质细胞出现Ras蛋白的明显表达，基底层细胞着色较深；而外耳道组织则无明显着色。本组中应用SP染色法检测了中耳继发性胆脂瘤和正常皮肤组织中的Ras蛋白的表达情况，结果与Huang等基本一致。同时运用计算机图像分析系统对染色结果进行定量分析，结果显示胆脂瘤上皮中Ras蛋白含量显著高于正常外耳道皮肤，证实胆脂瘤上皮具有高度增殖性。
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Ras蛋白的前体在胞浆游离的核糖体上合成，其半衰期至少24 h[8]，经过翻译后修饰，Ras蛋白共价结合于胞浆膜内侧面，只有定位于胞浆膜内侧面的Ras蛋白才具有活性。在我们的染色结果中，胆脂瘤上皮可见到胞膜和胞浆2种着色方式，说明Ras蛋白的合成增加，也说明我们所用的抗体可与前体的和成熟的2种Ras蛋白结合。
Ras基因激活的机理较复杂，可由多种因素引起，如基因突变、基因扩增或转录增强等，由于胆脂瘤非真性肿瘤，Ras蛋白的增加应该不是由于Ras基因突变所致。而据报道，生长因子可通过相应受体激活Ras基因，使Ras蛋白大量表达[9]。研究表明，在炎症等因素的刺激下，多种生长因子在胆脂瘤中表达增高，胆脂瘤中Ras蛋白的增高表达可能与生长因子有密切关系，这方面的研究有待进一步深入。
目前科学家们已提出用细胞生长信号传导阻滞剂来治疗肿瘤及其它疾病[10]，Ras蛋白阻滞剂已在体外和体内实验中获得成功，这也为胆脂瘤的药物治疗提出启示。
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参考文献
1 Bujia.J, Holly A, Schilling V, et al. Aberrant expression of epidermal growth factor receptor in aural cholesteatoma. Laryngoscope, 1993,103:326-329.
2 Fujioka O, Huang CC. Platelet-derived growth factor in middle ear cholesteatoma. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1994, 251:199-204.
3 Kojima H, Matsuhisa A, Shiwa M, et al. Expression of messenger RNA for keratinocyte growth factor in human cholesteatoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1996,122:157-160
, 百拇医药
4 Egan SE, Giddings BW, Brooks MW, et al. Association of Sos Ras exchange protein with Grb2 is implicated in tyrosine kinase signal transduction and transformation. Nature, 1993,363:45-51.
5 McCormick F.Signal transduction. How receptors turn Ras on. Nature, 1993,363:15-16.
6 Kikuchi A, Amagai M, Nishikawa T. Association of ras p21 with differentiation of epidermal keratinocytes in proliferating skin diseases. J Dermatol Sci, 1992, 4:83-86.
, 百拇医药
7 Huang CC, Chen CT, Huang TS, et al. Mediation of signal transduction in keratinocytes of human middle ear cholesteatoma by ras protein. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1996,253:385-389.
8 Ulsh LS, Shih TY. Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJ bladder carcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol, 1984,4:1647-1652.
9 曹文庆,王椿森,张德美.c-Ha-ras原癌基因与银屑病.中华皮肤科杂志,1996,29:85-87.
10 Levitzki A. Signal-transduction therapy. A novel approach to disease management. Eur J Biochem,1994,226:1-13.
(收稿：1998-10-13 修回：1999-01-04), 百拇医药
单位：许昱、金康业 武汉 湖北医科大学附属第二医院耳鼻咽喉科 430071；董卫国 湖北医科大学附属第一医院
关键词：胆脂瘤；中耳；RAS蛋白质类；；增生；；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志990203 【摘要】 目的 探讨Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤上皮中的表达，分析其与胆脂瘤上皮增生调节中的可能作用。方法 应用免疫组化SP染色法和计算机图像分析法, 检测22例胆脂瘤上皮和10例正常外耳道皮肤中Ras蛋白的表达情况。 结果 胆脂瘤上皮各层细胞均存在Ras蛋白的较强表达，其中15/22为胞膜着色，5/22胞膜胞浆均着色，2例仅胞浆着色，正常外耳道表皮中Ras蛋白主要表达于胞膜，以基底层显色为主；两种组织Ras蛋白阳性表达的平均积分吸光度分别为0.870和0.463 ，差异呈高度显著性。结论 中耳继发性胆脂瘤上皮中存在Ras蛋白的高表达，说明胆脂瘤上皮具有高度增生性。
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The expression of Ras protein in human middle ear cholesteatoma
XU Yu*, JIN Kangye,DONG Weiguo.*Department of Otorhinolaryngology, The Second Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071
【Abstract】 Objective To evaluate the possible role of Ras protein in acquired middle ear cholesteatoma.Methods The specimens from the acquired middle ear cholesteatoma tissue of 22 cases and the normal external ear skin of 10 cases were examined by immunohistochemical S-P method and computer image analysis. Results All epithelial layers of cholesteatoma revealed a relatively abundant expression of Ras protein, among which 15 cases showed an inner plasma membrane expression, 5 cases a cytoplasm and membrane expression, and 2 cases cytoplasm expression only. In contrast, the normal external ear skin revealed a sparse distribution of Ras protein in the inner plasma membrane of epithelial cells with a more intensely staining in the basal layer. The integral absorbency of Ras protein in the two types of tissues were 0.870 and 0.463 respectively with a significant difference between them. Conclusion There is an aberrant regulation of Ras protein in cholesteatoma. Ras protein plays a pivotal role during the aberrant growth and the differentiation of cholesteatoma.
