显微刮片样本检测VHL肿瘤抑制基因突变
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肾脏病与透析肾移植杂志 1999年第2期第8卷 实验室方法
作者：叶朝阳 Droz D B'eroud C Junien C
单位：叶朝阳 第二军医大学长征医院肾内科(上海，200003)；Droz D B'eroud C Junien C Laboratoire de Pathologie，Departement de Nephrologie，Hpital Necker，Paris 75015 France
关键词：纤维刮片；VHL基因；肾肿瘤
Von Hippel
Von Hippel-Lindau(VHL)病也称Lindau综合征，是一种常染色体显性遗传病，表现为家族性多发性良、恶性肿瘤和囊肿，发病率1/600000～300000，至60岁外显率为97%，主要临床表现为视网膜血管母细胞瘤(50%～60%)，脑血管母细胞瘤(60%～80%)、胰腺囊肿(30%～65%)、肾细胞癌和(或)多发性肾囊肿(30%～60%)，以及肾上腺嗜铬细胞瘤(11%～19%)等[1]。肾细胞癌是最常见的致死原因，患者平均生存期为49岁，系统检查可早期发现肿瘤并可减少患者的肿瘤病死率。现已证明VHL基因是一种肿瘤抑制基因，自1993年Latif等[2]已证实VHL基因定位于3p25-26区，VHL基因的序列分析和鉴定提供了从分子水平诊断该疾病的办法。至今国内文献仅见个案报道。
, 百拇医药
新鲜标本或冰冻组织抽提DNA已被广泛应用；福尔马林固定和石蜡包埋的标本抽提DNA也有报道，但PCR扩增常不成功，本文报道我们采用显微刮片样本检测VHL肿瘤抑制基因突变的结果。
1 材料和方法
1.1 组织处理 4例VHL患者均符合临床诊断标准并经病理组织学确诊。福尔马林固定，石蜡包埋的组织块选自巴黎Necker医院肾脏科病理实验室。这些标本是1995～1996年间VHL患者肾癌肾切除组织，组织用中性福尔马林固定，石蜡切片厚度为10μm，每份样本切取5～15张切片，切片按常规方法脱蜡，然后用伊红快速染色，自来水冲洗，室温干燥。
显微刮片技术：在显微镜下应用改良巴斯得小试管尖直接刮片。每张切片分三个部分刮取细胞，即囊肿上皮细胞，正常肾细胞和癌细胞，每类细胞至少刮取50～100个，刮下的细胞用Picolyte粘胶粘取，放入细胞溶解液中。
, 百拇医药
1.2 DNA提取 每个小试管(PCR仪专用试管)含20μl细胞溶解液，细胞溶解液含Tris/HCl10mmol/L，pH7.6，EDTA10mmol/L，NaCl50mmol/L，SDS0.6%，以及蛋白酶-K0.1g/L。含细胞的溶解液放入37℃孵箱摇床消化过夜。次日消化液100℃灭活蛋白酶10min。此细胞消化液用Wizard TM PCR专用的DNA纯化试剂盒，纯化DNA(按说明书操作)。最后溶液体积40 μl。取10μl测定DNA含量。
1.3 PCR扩增 VHL基因三个外显子均有cDNA克隆片段，第一个外显子有4对cDNA克隆片段，见表1；本组使用7对引物，用以扩增VHL基因片段[3]。PCR扩增条件见表2。反应体系是：2.5 μl10×dNTP(200mmol/L)缓冲液，0～0.75μl DMSO，1.5μl MgCl2(1.5mmol/L)，0.5UTaq DNA聚合酶。3′-端和5′-端引物各1μl，反应总体积25μl。扩增后取产物5μl，加4 μl溴酚兰，0.8%～1.0%琼脂凝胶电泳，若PCR扩增成功，琼脂凝胶电泳显带，继而做单链构象多态性分析(SSCP)。
, 百拇医药
1.4 SSCP分析 取扩增成功的PCR产物5μl(约50ng)，加20mmol/L的dTTP，dGTP和dCTP，0.2mmol/L α-33P标记的dATP，反应体系，成分和总体积与首次相同。制备变性聚丙烯酰胺电泳胶。加样：4μl PCR产物+4μl测序兰[95%(v/v)缓冲甲酰胺，10mmol/L EDTA，pH8.0，0.1%(w/v)溴酚兰和0.1%(w/v)氰二甲苯]，95℃变性10min，置入冰中冷却10min，然后加样电泳过夜。电泳功率8～10W，12～16 h(因外显子不同而异)，次日将凝胶转移到3M Wattman纸，真空烘干，放射自显影，观察有无突变电泳带。
1.5 DNA序列测定 将SSCP干胶上的变异电泳带切下，放入Eppendorf管内，加50μl双蒸水，95℃加热10 min，将胶中DNA溶解，取5μl按第一步PCR方法扩增，并纯化，用荧光标记引物，7-delta-dGTP测序试剂盒(按说明书操作)及激光扫描自动化测序仪(Pharmacia LKB.A.L.DNA Sequencer)进行序列分析。
