实验性膜性肾小球肾炎大鼠红细胞免疫功能的初步研究
作者：武宝玉 袁申元 魏民 李伯光
单位：武宝玉 袁申元 首都医科大学附属北京同仁医院内科；魏民 李伯光 北京中医药大学病理学教研室
关键词：膜性肾小球肾炎；红细胞；免疫功能
首都医科大学学报/990308 提要： 对实验性膜性肾小球肾炎大鼠红细胞C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环率进行检测。发现：膜性肾小球肾炎大鼠C3b受体活性明显降低。结果提示红细胞免疫功能异常可能与膜性肾小球肾炎的发病有关。
中图分类号： R692.31
A Preliminary Study on RBC Immune Function in Rats with Experimental
, 百拇医药
Membranous Glomerulonephritis
Wu Baoyu, Yuan Shenyuan
Department of Internal Medicine, Beijing Tongren Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Wei Min, Li Boguang
Department of Pathology, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
Abstract: The RBC C3b receptor rosette (RBC-C3bRR) and RBC immune complex rosette(RBC-ICR) in rats with experimental membranous glomerulonephritis were studied. It was found that there was significant reduction of activity of the RBC C3b receptor in rats with membranous glomerulonephritis as compared with the control group. The results showed that the disturbance of RBC immune function might be related to the pathogenesis of membranous glomerulonephritis.
, 百拇医药
Key words: membranous glomerulonephritis; red blood cell; immune function The RBC C3b receptor rosette (RBC-C3bRR) and RBC immune complex rosette(RBC-ICR) in rats with experimental membranous glomerulonephritis were studied. It was found that there was significant reduction of activity of the RBC C3b receptor in rats with membranous glomerulonephritis as compared with the control group. The results showed that the disturbance of RBC immune function might be related to the pathogenesis of membranous glomerulonephritis.
, 百拇医药
Key words: membranous glomerulonephritis; red blood cell; immune function
1981年，Siegel等提出了“红细胞免疫系统”的新概念[1]，引起国内外学者的广泛重视。红细胞免疫功能有多种表现，其中最为突出的是对血中免疫复合物及外来抗原的清除作用[2]。除了已广泛研究的体液免疫和细胞免疫(即白细胞免疫系统)外，红细胞免疫与膜性肾小球肾炎(以下简称膜性肾炎)的关系如何， 目前尚未见报道。本研究用阳离子化牛血清白蛋白复制大鼠膜性肾炎病理模型，并对其红细胞免疫功能进行初步研究。
1 材料和方法
1.1 大鼠膜性肾炎病理模型的复制
用化学方法提高天然牛血清白蛋白(N-BSA，电泳纯)的等电点，使之大于9.0，制成阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。实验动物为健康雄性SD大鼠(北京医科大学动物室提供)，体质量160～200 g，随机分为病理组和正常对照组。
, 百拇医药
病理组大鼠首先用N-BSA 1 mg加弗氏完全佐剂0.5 mL作皮下、肌肉多点注射，使之预免疫。2周后，参照Arisz方法每日尾静脉注射C-BSA[3]，第1周第1天至第7天剂量依次为1、2、3、4、5、6、7 mg/d，此后每日8 mg，直至第4周末实验结束。正常对照组大鼠正常饲养，不作任何处理。
1.2 观察内容及方法
尿蛋白测定：采用比浊法，于注射C-BSA后每周测定1次24 h尿蛋白含量。
形态学观察：2组大鼠于注射C-BSA 2、4周后分别杀死(每次每组各5只)，取肾皮质，分别进行免疫荧光观察(采用直接法，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠IgG抗体，军事医学科学院微生物流行病研究所提供)和透射电镜观察。
