利福平白蛋白微球的研制*
作者：崔一民 鲁云兰 王培玉
单位：崔一民 鲁云兰 (北京医科大学第一临床医学院 北京100034)；王培玉 (北京医科大学药学院)
关键词：利福平；白蛋白微球；制备方法；含量测定；体外释放
中国医院药学杂志990301
摘要 目的：研究利福平白蛋白微球的制备和体外释放。方法：选用戊二醛为交联剂，采用聚合物分散法制备利福平白蛋白微球。结果：所得微球粒径范围为10～30 μm，微球中利福平含量为23.5±0.8%(w/w)。扫描电镜下观察载药微球呈圆形，但表面不光滑，有未洗脱的药物微粒存在。体外释放实验结果显示，利福平微球体外释放符合Higuchi方程，具有明显的缓释作用。结论：利福平适于制成微球制剂。
Studies on preparation and properties of rifampin albumin microspheres
, 百拇医药
Cui Yimin,Lu Yunlan,Wang Peiyu
(The First Teaching Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the preparation and release in vitro of rifampin albumin microspheres.METHODS：Rifampin albumin microspheres(RFP-MS) were prepared by polymeric dispersion method and glutaraldehyde was used as a cross linking agent.Drug release from RFP-MS was performed by a dialysis system.RESULTS：The diameter of RFP-MS ranged from 10 to 30 μm and the rifampin content was 23.5±0.8%.Scanning electron micrography showed the RFP-MS had spherical surface and some rifampin crystals were left on the RFP-MS surface.The results of in vitro drug release showed that the RFP-MS had a sustained release property and the release accorded with Higuchis equation.CONCLUSIONS：Microspheres are better form for rifampin.
, 百拇医药
KEY WORDS rifampin，albumin microsphere,preparation method,content determination,release in vitro
利福平(Rifampin)是目前广泛应用的一线抗结核药物，它对结核杆菌及其他分枝杆菌在宿主细胞内、外均有明显的杀菌作用。本品口服后主要在肝脏代谢，长期服用会造成肝损伤。因此将其制备成可供静脉输注的白蛋白微球制剂，使其具有肺组织靶向性，可提高肺组织中药物浓度，减少给药剂量和次数，降低毒副作用。本文研究了利福平白蛋白微球的制备方法，并对微球的理化性质及体外释放进行了考察。
1 仪器与材料
1.1仪器 UV-2100可见-紫外分光光度计(日本岛津公司)；CHJ-1型磁力恒温搅拌器(上海雷磁电子厂)。
1.2 材料 利福平原粉(医科院药物所协和药厂提供)；利福平标准品(卫生部药品生物制品检定所)；注射用油(北京制药总厂提供)；20%冻干人血清白蛋白(哈尔滨世亨生物制品公司)；透析袋(透析分子量为12000～14000，美国联合碳化物公司)；胃蛋白酶(活性1∶60000，北京市海淀区微生物培养基制品厂)；其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1微球的制备方法 将50 mg已过筛的利福平与0.5 ml白蛋白溶液在乳钵中研细，超声处理，分散于20 ml注射用油中，在转速为800 r.min-1条件下搅拌10 min，加入60 ml注射用油，于搅拌条件下缓缓加入25%戊二醛溶液0.1 ml，固化1.5 h，加入乙醚搅拌10 min，离心弃去上清液。微球用石油醚洗涤3次，异丙醇脱水，依次用磷酸盐缓冲液、蒸馏水洗涤。将微球分散于蒸馏水中，冷冻干燥24 h即得。
2.2 微球的形态观察 将利福平白蛋白微球、空白微球分别用光学显微镜和电子显微镜进行观察。用光学显微镜测定500个微球的粒径，平均粒径为18.1 μm，93%的微球粒径分布在10～30 μm的范围内，微球呈圆形、表面光滑、分布均匀、无粘联现象；电镜下空白微球表面光滑，而载药微球表面可见明显的大小不一的空洞、球体中有镶嵌的药物。载药微球表面空洞是由于洗涤过程中表面药物溶解所致。
, 百拇医药
2.3 含量测定方法的建立
2.3.1 含量测定方法 精密称量100 mg利福平标准品，加入20 ml甲醇使溶解，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释到100 ml。精密量取0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 ml贮备液，缓冲液稀释到100 ml，用紫外分光光度计在474±1 nm处测定其吸收度A，回归得浓度C对吸收度A的曲线方程：C=53.1 A-0.143,r=0.999 9。