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表1 引物核苷酸序列
引物名称
碱基数
序列(5’-3’)
VHL 3F
27
5’-CTG AGA CCC TAG TCT GCC ACT GAG GAT-3’
3R
27
5’-CAA AAG CTG AGA TGA AAC AGT GTA AGT-3’
VHL 2F
, 百拇医药
27
5’-CTT TAA CAA CCT TTG CTT GTC CCG ATA-3’
2R
27
5’-GTC TAT CCT GTA CTT ACC ACA ACA CCT-3’
VHL 1-4F
27
5’-CAT CTT CTG CAA TCG CAG TCC GCG CGT-3’
VHL 1-4R
27
, 百拇医药
5’-TGG GTC GGG CCT AAG CGC CGG GCC CGT-3’
VHL 1-3F
27
5’-GAG GCA GGC GTC GAA GAG TAC GGC CCT-3’
1-3R
27
5’-GAC TGC GAT TGC AGA AGA TGA CCT GGG-3’
VHL 1-2F
27
5’-GCG GCG TCC GGC CCG GGT GGT CTG GAT-3’
, 百拇医药
1-2R
27
5’-CCT CGG CGC CCG ACT CCT CCC CGC CGT-3’
VHL 1-1F
27
5’-AGT GGA AAT ACA GTA ACG AGT TGG CCT-3’
1-1R
27
5’-GTC CCA GTT CTC CGC CCT CCG GGG CAT-3’
VHL pre1F
, 百拇医药
27
5’-GTC AAG GCT GCA GTG AGC CAA GCT CGC-3’
pre1R
28
5’-TTC GCG CGC GCT CGG TAG AGG ATG GAA A-3’
表2 PCR循环周期温度和时间
引物名称
变性温度及时间
(min)
扩增温度
及时间
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(s)
复性延伸
及时间
(min)
exon-3，1-1，pre1-1
94℃，5
94℃，15；68℃，30
72℃.5
exon-2
94℃，5
94℃，15；65℃，15；
72℃，30
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72℃.5
exon 1-2，1-3，1-4
94℃，5
94℃，15；70℃，30
72℃.5
2 结 果
2.1 细胞获取情况 囊上皮细胞至少50个，肾小管上皮细胞和肾癌细胞各500～1000个。
2.2 DNA提取情况 福尔马林固定石蜡包埋切片标本抽取的DNA浓度为25～167kg/L，浓度高低与刮取细胞数多少有关，DNA与蛋白质比值为1.1～1.5。
2.3 PCR成功率 一般情况，采用5μl标本(含50μg DNA)用于PCR扩增，少数情况加样5μl含DNA 100μg，PCR扩增成功率约50%。在55次PCR中，有13次所有标本均失败，其余42次PCR，14次扩增满意，28次部分样本扩增成功。
, 百拇医药
2.4 PCR-SSCP突变 4例样本均用VHL基因和3个外显子，7对引物扩增，其中3例PCR-SSCP未发现突变，仅1例(643号家庭)发现有突变，突变部位在外显子1-3。
本例突变与其新鲜血标本和冰冻组织(肿瘤块和肾组织块)标本提取的DNA具有相同的突变部位。
2.5 突变序列测定 经序列分析，突变点位于69号密码子，该密码子插入一碱基G，即由原来的GCG变为GGC(见附图)。
附图 正常序列图与突变序列图对比
3 讨 论
目前，人们已清楚认识了VHL病是一种常染色体显性遗传性疾病，近几年，VHL基因已有较广泛研究，VHL基因外显子及内含子的碱基突变已有不少报道[4]，癌症形成的“两步论”提示：在遗传性癌症性综合征诸如VHL病等疾病的基因型有两个等位基因，一个是遗传性种系突变，另一个是野生型功能缺失，它由染色体缺失(即杂合性缺失，LOH)或点突变造成，因而，在VHL患者肾脏组织细胞中应可检出VHL基因的LOH或突变。