红细胞免疫功能测定：参照郭峰等的方法[4]，2组大鼠(各10只)分别于注射C-BSA 2、4周后心脏取血，肝素抗凝，分别测定红细胞C3b受体花环率(RBC C3b receptor rosette,RBC-C3bRR)和红细胞免疫复合物花环率(RBC immune complex rosette,RBC-ICR)，方法如下：
, 百拇医药
1)RBC-C3bRR试验：①酵母菌悬液制备：取致敏和未致敏酵母菌(上海第二军医大学长海医院免疫室提供)，分别用生理盐水溶解混匀，配成1×108mL-1的致敏和未致敏酵母菌悬液。②红细胞悬液制备：取肝素抗凝血0.1～0.5 mL，加入等量生理盐水稀释，用Ficoll分离液分离除去其他血细胞。取沉底红细胞，加适量生理盐水混匀，平均分成2管。其中1管红细胞不洗涤，配成1.25×107 mL-1的红细胞悬液备用，待作RBC-ICR。另1管红细胞用生理盐水洗涤3次，配成1.25×107 mL-1的红细胞悬液。③RBC-C3bRR试验：取洗涤3次的1.25×107 mL-1的红细胞悬液30 μL，加C3b致敏的1×108 mL-1的酵母菌悬液30 μL，在试管内充分混匀，37 ℃水浴30 min，加60 μL生理盐水混匀，加2～3滴0.25%戊二醛固定。取约1/3量涂片，吹干，用Giemsa染液染色，在高倍镜或者油镜下随机计数200个红细胞中的酵母花环数(以结合有2个以上酵母菌的红细胞为花环)，换算成百分率作为红细胞C3b受体活性的指标。
, http://www.100md.com
2)RBC-ICR试验：取未洗涤的1.25×107 mL-1的红细胞悬液30 μL，加未致敏的1×108 mL-1的酵母菌悬液30 μL，在试管内充分混匀，37 ℃水浴30 min，加60 μL生理盐水混匀。固定、涂片、染色、计数和换算同前项，其百分率作为红细胞膜上吸附免疫复合物量的指标。
2 结果
2.1 尿蛋白测定结果
注射C-BSA 1周后，病理组大部分大鼠出现蛋白尿，至第2周末，所有大鼠均出现较明显的蛋白尿〔(124.17±30.15) mg/d〕，第4周末时，尿蛋白为〔(221.04±38.81) mg/d〕。正常对照组大鼠尿蛋白定性为阴性，未作定量。
2.2 形态学观察
, 百拇医药
免疫荧光观察显示，注射C-BSA 2周后，病理组全部鼠肾标本均可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，4周后沉积的IgG呈粗颗粒状。正常对照组免疫荧光染色为阴性。透射电镜观察可见，注射C-BSA 2周后，病理组可见大量上皮下电子致密沉积物，肾小球毛细血管壁基底膜增厚，足突广泛融合，4周后沉积物融合成大片状，基底膜显著增厚，足突消失。
2.3 红细胞免疫功能测定结果
注射C-BSA 2、4周后，病理组RBC-C3bRR均显著低于正常对照组(P<0.05)。注射C-BSA 2周后，病理组RBC-ICR明显高于正常对照组(P<0.05)，第4周末病理组RBC-ICR虽然高于正常对照组，但无显著差异(P>0.05)，结果见表1。
表1 红细胞免疫功能测定结果* % 组 别
, 百拇医药 RBC-C3bRR
RBC-ICR
2周
4周
2周
4周
病理组
12.33±3.24
10.42±3.58
15.75±3.13
11.47±2.31
对照组
, http://www.100md.com
19.72±5.12
19.02±6.31
9.80±4.34
9.52±3.33
P
<0.05
<0.05
<0.05
>0.05
*实验中病理组2只大鼠死于超敏反应，故4周时动物数为8只，其余各组动物数均为10只
3 讨论
, 百拇医药 红细胞免疫功能的物质基础为其表面的C3b受体，亦称Ⅰ型补体受体(complement receptor type 1，CR1)。通过C3b受体，红细胞可以粘附经C3b调理的免疫复合物，促进免疫复合物清除[1，5]。还有研究表明，红细胞具有识别和粘附非己抗原的作用，红细胞与外来抗原发生免疫粘附后，可促进吞噬细胞对这些抗原物质的吞噬和清除[1，5]。
病理组RBC-C3bRR减少提示C3b受体活性降低。膜性肾炎的主要病变为上皮下免疫复合物,其机制有二：一是C-BSA与循环抗体结合形成循环免疫复合物，到达肾脏后又再分离，C-BSA穿透基底膜进入上皮下，再与循环抗体结合形成上皮下免疫复合物；二是游离状态的C-BSA直接进入上皮下，再与抗体结合形成上皮下免疫复合物[6]。因此，红细胞免疫功能的降低，可使以循环免疫复合物形式存在的C-BSA及游离状态的C-BSA清除减少，上皮下免疫复合物的形成增多。此外，C3b受体对补体系统的活化具有很强的抑制作用[7]。因此，病理组C3b受体活性降低还可使补体活化而致的肾脏损害加重，导致大量的蛋白尿。病理组第2周时RBC-ICR明显增多，提示血中存在大量免疫复合物，第4周时病理组RBC-ICR虽然也高于对照组，但经统计学处理无显著性差异，提示病理组C3b受体活性进一步下降，对免疫复合物的粘附明显减少。
, http://www.100md.com
参考文献
1.Siegel I, Liu T L, Gieicher N. The red-cell immune system. Lancet, 1981,2:556
2.郭峰.红细胞免疫研究概况.中华微生物学和免疫学杂志,1995,15:181
3.Arisz L, Noble B, Milgrom M, et al. Serum sickness glomerulonephritis in rats. Kidney Int, 1979,16:213
4.郭峰,虞紫茜,赵中平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志,1982,62:745
