体内药物定量分析方法的评价与认证
作者：刘会臣
单位：白求恩国际和平医院 石家庄050082
关键词：
中国医院药学杂志990330
体内药物分析涉及的生物样品种类很多，有血清、血浆、尿液、粪便、淋巴液、唾液、胆汁、脑脊液、各种组织等。目前，常用的各类药物有千余种，不同药物的使用剂量及体内处置过程等方面都有一定的差异，这就导致了不同药物即使在同一个体的同一组织中浓度的不同，如血药浓度从mg水平到pg水平都有；即使在同一个体内，同一种药物也会因分布不均一而使各种组织中的药物浓度不同，相差几倍到数百倍。
为了进行药物代谢动力学及生物利用度方面的试验研究，首先要建立一个合格的体内药物分析定量方法。建立方法，应尽量了解和掌握药物理化性质及体内处置过程，主要应考虑分析测定方法灵敏度与样品中药物浓度水平相适应，参考相关文献资料并结合本实验室的实际情况，选择测定方法。常见的体内药物定量分析方法及其特性见表1[1]。测定方法在用于实际工作之前，须经过下列内容的评价(evaluation)和认证(validation)。
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表 1 常用体内药物分析方法及其特性 方 法
最低检测限(ng)
选择性
UV
100
-
FLU
1
+
TLC-UV
10
++
TLC-FLU
, 百拇医药
1
++
GC-FID
1
++
GC-NPD
0.1
+++
GC-ECD
0.01
+++
GC-MS
0.001
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++++
HPLC-UV
1
++
HPLC-FLU
0.1
+++
HPLC-ECD
0.01
+++
RIA
0.001
++
, 百拇医药
EIMT
0.001
++
FPIA
0.001
++
1 选择性(selectivity)
选择性表示在其它干扰组分共存的复杂样品中，准确和专一地测定待分析物的能力。生物样品中内源性物质(蛋白质、多肽、激素、递质、类脂、色素、无机盐等)和外源性物质(合用药物、药物代谢产物、从食物中摄取的物质等)，都有可能干扰待测药物的定量。此外，生物样品在提取、浓缩、衍生化等过程中，所用试剂纯度不高，亦会影响分析方法的选择性。
体内药物分析方法是否有内源性物质的干扰，可通过分析空白样品来确定。在临床前试验中，由于动物的种属、饲养条件控制严格，一般取3个以上个体的空白样品即可；但在临床试验中，至少需要6个以上个体的空白样品，每个个体在用药前均采空白样品最好[2]。
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体内药物定量分析时，要特别注意合用药物及药物代谢产物的干扰。在空白样品中加入可能合并应用的药物，其浓度应尽可能达到临床样品的高限，以证实是否对待测药物有干扰。药物的代谢产物通常极性变大，一般不难与原药分离，通过在不同条件测定用药前后的生物样品，可了解有无代谢物及其是否干扰原药的定量；最好能同时测定代谢物，尤其是活性代谢物。当药物在体内发生构型转变时，对测定方法的分离度要求更高；我们在测定兔血清中依托泊苷的过程中，检测到其两种代谢产物-顺依托泊苷和反式依托泊苷羟基酸，依托泊苷与顺依托泊苷两者色谱行为十分接近[3]。
体内药物定量分析方法通常都有微小的干扰存在，尤其是测定浓度较低时更应引起重视。一般应控制标准曲线回归方程的截距在最低定量限(limit of quantification,LOQ)之响应值的20%以下。另外，最好能采用气-质联用仪、液-质联用仪、二极管阵列检测器确认实际样品的目标峰及其纯度[2]。
, http://www.100md.com 2 标准曲线与线性范围(standard curve and linear range)
线性范围表示仪器能产生成比例响应的待测药物的浓度范围。通常是通过对加有不同浓度待测物质的标准品(摸拟生物样品)逐个分析来确定的，一般需要6～10个点，高浓度应是低浓度的50～500倍；如果试验(如毒理药代动力学试验)要求浓度范围很大，可建立两条头尾相互重叠的标准曲线。对线性回归方程的计算一般不推荐使用空白样品，也不应强制使标准曲线通过坐标0点。当标准曲线范围较宽时，应考虑采用权重系数(1/C或1/C2)以避免偏差。标准曲线回归方程一般用最小二乘法直线回归求得，要求相关系数应大于0.99。此外，还可采用计算偏差(Bias%)方法评价之，即将标准曲线中每个浓度(加入值)的响应值代入方程中，求得其浓度(计算值)，偏差(%)=|加入值-计算值|/加入值×100%，以偏差值恒定和最小为好。如果每个浓度的偏差均<20%，标准曲线可被接受；如有2个以上浓度的偏差>20%，其余点不足5个时，标准曲线应重做[2.4]。