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显微刮片技术在肾囊肿病变的应用，首先由Zhuang等[5]报道，他们证实在肾囊肿上皮细胞表现LOH，他们以及其他许多作者认为在VHL患者中不典型肾囊肿病变是肾细胞的癌前病变，Zhuang等认为改良显微刮片技术很有用，该技术也已用于结肠癌资料库的DNA分析。本组研究每例组织块切片至少5张，每张切片刮取三类不同细胞，证实单层囊上皮有突变，此突变与肾癌细胞突变相同而与肾细胞不同，与前述作者的报道相符。但本组收取细胞抽提DNA的效果并不理想，主要表现在用于扩增的DNA质量问题，PCR成功率并没有他们报道的那么高。虽然PCR扩增受许多因素影响，本组作者已逐一对照排除其他影响因素。
我们的结果表明：①应用显微刮片获取的DNA是有效的，可用于PCR扩增，成功率约50%，显微刮片技术有难度；②这种福尔马林固定，石蜡包埋组织的DNA抽提常难以获取理想的DNA样本，许多作者已有报道[6]，DNA受理化因素作用过多，其自然特性受严重影响，况且这样处理后的组织，尤其是组织切片，细胞不完整，获取的DNA可能不完整，可以是DNA片断；③显微刮片获取的细胞是有限的，尤其是囊上皮细胞很少，因而，所获的DNA量很微量，需要特殊的抽提步骤和试剂盒；④正因为DNA可能不完整，PCR扩增的DNA也可能不完整，这种PCR产物与新鲜标本或冰冻组织DNA的PCR产物略有差别，有时在琼脂电泳中电泳带就有一些差异，有时需经过SSCP电泳后才显示不同，因此，可能难以获得理想的结果。本组的PCR-SSCP阳性率低也正因为如此；⑤抽提DNA所测定的浓度并不低，但核酸/蛋白质浓度比不够高，比值1.1～1.5，这表明DNA被福尔马林固定后可能结合了组蛋白等蛋白成分或其它未知成分难以去除。
, 百拇医药
总之，根据本组的实验结果表明，应用福尔马林固定，石蜡包埋组织刮片分析DNA适用于罕见病例，这仅是一种回顾性研究的权宜之计，最好的办法是采用新鲜或冰冻组织标本。
参考文献
1 Hartmut PH，Neumann，Zbar B.Renal cysts，renal cancer and von Hippel-Lindau disease.Kidney Int，1997，51：16
2 Latif F，Tony K，Gnarra J et al.Identification of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene.Science，1993，260：1317
3 Beroud C，Joly D，Tarlet G et al.Detection of VHL gene mutations in 46% of 170 sporadic RCC and computerized analysis of all VHL mutations.Am J Hum Gen，1995，57：115
, 百拇医药
4 Lubensky IA，Gnarra JA，Bertheau P et al.Allelic deletions of the VHL gene detected in multiple microscopic clear cell renal lesions in von Hippel-Lindau disease pateints.Am J Pathol，1996，149：2089
5 Zhuang ZP，Bertheau P，Emmert-Buck M et al.A microdissection technique for archival DNA analysis of special cell population in lesions<1mm in size.Am J Pathol，1995，146：620
6 An F，Fleming K.Removal of inhibitor(S) of the polymerase chain reaction from formalin fixed，paraffin wax embedded tissues.J Clin Pathol，1991，44：924
(1998-05-25收稿，1998-12-28修回), http://www.100md.com
单位：叶朝阳 第二军医大学长征医院肾内科(上海，200003)；Droz D B'eroud C Junien C Laboratoire de Pathologie，Departement de Nephrologie，Hpital Necker，Paris 75015 France
关键词：纤维刮片；VHL基因；肾肿瘤
Von Hippel