5.Schifferli J A, Ng Y C, Peters D K. The role of complement and its receptor in the elimination of immune complex. N Engl J Med,1986,315:488
, 百拇医药
6.Vogt A. New aspects of pathogenesis of immune complex glomerulonephritis: Formation of sube-pithelial deposits. Clin Nephrol,1984,21:15
7.Medof M E, Iida K, Mold C, et al. Unique role for the complement receptor CR1 in the degradation of C3b associated with immune complex. J Exp Med,1982,156:1739
收稿日期：1998-05-16, http://www.100md.com
单位：武宝玉 袁申元 首都医科大学附属北京同仁医院内科；魏民 李伯光 北京中医药大学病理学教研室
关键词：膜性肾小球肾炎；红细胞；免疫功能
首都医科大学学报/990308 提要： 对实验性膜性肾小球肾炎大鼠红细胞C3b受体花环率和红细胞免疫复合物花环率进行检测。发现：膜性肾小球肾炎大鼠C3b受体活性明显降低。结果提示红细胞免疫功能异常可能与膜性肾小球肾炎的发病有关。
中图分类号： R692.31
A Preliminary Study on RBC Immune Function in Rats with Experimental
, 百拇医药
Membranous Glomerulonephritis
Wu Baoyu, Yuan Shenyuan
Department of Internal Medicine, Beijing Tongren Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Wei Min, Li Boguang
Department of Pathology, Beijing University of Traditional Chinese Medicine
Abstract: The RBC C3b receptor rosette (RBC-C3bRR) and RBC immune complex rosette(RBC-ICR) in rats with experimental membranous glomerulonephritis were studied. It was found that there was significant reduction of activity of the RBC C3b receptor in rats with membranous glomerulonephritis as compared with the control group. The results showed that the disturbance of RBC immune function might be related to the pathogenesis of membranous glomerulonephritis.
, 百拇医药
Key words: membranous glomerulonephritis; red blood cell; immune function The RBC C3b receptor rosette (RBC-C3bRR) and RBC immune complex rosette(RBC-ICR) in rats with experimental membranous glomerulonephritis were studied. It was found that there was significant reduction of activity of the RBC C3b receptor in rats with membranous glomerulonephritis as compared with the control group. The results showed that the disturbance of RBC immune function might be related to the pathogenesis of membranous glomerulonephritis.
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Key words: membranous glomerulonephritis; red blood cell; immune function
1981年，Siegel等提出了“红细胞免疫系统”的新概念[1]，引起国内外学者的广泛重视。红细胞免疫功能有多种表现，其中最为突出的是对血中免疫复合物及外来抗原的清除作用[2]。除了已广泛研究的体液免疫和细胞免疫(即白细胞免疫系统)外，红细胞免疫与膜性肾小球肾炎(以下简称膜性肾炎)的关系如何， 目前尚未见报道。本研究用阳离子化牛血清白蛋白复制大鼠膜性肾炎病理模型，并对其红细胞免疫功能进行初步研究。
1 材料和方法
1.1 大鼠膜性肾炎病理模型的复制
用化学方法提高天然牛血清白蛋白(N-BSA，电泳纯)的等电点，使之大于9.0，制成阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。实验动物为健康雄性SD大鼠(北京医科大学动物室提供)，体质量160～200 g，随机分为病理组和正常对照组。