2.3.2 精密度和回收率考察 配制浓度为5，10，20μg.ml-1的利福平样品，测定日内及日间相对标准偏差(RSD)。3个浓度的日内RSD数分别为0.5%，1.8%，1.5%(n=6)，日间RSD分别为2.0%，1.9%，2.3%(n=6)，结果见表1。称取10 mg空白微球置于250 ml容量瓶中，加入一定量的利福平标准溶液，使其满刻度时的浓度为10.05 μg.ml-1，再加入20 ml pH 1.5的盐酸溶液和活性为1∶60 000的胃蛋白酶适量，37 ℃恒温搅拌，待消化完毕，加入适量1 mol.L-1氢氧化钠溶液，调节pH至7，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，过滤，取滤液在474 nm处测定其吸收值。用同样方法测定浓度为20.10 μg.ml-1和40.20 μg.ml-1样品的回收率，结果见表2。
, 百拇医药
表 1 紫外分光光度法测定利福平溶液方法精密度 加入量
μg.ml-1
日内(n=6)
日间(n=6)
测定值/μg.ml-1
RSD/%
测定值/μg.ml-1
RSD/%
5
, 百拇医药
4.904
0.5
4.731
2.0
10
10.07
1.8
9.568
1.9
20
19.88
1.5
18.55
, http://www.100md.com
2.3
表 2 利福平回收率的测定结果 C标准/μg.ml-1
C测定/μg.ml-1
回收率/%
RSD/%
10.05
10.01
99.6
3.4
20.10
, 百拇医药
20.50
102.0
4.1
40.20
40.49
100.7
5.7
2.3.3 微球中药物含量测定 精密称取10 mg利福平微球，置于250 ml容量瓶中，如上述回收率测定项下方法处理。取滤液在474 nm处测定其吸收值，计算微球中利福平的百分含量，共测定微球3批，药物含量分别为22.86%，23.01%和23.46%，平均值为23.5%±0.8%。
2.4 微球的体外释放实验[1] 精密称取微球10 mg，置一透析袋中，两端扎紧，中间加pH 7.2的磷酸盐缓冲液2 ml。将其置于一盛有50 ml pH 7.2释放液的具塞三角瓶中，于37 ℃恒温、100 r.min-1条件下进行磁力搅拌。分别于0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h取样5 ml(每次取样后补充5 ml新鲜同种介质)，在474 nm处测定其吸收度A。计算累积释放百分率。利福平白蛋白微球体外释药曲线见图1(图中各点代表3次测定之平均值)，24 h释放药量88%，而未经微球化的利福平10 min释放高达96%。以累积释放百分数Y对t1/2作图，得回归方程Y=0.173 4 t1/2+0.167 2,r=0.942 1；以ln(1-Y)对t作图，得回归方程ln(1-Y)=-0.080 8 t-0.429 7,r=0.933 3；因0.942 1>0.933 3，故药物从微球中释放符合Higuchi方程，即Y与t1/2成正比。
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图 1 利福平白蛋白微球体外释放曲线
—— 利福平 -.-.-. 利福平白蛋白微球
3 讨论
由于利福平为一脂溶性药物，极易溶于有机溶媒，为了提高微球载药量，在制备工艺中采用冷冻干燥法脱水，可明显提高药物的含量，减少静脉注射时的用药量。利福平在水中溶解度较小，在制备时，为了保证药物能充分被白蛋白包裹成球，应将利福平过细筛，与白蛋白混合时再经超声分散。
本实验主要研究了做为靶向制剂的利福平白蛋白微球的制备及其理化性质。Pande S等[2]将利福平作成白蛋白微球，通过控制微球的大小，能使62%的药物储留于肺部，这样就有效的提高了肺部药物浓度。Iseri E[3]研究表明，将利福平制成粒径为25～27 μm白蛋白微球和明胶微球静脉制剂，使用比正常量小得多的药物就能达到有效的治疗浓度。魏树礼等[4]将链霉素制成白蛋白微球用于静脉注射，肺部分布明显高于其他组织。以上实验结果表明，将利福平制成微球制剂是一种比较理想的选择。
, http://www.100md.com
*本文为国家自然科学基金资助课题
参考文献
1 Sugibayashi K.Drug-carrier property of albumin microspheres in chemotherapy,Ⅲ.Effect of microsphere entrapped 5-fluorouracil on Ehrilich ascites carcinoma in mice.J Pharm Dyn,1979,2:350
2 Pande S,Vyas SP.Localized rifampin albumin microspheres.J mocrocapsulation,1991,8(1):87
3 Iseri E,Kas HS,Hincal AA.Rifampin microsphere:formulation and in vitro release characteristics,Chim Oggi,1989,7:15
4 魏树礼，高智慧.注射用硫酸链霉素白蛋白微球的研究.药学学报，1990，130(2)：66
(1998年2月26日收稿), http://www.100md.com