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在实际测定过程中，不应外推标准曲线的范围。如样品浓度超过了最高工作浓度，可适当稀释样品；如样品不够第2次测定，而该样品又十分重要时，标准曲线的高限可外推20%，但结果应以文字注明[2]。
3 灵敏度(sensitivity)
分析方法的灵敏度包括两个方面，检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。LOD是指分析方法定性检测生物样品中待测物的最低浓度。LOQ是指分析方法能准确精密定量测定生物样品中待测物的最低浓度。
测定LOQ和LOD的方法通常是在空白样品中加入微量标准品，以能产生信/噪比(S/N)≥3的样品浓度为LOD，能产生S/N≥10的样品浓度为LOQ。另外还可测定一组空白样品的本底响应，由下列公式计算出：LOD=0+3SD，LOQ=0+10SD，式中0和SD分别是本底响应值的平均值和标准偏差[5]。
, 百拇医药
在实际研究中，LOQ通常是标准曲线的最低浓度，在LOQ以下的样品浓度可计为BQL(below the quantification limit)，不能用于药代动力学计算，也不能视为0处理[2]。
4 回收率
回收率是用来衡量测定方法对生物样品中待测物的检测效能的，表示测定结果与真实值的接近程度，亦即测量值的正确性。由于生物样品中干扰组分复杂多变，来自不同个体的样品可能增加或减少待测物的分析响应，所以测定前往往需要预处理、提取、净化、浓缩等，这样势必造成待测物的损失。如果模拟生物样品经整个样品处理过程，而相应标准溶液直接分析，两者的响应值之比称为绝对回收率(absolute recovery)；若标准溶液也经过整个样品处理过程，所得响应值之比称为相对回收率(relative recovery)。绝对回收率一般应大于70%，过低说明方法中待测物质损失严重，过高(>105%)说明有非专一性物质干扰；相对回收率能直接反映测定结果与真实值的接近程度，应控制在100%左右(95%～105%)。绝对回收率和相对回收率都应基本恒定，且在高、低浓度时无明显差别。测定回收率所用模拟生物样品的浓度至少包含标准曲线范围内的高、中、低三个点[2.5]。
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回收率并非总能反应生物样品的真实情况，但由于真实值难以测得等原因，目前仍常用该指标评价分析的准确的。
5 精密度(precision)
精密度表示平行测定结果的互相接近程度，一般用变异系数(coefficient of variation,CV)表示，CV亦即重复测定同一实际样品或模拟生物样品的相对标准偏差(RSD)。
每次测定均应经过从样品制备到样品处理测定的整个过程。CV可分为日内(within day)CV和日间(day-to-day)CV，批内(intraassay)CV和批间(interassay)CV。随着仪器性能的改善和自动进样器的使用，样品测定不再以日来区分，而且是成批测定，这样情况下使用批内、批间CV更具有实际意义[6]。
求算测定方法的CV，应在曲线标准范围内取高、中、低三个浓度，每个浓度测定5个以上样品。一般要求CV应小于15%，低浓度水平或复杂方法可放宽到小于20%。
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值得说明的是，精密度仅表示测定的重现性，但精密是保证准确的提前。
6 稳定性(stability)
在样品方面，应考察生物样品中待测物在室温条件下的稳定性，冷冻条件下的稳定性，反复冷冻、解冻后的变化，加入稳定剂对待测物稳定性的影响，以解决待测样品应在什么条件下贮存，贮存不能超过多长时间；同时，不能忽视对处理后待分析样品的稳定性考察，分析测定时的条件、环境以及样品放置时间都有可能影响结果。
在仪器和试剂方面，仪器的性能不稳定、老化、更换配件；试剂长时间放置、重新配制、更换来源或批号，都会给测定结果带来影响。在人员或环境方面，操作人员的熟练程度，中途异人，试验跨季节等，亦会导致测定结果偏差。