Von Hippel-Lindau(VHL)病也称Lindau综合征，是一种常染色体显性遗传病，表现为家族性多发性良、恶性肿瘤和囊肿，发病率1/600000～300000，至60岁外显率为97%，主要临床表现为视网膜血管母细胞瘤(50%～60%)，脑血管母细胞瘤(60%～80%)、胰腺囊肿(30%～65%)、肾细胞癌和(或)多发性肾囊肿(30%～60%)，以及肾上腺嗜铬细胞瘤(11%～19%)等[1]。肾细胞癌是最常见的致死原因，患者平均生存期为49岁，系统检查可早期发现肿瘤并可减少患者的肿瘤病死率。现已证明VHL基因是一种肿瘤抑制基因，自1993年Latif等[2]已证实VHL基因定位于3p25-26区，VHL基因的序列分析和鉴定提供了从分子水平诊断该疾病的办法。至今国内文献仅见个案报道。
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新鲜标本或冰冻组织抽提DNA已被广泛应用；福尔马林固定和石蜡包埋的标本抽提DNA也有报道，但PCR扩增常不成功，本文报道我们采用显微刮片样本检测VHL肿瘤抑制基因突变的结果。
1 材料和方法
1.1 组织处理 4例VHL患者均符合临床诊断标准并经病理组织学确诊。福尔马林固定，石蜡包埋的组织块选自巴黎Necker医院肾脏科病理实验室。这些标本是1995～1996年间VHL患者肾癌肾切除组织，组织用中性福尔马林固定，石蜡切片厚度为10μm，每份样本切取5～15张切片，切片按常规方法脱蜡，然后用伊红快速染色，自来水冲洗，室温干燥。
显微刮片技术：在显微镜下应用改良巴斯得小试管尖直接刮片。每张切片分三个部分刮取细胞，即囊肿上皮细胞，正常肾细胞和癌细胞，每类细胞至少刮取50～100个，刮下的细胞用Picolyte粘胶粘取，放入细胞溶解液中。
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1.2 DNA提取 每个小试管(PCR仪专用试管)含20μl细胞溶解液，细胞溶解液含Tris/HCl10mmol/L，pH7.6，EDTA10mmol/L，NaCl50mmol/L，SDS0.6%，以及蛋白酶-K0.1g/L。含细胞的溶解液放入37℃孵箱摇床消化过夜。次日消化液100℃灭活蛋白酶10min。此细胞消化液用Wizard TM PCR专用的DNA纯化试剂盒，纯化DNA(按说明书操作)。最后溶液体积40 μl。取10μl测定DNA含量。
1.3 PCR扩增 VHL基因三个外显子均有cDNA克隆片段，第一个外显子有4对cDNA克隆片段，见表1；本组使用7对引物，用以扩增VHL基因片段[3]。PCR扩增条件见表2。反应体系是：2.5 μl10×dNTP(200mmol/L)缓冲液，0～0.75μl DMSO，1.5μl MgCl2(1.5mmol/L)，0.5UTaq DNA聚合酶。3′-端和5′-端引物各1μl，反应总体积25μl。扩增后取产物5μl，加4 μl溴酚兰，0.8%～1.0%琼脂凝胶电泳，若PCR扩增成功，琼脂凝胶电泳显带，继而做单链构象多态性分析(SSCP)。
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1.4 SSCP分析 取扩增成功的PCR产物5μl(约50ng)，加20mmol/L的dTTP，dGTP和dCTP，0.2mmol/L α-33P标记的dATP，反应体系，成分和总体积与首次相同。制备变性聚丙烯酰胺电泳胶。加样：4μl PCR产物+4μl测序兰[95%(v/v)缓冲甲酰胺，10mmol/L EDTA，pH8.0，0.1%(w/v)溴酚兰和0.1%(w/v)氰二甲苯]，95℃变性10min，置入冰中冷却10min，然后加样电泳过夜。电泳功率8～10W，12～16 h(因外显子不同而异)，次日将凝胶转移到3M Wattman纸，真空烘干，放射自显影，观察有无突变电泳带。
1.5 DNA序列测定 将SSCP干胶上的变异电泳带切下，放入Eppendorf管内，加50μl双蒸水，95℃加热10 min，将胶中DNA溶解，取5μl按第一步PCR方法扩增，并纯化，用荧光标记引物，7-delta-dGTP测序试剂盒(按说明书操作)及激光扫描自动化测序仪(Pharmacia LKB.A.L.DNA Sequencer)进行序列分析。
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表1 引物核苷酸序列
引物名称
碱基数
序列(5’-3’)
VHL 3F
27
5’-CTG AGA CCC TAG TCT GCC ACT GAG GAT-3’
3R
27
5’-CAA AAG CTG AGA TGA AAC AGT GTA AGT-3’