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【Key words】 Cholesteatoma,middle ear Ras protein Hyperplasia Immunohistochemistry
近年来，胆脂瘤的发病机理成为耳科学家研究的热点，人们发现多种生长因子如表皮生长因子[1]、血小板源生长因子[2]、角化细胞生长因子[3]等在胆脂瘤中存在高表达，认为它们参与胆脂瘤上皮细胞增生分化的调节。在这些生长因子引起细胞增殖的信息传导通路上有一关键性调控蛋白：Ras蛋白。Ras蛋白由原癌基因Ras编码，是细胞生长分化信号传递通路上的分子开关蛋白。为了探讨Ras蛋白与胆脂瘤上皮细胞增生的关系，我们采用免疫组织化学技术和计算机图像分析法研究Ras蛋白在中耳继发性胆脂瘤中的表达。
材料和方法 1.材料：均取自1995～1998年22例胆脂瘤型慢性化脓性中耳炎患者，每例均取出一块较典型的胆脂瘤组织，并从中随机选取10例各取一块外耳道骨部正常皮肤组织作为对照。胆脂瘤组织男女之比为13∶9；年龄11～57岁；其中有2例为复发者，标本取自第2次手术。标本于中耳手术中取出，立即用10 %甲醛固定，常规石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，其中之一作HE染色。胆脂瘤组织标本经有经验的病理医师阅片证实原诊断无误。
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2.试剂：单克隆抗体pan-ras(Ab-3)为小鼠抗人和大鼠广谱癌基因蛋白IgG抗体(Oncogene Research公司，美国)，购自武汉博士德生物工程有限公司。SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。
3.方法：采用免疫组化SP染色方法，步骤如下：切片脱蜡入水；滴加3 %过氧化氢溶液10 min，以阻断内源性过氧化物酶；双蒸水洗2次，磷酸缓冲盐溶液(phosphate-buffered saline, PBS，pH 7.4)洗3次；置入0.01 mol/L柠檬酸缓冲液，微波处理10 min，双蒸水洗2次，PBS洗3次，滴加非免疫的动物血清15 min，吸去多余液体；滴加一抗(Ras单抗)孵育2 h，PBS洗3次；加生物素标记的二抗15 min，PBS洗3次，加链霉素抗生物素-过氧化物酶(三抗)15 min，PBS洗3次；加3,3-二氨基联苯胺盐酸盐(3,3-Diaminobenaidine hydrogen, DAB)显色；自来水冲洗，苏木素复染；脱水，透明，中性树胶封片。以上步骤均在常温(37℃)下进行。用已知的阳性片作阳性对照，用PBS取代一抗作阴性对照，以排除非特异性染色。
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4.结果判断：细胞膜或细胞浆出现棕黄色颗粒为Ras阳性细胞，根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)，中等阳性(棕色)，强阳性(棕褐色)。
5.计算机图像分析：采用MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统(同济医科大学太阳蜻蜓公司)对染色结果进行定量分析。每张切片于100倍视野选取不相重叠的5个代表性部位，在(1.718×105)μm2测量窗下，测量上皮阳性细胞的平均积分吸光度(A)，取其均值为该标本的测量结果。
6.统计分析：采用两样本均数的t检验进行差异性检验。结果中所列数据用
±s表示。结果 1.Ras蛋白阳性染色为棕黄色颗粒状。胆脂瘤上皮各层细胞均为阳性，着色较深，颗粒较粗，多数为胞膜着色(15/22，图1)，5例胞膜、胞浆均有着色，2例仅胞浆着色(图2)；基底层细胞与其它上皮层相比无特别强的染色；胆脂瘤上皮下组织中未见阳性反应。外耳道表皮细胞主要为胞膜染色，着色浅淡，颗粒稀疏，以基底层细胞显色为主(图3)；真皮层的一些腺上皮细胞亦呈阳性反应。阴性对照片未显色，说明无非特异性染色。
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2.经计算机图像分析，胆脂瘤上皮组织中Ras蛋白的积分吸光度为0.870±0.078，正常外耳道表皮为0.463±0.104，两者差异有高度显著性(t=7.025，P<0.001)。
图1 Ras蛋白在胆脂瘤组织上皮全层中的强阳性表达，以胞膜显色为主。免疫组化SP染色 ×132
图2 胆脂瘤上皮中Ras蛋白的胞浆表达。免疫组化SP染色 ×132
图3 Ras蛋白在正常外耳道皮肤表皮中的弱阳性表达，主要为胞膜着色，以基底层显色为主。免疫组化SP染色 ×132
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讨论 原癌基因是一类高度保守的正常细胞基因，通过编码关键性调控蛋白，在细胞信号传导的不同水平调节细胞增殖分化。在已发现的100多种癌基因中，Ras癌基因被认为是最经典的原癌基因。Ras基因家族均编码相对分子量为21 000的结构相似的蛋白质——Ras蛋白或称P21蛋白。Ras蛋白是一种鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，具内源性GTP酶活性。它有2种鸟苷酸结合形式：有活性的RasGTP和失活的RasGDP，这两种结合状态的转化使之在细胞信号传导通路上起着类似分子开关的极为重要的作用[4]。Ras信号系统以Ras蛋白为中心，接受其上游信号分子如生长因子受体等传递的生长和分化信号，通过下游效应分子的磷酸化级联反应，引起核内有关基因的表达，从而调节细胞生长和分化[5]。