7 质量控制(quality control,QC)
, 百拇医药 为了及时发现问题，确保测定结果的准确、精密，需要进行质量控制，以检测分析过程可能出现偶然或系统误差。其方法一般是设置高、中、低三个已知浓度的模拟样品，每次测定6个样品，要求至少有4个样品测定值在真实值的±20%范围内，且同一浓度的两个样品不得均超过真实值的±20%[4]。质控样品不能以标准曲线的样品代替，必需分别制备。USP要求质控和标准曲线的样品应占所有测定样品的1/5，并且应随机加入[7]。
如试验是由两个或两个以上单位参加，还应进行室间质量控制(external quality control,EQC)，以保证由不同实验室(测定方法有时不同)得到的结果准确、一致。
体内药物定量分析方法的评价与认证是药代动力学及生物利用度试验研究的重要部分，直接关系到结果的准确性，必须引起足够的重视。
参考文献
, 百拇医药
1 陈 刚主编.治疗药物监测.北京：人民军医出版社，1988：79
2 Braggio S,Barnabg RJ,Grossi P,et al.A strategy for validation of bioanalytical methods.J Pharm Biom Anal,1996,14:375
3 刘会臣，胡玉钦，王 建等.家兔静脉注射依托泊甙的药物动力学研究.中国医药工业杂志，1996，28：543
4 Shan VP,Mioha KK,Dighe S,et al.Analytical methods validation:bioavailibility,bioequivalence and pharmacokinetic studies.J Pharmaceut Sci,1992,81:309
5 曾 苏.生物药物分析方法的认证、质量控制及其标准操作规程.中国医药工业杂志，1995，26：136
6 魏敏吉，李家泰.药代动力学、生物利用度研究的标准化问题.中国临床药理学杂志，1997，13：247
7 USP edⅩ Ⅹ Ⅲ,1995:1 932
(1998年5月17日收稿), 百拇医药
单位：白求恩国际和平医院 石家庄050082
关键词：
中国医院药学杂志990330
体内药物分析涉及的生物样品种类很多，有血清、血浆、尿液、粪便、淋巴液、唾液、胆汁、脑脊液、各种组织等。目前，常用的各类药物有千余种，不同药物的使用剂量及体内处置过程等方面都有一定的差异，这就导致了不同药物即使在同一个体的同一组织中浓度的不同，如血药浓度从mg水平到pg水平都有；即使在同一个体内，同一种药物也会因分布不均一而使各种组织中的药物浓度不同，相差几倍到数百倍。
为了进行药物代谢动力学及生物利用度方面的试验研究，首先要建立一个合格的体内药物分析定量方法。建立方法，应尽量了解和掌握药物理化性质及体内处置过程，主要应考虑分析测定方法灵敏度与样品中药物浓度水平相适应，参考相关文献资料并结合本实验室的实际情况，选择测定方法。常见的体内药物定量分析方法及其特性见表1[1]。测定方法在用于实际工作之前，须经过下列内容的评价(evaluation)和认证(validation)。
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表 1 常用体内药物分析方法及其特性 方 法
最低检测限(ng)
选择性
UV
100
-
FLU
1
+
TLC-UV
10
++
TLC-FLU
, 百拇医药
1
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GC-FID
1
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GC-NPD
0.1
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GC-ECD
0.01
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GC-MS
0.001
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++++
HPLC-UV
1
++
HPLC-FLU
0.1
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HPLC-ECD
0.01
+++
RIA
0.001
++
, 百拇医药
EIMT
0.001
++