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5’-CTT TAA CAA CCT TTG CTT GTC CCG ATA-3’
2R
27
5’-GTC TAT CCT GTA CTT ACC ACA ACA CCT-3’
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27
5’-CAT CTT CTG CAA TCG CAG TCC GCG CGT-3’
VHL 1-4R
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VHL 1-3F
27
5’-GAG GCA GGC GTC GAA GAG TAC GGC CCT-3’
1-3R
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5’-GAC TGC GAT TGC AGA AGA TGA CCT GGG-3’
VHL 1-2F
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5’-GCG GCG TCC GGC CCG GGT GGT CTG GAT-3’
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5’-CCT CGG CGC CCG ACT CCT CCC CGC CGT-3’
VHL 1-1F
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5’-AGT GGA AAT ACA GTA ACG AGT TGG CCT-3’
1-1R
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5’-GTC CCA GTT CTC CGC CCT CCG GGG CAT-3’
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5’-GTC AAG GCT GCA GTG AGC CAA GCT CGC-3’
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28
5’-TTC GCG CGC GCT CGG TAG AGG ATG GAA A-3’
表2 PCR循环周期温度和时间
引物名称
变性温度及时间
(min)
扩增温度
及时间
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复性延伸
及时间
(min)
exon-3，1-1，pre1-1
94℃，5
94℃，15；68℃，30
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exon 1-2，1-3，1-4
94℃，5
94℃，15；70℃，30
72℃.5
2 结 果
2.1 细胞获取情况 囊上皮细胞至少50个，肾小管上皮细胞和肾癌细胞各500～1000个。
2.2 DNA提取情况 福尔马林固定石蜡包埋切片标本抽取的DNA浓度为25～167kg/L，浓度高低与刮取细胞数多少有关，DNA与蛋白质比值为1.1～1.5。
2.3 PCR成功率 一般情况，采用5μl标本(含50μg DNA)用于PCR扩增，少数情况加样5μl含DNA 100μg，PCR扩增成功率约50%。在55次PCR中，有13次所有标本均失败，其余42次PCR，14次扩增满意，28次部分样本扩增成功。
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2.4 PCR-SSCP突变 4例样本均用VHL基因和3个外显子，7对引物扩增，其中3例PCR-SSCP未发现突变，仅1例(643号家庭)发现有突变，突变部位在外显子1-3。
本例突变与其新鲜血标本和冰冻组织(肿瘤块和肾组织块)标本提取的DNA具有相同的突变部位。
2.5 突变序列测定 经序列分析，突变点位于69号密码子，该密码子插入一碱基G，即由原来的GCG变为GGC(见附图)。
附图 正常序列图与突变序列图对比
3 讨 论
目前，人们已清楚认识了VHL病是一种常染色体显性遗传性疾病，近几年，VHL基因已有较广泛研究，VHL基因外显子及内含子的碱基突变已有不少报道[4]，癌症形成的“两步论”提示：在遗传性癌症性综合征诸如VHL病等疾病的基因型有两个等位基因，一个是遗传性种系突变，另一个是野生型功能缺失，它由染色体缺失(即杂合性缺失，LOH)或点突变造成，因而，在VHL患者肾脏组织细胞中应可检出VHL基因的LOH或突变。