单位：崔一民 鲁云兰 (北京医科大学第一临床医学院 北京100034)；王培玉 (北京医科大学药学院)
关键词：利福平；白蛋白微球；制备方法；含量测定；体外释放
中国医院药学杂志990301
摘要 目的：研究利福平白蛋白微球的制备和体外释放。方法：选用戊二醛为交联剂，采用聚合物分散法制备利福平白蛋白微球。结果：所得微球粒径范围为10～30 μm，微球中利福平含量为23.5±0.8%(w/w)。扫描电镜下观察载药微球呈圆形，但表面不光滑，有未洗脱的药物微粒存在。体外释放实验结果显示，利福平微球体外释放符合Higuchi方程，具有明显的缓释作用。结论：利福平适于制成微球制剂。
Studies on preparation and properties of rifampin albumin microspheres
, 百拇医药
Cui Yimin,Lu Yunlan,Wang Peiyu
(The First Teaching Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034)
ABSTRACT OBJECTIVE：To study the preparation and release in vitro of rifampin albumin microspheres.METHODS：Rifampin albumin microspheres(RFP-MS) were prepared by polymeric dispersion method and glutaraldehyde was used as a cross linking agent.Drug release from RFP-MS was performed by a dialysis system.RESULTS：The diameter of RFP-MS ranged from 10 to 30 μm and the rifampin content was 23.5±0.8%.Scanning electron micrography showed the RFP-MS had spherical surface and some rifampin crystals were left on the RFP-MS surface.The results of in vitro drug release showed that the RFP-MS had a sustained release property and the release accorded with Higuchis equation.CONCLUSIONS：Microspheres are better form for rifampin.
, 百拇医药
KEY WORDS rifampin，albumin microsphere,preparation method,content determination,release in vitro
利福平(Rifampin)是目前广泛应用的一线抗结核药物，它对结核杆菌及其他分枝杆菌在宿主细胞内、外均有明显的杀菌作用。本品口服后主要在肝脏代谢，长期服用会造成肝损伤。因此将其制备成可供静脉输注的白蛋白微球制剂，使其具有肺组织靶向性，可提高肺组织中药物浓度，减少给药剂量和次数，降低毒副作用。本文研究了利福平白蛋白微球的制备方法，并对微球的理化性质及体外释放进行了考察。
1 仪器与材料
1.1仪器 UV-2100可见-紫外分光光度计(日本岛津公司)；CHJ-1型磁力恒温搅拌器(上海雷磁电子厂)。
1.2 材料 利福平原粉(医科院药物所协和药厂提供)；利福平标准品(卫生部药品生物制品检定所)；注射用油(北京制药总厂提供)；20%冻干人血清白蛋白(哈尔滨世亨生物制品公司)；透析袋(透析分子量为12000～14000，美国联合碳化物公司)；胃蛋白酶(活性1∶60000，北京市海淀区微生物培养基制品厂)；其余试剂均为分析纯。
, 百拇医药
2 方法与结果
2.1微球的制备方法 将50 mg已过筛的利福平与0.5 ml白蛋白溶液在乳钵中研细，超声处理，分散于20 ml注射用油中，在转速为800 r.min-1条件下搅拌10 min，加入60 ml注射用油，于搅拌条件下缓缓加入25%戊二醛溶液0.1 ml，固化1.5 h，加入乙醚搅拌10 min，离心弃去上清液。微球用石油醚洗涤3次，异丙醇脱水，依次用磷酸盐缓冲液、蒸馏水洗涤。将微球分散于蒸馏水中，冷冻干燥24 h即得。
2.2 微球的形态观察 将利福平白蛋白微球、空白微球分别用光学显微镜和电子显微镜进行观察。用光学显微镜测定500个微球的粒径，平均粒径为18.1 μm，93%的微球粒径分布在10～30 μm的范围内，微球呈圆形、表面光滑、分布均匀、无粘联现象；电镜下空白微球表面光滑，而载药微球表面可见明显的大小不一的空洞、球体中有镶嵌的药物。载药微球表面空洞是由于洗涤过程中表面药物溶解所致。
, 百拇医药
2.3 含量测定方法的建立
2.3.1 含量测定方法 精密称量100 mg利福平标准品，加入20 ml甲醇使溶解，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释到100 ml。精密量取0.1，0.2，0.5，1，2，5，10 ml贮备液，缓冲液稀释到100 ml，用紫外分光光度计在474±1 nm处测定其吸收度A，回归得浓度C对吸收度A的曲线方程：C=53.1 A-0.143,r=0.999 9。