FPIA
0.001
++
1 选择性(selectivity)
选择性表示在其它干扰组分共存的复杂样品中，准确和专一地测定待分析物的能力。生物样品中内源性物质(蛋白质、多肽、激素、递质、类脂、色素、无机盐等)和外源性物质(合用药物、药物代谢产物、从食物中摄取的物质等)，都有可能干扰待测药物的定量。此外，生物样品在提取、浓缩、衍生化等过程中，所用试剂纯度不高，亦会影响分析方法的选择性。
体内药物分析方法是否有内源性物质的干扰，可通过分析空白样品来确定。在临床前试验中，由于动物的种属、饲养条件控制严格，一般取3个以上个体的空白样品即可；但在临床试验中，至少需要6个以上个体的空白样品，每个个体在用药前均采空白样品最好[2]。
, http://www.100md.com
体内药物定量分析时，要特别注意合用药物及药物代谢产物的干扰。在空白样品中加入可能合并应用的药物，其浓度应尽可能达到临床样品的高限，以证实是否对待测药物有干扰。药物的代谢产物通常极性变大，一般不难与原药分离，通过在不同条件测定用药前后的生物样品，可了解有无代谢物及其是否干扰原药的定量；最好能同时测定代谢物，尤其是活性代谢物。当药物在体内发生构型转变时，对测定方法的分离度要求更高；我们在测定兔血清中依托泊苷的过程中，检测到其两种代谢产物-顺依托泊苷和反式依托泊苷羟基酸，依托泊苷与顺依托泊苷两者色谱行为十分接近[3]。
体内药物定量分析方法通常都有微小的干扰存在，尤其是测定浓度较低时更应引起重视。一般应控制标准曲线回归方程的截距在最低定量限(limit of quantification,LOQ)之响应值的20%以下。另外，最好能采用气-质联用仪、液-质联用仪、二极管阵列检测器确认实际样品的目标峰及其纯度[2]。
, http://www.100md.com 2 标准曲线与线性范围(standard curve and linear range)
线性范围表示仪器能产生成比例响应的待测药物的浓度范围。通常是通过对加有不同浓度待测物质的标准品(摸拟生物样品)逐个分析来确定的，一般需要6～10个点，高浓度应是低浓度的50～500倍；如果试验(如毒理药代动力学试验)要求浓度范围很大，可建立两条头尾相互重叠的标准曲线。对线性回归方程的计算一般不推荐使用空白样品，也不应强制使标准曲线通过坐标0点。当标准曲线范围较宽时，应考虑采用权重系数(1/C或1/C2)以避免偏差。标准曲线回归方程一般用最小二乘法直线回归求得，要求相关系数应大于0.99。此外，还可采用计算偏差(Bias%)方法评价之，即将标准曲线中每个浓度(加入值)的响应值代入方程中，求得其浓度(计算值)，偏差(%)=|加入值-计算值|/加入值×100%，以偏差值恒定和最小为好。如果每个浓度的偏差均<20%，标准曲线可被接受；如有2个以上浓度的偏差>20%，其余点不足5个时，标准曲线应重做[2.4]。
, http://www.100md.com
在实际测定过程中，不应外推标准曲线的范围。如样品浓度超过了最高工作浓度，可适当稀释样品；如样品不够第2次测定，而该样品又十分重要时，标准曲线的高限可外推20%，但结果应以文字注明[2]。
3 灵敏度(sensitivity)
分析方法的灵敏度包括两个方面，检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantification,LOQ)。LOD是指分析方法定性检测生物样品中待测物的最低浓度。LOQ是指分析方法能准确精密定量测定生物样品中待测物的最低浓度。
测定LOQ和LOD的方法通常是在空白样品中加入微量标准品，以能产生信/噪比(S/N)≥3的样品浓度为LOD，能产生S/N≥10的样品浓度为LOQ。另外还可测定一组空白样品的本底响应，由下列公式计算出：LOD=0+3SD，LOQ=0+10SD，式中0和SD分别是本底响应值的平均值和标准偏差[5]。
, 百拇医药
在实际研究中，LOQ通常是标准曲线的最低浓度，在LOQ以下的样品浓度可计为BQL(below the quantification limit)，不能用于药代动力学计算，也不能视为0处理[2]。
4 回收率