由于Ras蛋白在细胞生长分化调节中的关键作用，很多肿瘤组织中均发现有Ras蛋白的过度表达。近期研究显示增高表达的Ras蛋白也存在于银屑病等增生性皮肤疾病中[6]。中耳继发性胆脂瘤的角质细胞高度增生及角质鳞屑大量脱落的特点与银屑病非常类似，Ras蛋白是否在胆脂瘤中也存在异常表达呢？1996年，Huang等[7]采用免疫组化方法对15例中耳继发性胆脂瘤、3例中耳原发性胆脂瘤及3例正常外耳道组织中Ras蛋白的表达进行了研究，结果为原发性和继发性胆脂瘤的上皮各层角质细胞出现Ras蛋白的明显表达，基底层细胞着色较深；而外耳道组织则无明显着色。本组中应用SP染色法检测了中耳继发性胆脂瘤和正常皮肤组织中的Ras蛋白的表达情况，结果与Huang等基本一致。同时运用计算机图像分析系统对染色结果进行定量分析，结果显示胆脂瘤上皮中Ras蛋白含量显著高于正常外耳道皮肤，证实胆脂瘤上皮具有高度增殖性。
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Ras蛋白的前体在胞浆游离的核糖体上合成，其半衰期至少24 h[8]，经过翻译后修饰，Ras蛋白共价结合于胞浆膜内侧面，只有定位于胞浆膜内侧面的Ras蛋白才具有活性。在我们的染色结果中，胆脂瘤上皮可见到胞膜和胞浆2种着色方式，说明Ras蛋白的合成增加，也说明我们所用的抗体可与前体的和成熟的2种Ras蛋白结合。
Ras基因激活的机理较复杂，可由多种因素引起，如基因突变、基因扩增或转录增强等，由于胆脂瘤非真性肿瘤，Ras蛋白的增加应该不是由于Ras基因突变所致。而据报道，生长因子可通过相应受体激活Ras基因，使Ras蛋白大量表达[9]。研究表明，在炎症等因素的刺激下，多种生长因子在胆脂瘤中表达增高，胆脂瘤中Ras蛋白的增高表达可能与生长因子有密切关系，这方面的研究有待进一步深入。
目前科学家们已提出用细胞生长信号传导阻滞剂来治疗肿瘤及其它疾病[10]，Ras蛋白阻滞剂已在体外和体内实验中获得成功，这也为胆脂瘤的药物治疗提出启示。
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参考文献
1 Bujia.J, Holly A, Schilling V, et al. Aberrant expression of epidermal growth factor receptor in aural cholesteatoma. Laryngoscope, 1993,103:326-329.
2 Fujioka O, Huang CC. Platelet-derived growth factor in middle ear cholesteatoma. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1994, 251:199-204.
3 Kojima H, Matsuhisa A, Shiwa M, et al. Expression of messenger RNA for keratinocyte growth factor in human cholesteatoma. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1996,122:157-160
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4 Egan SE, Giddings BW, Brooks MW, et al. Association of Sos Ras exchange protein with Grb2 is implicated in tyrosine kinase signal transduction and transformation. Nature, 1993,363:45-51.
5 McCormick F.Signal transduction. How receptors turn Ras on. Nature, 1993,363:15-16.
6 Kikuchi A, Amagai M, Nishikawa T. Association of ras p21 with differentiation of epidermal keratinocytes in proliferating skin diseases. J Dermatol Sci, 1992, 4:83-86.
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7 Huang CC, Chen CT, Huang TS, et al. Mediation of signal transduction in keratinocytes of human middle ear cholesteatoma by ras protein. Eur Arch Otorhinolaryngol, 1996,253:385-389.
8 Ulsh LS, Shih TY. Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJ bladder carcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol, 1984,4:1647-1652.
9 曹文庆,王椿森,张德美.c-Ha-ras原癌基因与银屑病.中华皮肤科杂志,1996,29:85-87.
10 Levitzki A. Signal-transduction therapy. A novel approach to disease management. Eur J Biochem,1994,226:1-13.
(收稿：1998-10-13 修回：1999-01-04), 百拇医药