2.3.2 精密度和回收率考察 配制浓度为5，10，20μg.ml-1的利福平样品，测定日内及日间相对标准偏差(RSD)。3个浓度的日内RSD数分别为0.5%，1.8%，1.5%(n=6)，日间RSD分别为2.0%，1.9%，2.3%(n=6)，结果见表1。称取10 mg空白微球置于250 ml容量瓶中，加入一定量的利福平标准溶液，使其满刻度时的浓度为10.05 μg.ml-1，再加入20 ml pH 1.5的盐酸溶液和活性为1∶60 000的胃蛋白酶适量，37 ℃恒温搅拌，待消化完毕，加入适量1 mol.L-1氢氧化钠溶液，调节pH至7，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，过滤，取滤液在474 nm处测定其吸收值。用同样方法测定浓度为20.10 μg.ml-1和40.20 μg.ml-1样品的回收率，结果见表2。
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表 1 紫外分光光度法测定利福平溶液方法精密度 加入量
μg.ml-1
日内(n=6)
日间(n=6)
测定值/μg.ml-1
RSD/%
测定值/μg.ml-1
RSD/%
5
, 百拇医药
4.904
0.5
4.731
2.0
10
10.07
1.8
9.568
1.9
20
19.88
1.5
18.55
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2.3
表 2 利福平回收率的测定结果 C标准/μg.ml-1
C测定/μg.ml-1
回收率/%
RSD/%
10.05
10.01
99.6
3.4
20.10
, 百拇医药
20.50
102.0
4.1
40.20
40.49
100.7
5.7
2.3.3 微球中药物含量测定 精密称取10 mg利福平微球，置于250 ml容量瓶中，如上述回收率测定项下方法处理。取滤液在474 nm处测定其吸收值，计算微球中利福平的百分含量，共测定微球3批，药物含量分别为22.86%，23.01%和23.46%，平均值为23.5%±0.8%。
2.4 微球的体外释放实验[1] 精密称取微球10 mg，置一透析袋中，两端扎紧，中间加pH 7.2的磷酸盐缓冲液2 ml。将其置于一盛有50 ml pH 7.2释放液的具塞三角瓶中，于37 ℃恒温、100 r.min-1条件下进行磁力搅拌。分别于0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h取样5 ml(每次取样后补充5 ml新鲜同种介质)，在474 nm处测定其吸收度A。计算累积释放百分率。利福平白蛋白微球体外释药曲线见图1(图中各点代表3次测定之平均值)，24 h释放药量88%，而未经微球化的利福平10 min释放高达96%。以累积释放百分数Y对t1/2作图，得回归方程Y=0.173 4 t1/2+0.167 2,r=0.942 1；以ln(1-Y)对t作图，得回归方程ln(1-Y)=-0.080 8 t-0.429 7,r=0.933 3；因0.942 1>0.933 3，故药物从微球中释放符合Higuchi方程，即Y与t1/2成正比。
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图 1 利福平白蛋白微球体外释放曲线
—— 利福平 -.-.-. 利福平白蛋白微球
3 讨论
由于利福平为一脂溶性药物，极易溶于有机溶媒，为了提高微球载药量，在制备工艺中采用冷冻干燥法脱水，可明显提高药物的含量，减少静脉注射时的用药量。利福平在水中溶解度较小，在制备时，为了保证药物能充分被白蛋白包裹成球，应将利福平过细筛，与白蛋白混合时再经超声分散。
本实验主要研究了做为靶向制剂的利福平白蛋白微球的制备及其理化性质。Pande S等[2]将利福平作成白蛋白微球，通过控制微球的大小，能使62%的药物储留于肺部，这样就有效的提高了肺部药物浓度。Iseri E[3]研究表明，将利福平制成粒径为25～27 μm白蛋白微球和明胶微球静脉制剂，使用比正常量小得多的药物就能达到有效的治疗浓度。魏树礼等[4]将链霉素制成白蛋白微球用于静脉注射，肺部分布明显高于其他组织。以上实验结果表明，将利福平制成微球制剂是一种比较理想的选择。
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*本文为国家自然科学基金资助课题
参考文献
1 Sugibayashi K.Drug-carrier property of albumin microspheres in chemotherapy,Ⅲ.Effect of microsphere entrapped 5-fluorouracil on Ehrilich ascites carcinoma in mice.J Pharm Dyn,1979,2:350
2 Pande S,Vyas SP.Localized rifampin albumin microspheres.J mocrocapsulation,1991,8(1):87
3 Iseri E,Kas HS,Hincal AA.Rifampin microsphere:formulation and in vitro release characteristics,Chim Oggi,1989,7:15
4 魏树礼，高智慧.注射用硫酸链霉素白蛋白微球的研究.药学学报，1990，130(2)：66
(1998年2月26日收稿), http://www.100md.com