回收率是用来衡量测定方法对生物样品中待测物的检测效能的，表示测定结果与真实值的接近程度，亦即测量值的正确性。由于生物样品中干扰组分复杂多变，来自不同个体的样品可能增加或减少待测物的分析响应，所以测定前往往需要预处理、提取、净化、浓缩等，这样势必造成待测物的损失。如果模拟生物样品经整个样品处理过程，而相应标准溶液直接分析，两者的响应值之比称为绝对回收率(absolute recovery)；若标准溶液也经过整个样品处理过程，所得响应值之比称为相对回收率(relative recovery)。绝对回收率一般应大于70%，过低说明方法中待测物质损失严重，过高(>105%)说明有非专一性物质干扰；相对回收率能直接反映测定结果与真实值的接近程度，应控制在100%左右(95%～105%)。绝对回收率和相对回收率都应基本恒定，且在高、低浓度时无明显差别。测定回收率所用模拟生物样品的浓度至少包含标准曲线范围内的高、中、低三个点[2.5]。
, http://www.100md.com
回收率并非总能反应生物样品的真实情况，但由于真实值难以测得等原因，目前仍常用该指标评价分析的准确的。
5 精密度(precision)
精密度表示平行测定结果的互相接近程度，一般用变异系数(coefficient of variation,CV)表示，CV亦即重复测定同一实际样品或模拟生物样品的相对标准偏差(RSD)。
每次测定均应经过从样品制备到样品处理测定的整个过程。CV可分为日内(within day)CV和日间(day-to-day)CV，批内(intraassay)CV和批间(interassay)CV。随着仪器性能的改善和自动进样器的使用，样品测定不再以日来区分，而且是成批测定，这样情况下使用批内、批间CV更具有实际意义[6]。
求算测定方法的CV，应在曲线标准范围内取高、中、低三个浓度，每个浓度测定5个以上样品。一般要求CV应小于15%，低浓度水平或复杂方法可放宽到小于20%。
, http://www.100md.com
值得说明的是，精密度仅表示测定的重现性，但精密是保证准确的提前。
6 稳定性(stability)
在样品方面，应考察生物样品中待测物在室温条件下的稳定性，冷冻条件下的稳定性，反复冷冻、解冻后的变化，加入稳定剂对待测物稳定性的影响，以解决待测样品应在什么条件下贮存，贮存不能超过多长时间；同时，不能忽视对处理后待分析样品的稳定性考察，分析测定时的条件、环境以及样品放置时间都有可能影响结果。
在仪器和试剂方面，仪器的性能不稳定、老化、更换配件；试剂长时间放置、重新配制、更换来源或批号，都会给测定结果带来影响。在人员或环境方面，操作人员的熟练程度，中途异人，试验跨季节等，亦会导致测定结果偏差。
7 质量控制(quality control,QC)
, 百拇医药 为了及时发现问题，确保测定结果的准确、精密，需要进行质量控制，以检测分析过程可能出现偶然或系统误差。其方法一般是设置高、中、低三个已知浓度的模拟样品，每次测定6个样品，要求至少有4个样品测定值在真实值的±20%范围内，且同一浓度的两个样品不得均超过真实值的±20%[4]。质控样品不能以标准曲线的样品代替，必需分别制备。USP要求质控和标准曲线的样品应占所有测定样品的1/5，并且应随机加入[7]。
如试验是由两个或两个以上单位参加，还应进行室间质量控制(external quality control,EQC)，以保证由不同实验室(测定方法有时不同)得到的结果准确、一致。
体内药物定量分析方法的评价与认证是药代动力学及生物利用度试验研究的重要部分，直接关系到结果的准确性，必须引起足够的重视。
参考文献
, 百拇医药
1 陈 刚主编.治疗药物监测.北京：人民军医出版社，1988：79
2 Braggio S,Barnabg RJ,Grossi P,et al.A strategy for validation of bioanalytical methods.J Pharm Biom Anal,1996,14:375
3 刘会臣，胡玉钦，王 建等.家兔静脉注射依托泊甙的药物动力学研究.中国医药工业杂志，1996，28：543
4 Shan VP,Mioha KK,Dighe S,et al.Analytical methods validation:bioavailibility,bioequivalence and pharmacokinetic studies.J Pharmaceut Sci,1992,81:309
5 曾 苏.生物药物分析方法的认证、质量控制及其标准操作规程.中国医药工业杂志，1995，26：136
6 魏敏吉，李家泰.药代动力学、生物利用度研究的标准化问题.中国临床药理学杂志，1997，13：247
7 USP edⅩ Ⅹ Ⅲ,1995:1 932
(1998年5月17日收稿), 百拇医药