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显微刮片技术在肾囊肿病变的应用，首先由Zhuang等[5]报道，他们证实在肾囊肿上皮细胞表现LOH，他们以及其他许多作者认为在VHL患者中不典型肾囊肿病变是肾细胞的癌前病变，Zhuang等认为改良显微刮片技术很有用，该技术也已用于结肠癌资料库的DNA分析。本组研究每例组织块切片至少5张，每张切片刮取三类不同细胞，证实单层囊上皮有突变，此突变与肾癌细胞突变相同而与肾细胞不同，与前述作者的报道相符。但本组收取细胞抽提DNA的效果并不理想，主要表现在用于扩增的DNA质量问题，PCR成功率并没有他们报道的那么高。虽然PCR扩增受许多因素影响，本组作者已逐一对照排除其他影响因素。
我们的结果表明：①应用显微刮片获取的DNA是有效的，可用于PCR扩增，成功率约50%，显微刮片技术有难度；②这种福尔马林固定，石蜡包埋组织的DNA抽提常难以获取理想的DNA样本，许多作者已有报道[6]，DNA受理化因素作用过多，其自然特性受严重影响，况且这样处理后的组织，尤其是组织切片，细胞不完整，获取的DNA可能不完整，可以是DNA片断；③显微刮片获取的细胞是有限的，尤其是囊上皮细胞很少，因而，所获的DNA量很微量，需要特殊的抽提步骤和试剂盒；④正因为DNA可能不完整，PCR扩增的DNA也可能不完整，这种PCR产物与新鲜标本或冰冻组织DNA的PCR产物略有差别，有时在琼脂电泳中电泳带就有一些差异，有时需经过SSCP电泳后才显示不同，因此，可能难以获得理想的结果。本组的PCR-SSCP阳性率低也正因为如此；⑤抽提DNA所测定的浓度并不低，但核酸/蛋白质浓度比不够高，比值1.1～1.5，这表明DNA被福尔马林固定后可能结合了组蛋白等蛋白成分或其它未知成分难以去除。
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总之，根据本组的实验结果表明，应用福尔马林固定，石蜡包埋组织刮片分析DNA适用于罕见病例，这仅是一种回顾性研究的权宜之计，最好的办法是采用新鲜或冰冻组织标本。
参考文献
1 Hartmut PH，Neumann，Zbar B.Renal cysts，renal cancer and von Hippel-Lindau disease.Kidney Int，1997，51：16
2 Latif F，Tony K，Gnarra J et al.Identification of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene.Science，1993，260：1317
3 Beroud C，Joly D，Tarlet G et al.Detection of VHL gene mutations in 46% of 170 sporadic RCC and computerized analysis of all VHL mutations.Am J Hum Gen，1995，57：115
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4 Lubensky IA，Gnarra JA，Bertheau P et al.Allelic deletions of the VHL gene detected in multiple microscopic clear cell renal lesions in von Hippel-Lindau disease pateints.Am J Pathol，1996，149：2089
5 Zhuang ZP，Bertheau P，Emmert-Buck M et al.A microdissection technique for archival DNA analysis of special cell population in lesions<1mm in size.Am J Pathol，1995，146：620
6 An F，Fleming K.Removal of inhibitor(S) of the polymerase chain reaction from formalin fixed，paraffin wax embedded tissues.J Clin Pathol，1991，44：924
(1998-05-25收稿，1998-12-28修回), http://www.100md.com