, 百拇医药
病理组大鼠首先用N-BSA 1 mg加弗氏完全佐剂0.5 mL作皮下、肌肉多点注射，使之预免疫。2周后，参照Arisz方法每日尾静脉注射C-BSA[3]，第1周第1天至第7天剂量依次为1、2、3、4、5、6、7 mg/d，此后每日8 mg，直至第4周末实验结束。正常对照组大鼠正常饲养，不作任何处理。
1.2 观察内容及方法
尿蛋白测定：采用比浊法，于注射C-BSA后每周测定1次24 h尿蛋白含量。
形态学观察：2组大鼠于注射C-BSA 2、4周后分别杀死(每次每组各5只)，取肾皮质，分别进行免疫荧光观察(采用直接法，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的抗大鼠IgG抗体，军事医学科学院微生物流行病研究所提供)和透射电镜观察。
红细胞免疫功能测定：参照郭峰等的方法[4]，2组大鼠(各10只)分别于注射C-BSA 2、4周后心脏取血，肝素抗凝，分别测定红细胞C3b受体花环率(RBC C3b receptor rosette,RBC-C3bRR)和红细胞免疫复合物花环率(RBC immune complex rosette,RBC-ICR)，方法如下：
, 百拇医药
1)RBC-C3bRR试验：①酵母菌悬液制备：取致敏和未致敏酵母菌(上海第二军医大学长海医院免疫室提供)，分别用生理盐水溶解混匀，配成1×108mL-1的致敏和未致敏酵母菌悬液。②红细胞悬液制备：取肝素抗凝血0.1～0.5 mL，加入等量生理盐水稀释，用Ficoll分离液分离除去其他血细胞。取沉底红细胞，加适量生理盐水混匀，平均分成2管。其中1管红细胞不洗涤，配成1.25×107 mL-1的红细胞悬液备用，待作RBC-ICR。另1管红细胞用生理盐水洗涤3次，配成1.25×107 mL-1的红细胞悬液。③RBC-C3bRR试验：取洗涤3次的1.25×107 mL-1的红细胞悬液30 μL，加C3b致敏的1×108 mL-1的酵母菌悬液30 μL，在试管内充分混匀，37 ℃水浴30 min，加60 μL生理盐水混匀，加2～3滴0.25%戊二醛固定。取约1/3量涂片，吹干，用Giemsa染液染色，在高倍镜或者油镜下随机计数200个红细胞中的酵母花环数(以结合有2个以上酵母菌的红细胞为花环)，换算成百分率作为红细胞C3b受体活性的指标。
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2)RBC-ICR试验：取未洗涤的1.25×107 mL-1的红细胞悬液30 μL，加未致敏的1×108 mL-1的酵母菌悬液30 μL，在试管内充分混匀，37 ℃水浴30 min，加60 μL生理盐水混匀。固定、涂片、染色、计数和换算同前项，其百分率作为红细胞膜上吸附免疫复合物量的指标。
2 结果
2.1 尿蛋白测定结果
注射C-BSA 1周后，病理组大部分大鼠出现蛋白尿，至第2周末，所有大鼠均出现较明显的蛋白尿〔(124.17±30.15) mg/d〕，第4周末时，尿蛋白为〔(221.04±38.81) mg/d〕。正常对照组大鼠尿蛋白定性为阴性，未作定量。
2.2 形态学观察
, 百拇医药
免疫荧光观察显示，注射C-BSA 2周后，病理组全部鼠肾标本均可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，4周后沉积的IgG呈粗颗粒状。正常对照组免疫荧光染色为阴性。透射电镜观察可见，注射C-BSA 2周后，病理组可见大量上皮下电子致密沉积物，肾小球毛细血管壁基底膜增厚，足突广泛融合，4周后沉积物融合成大片状，基底膜显著增厚，足突消失。
2.3 红细胞免疫功能测定结果
注射C-BSA 2、4周后，病理组RBC-C3bRR均显著低于正常对照组(P<0.05)。注射C-BSA 2周后，病理组RBC-ICR明显高于正常对照组(P<0.05)，第4周末病理组RBC-ICR虽然高于正常对照组，但无显著差异(P>0.05)，结果见表1。
表1 红细胞免疫功能测定结果* % 组 别
, 百拇医药 RBC-C3bRR
RBC-ICR
2周
4周
2周
4周
病理组
12.33±3.24
10.42±3.58
15.75±3.13
11.47±2.31
对照组
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19.72±5.12
19.02±6.31
9.80±4.34
9.52±3.33
P
<0.05
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*实验中病理组2只大鼠死于超敏反应，故4周时动物数为8只，其余各组动物数均为10只
3 讨论
, 百拇医药 红细胞免疫功能的物质基础为其表面的C3b受体，亦称Ⅰ型补体受体(complement receptor type 1，CR1)。通过C3b受体，红细胞可以粘附经C3b调理的免疫复合物，促进免疫复合物清除[1，5]。还有研究表明，红细胞具有识别和粘附非己抗原的作用，红细胞与外来抗原发生免疫粘附后，可促进吞噬细胞对这些抗原物质的吞噬和清除[1，5]。
病理组RBC-C3bRR减少提示C3b受体活性降低。膜性肾炎的主要病变为上皮下免疫复合物,其机制有二：一是C-BSA与循环抗体结合形成循环免疫复合物，到达肾脏后又再分离，C-BSA穿透基底膜进入上皮下，再与循环抗体结合形成上皮下免疫复合物；二是游离状态的C-BSA直接进入上皮下，再与抗体结合形成上皮下免疫复合物[6]。因此，红细胞免疫功能的降低，可使以循环免疫复合物形式存在的C-BSA及游离状态的C-BSA清除减少，上皮下免疫复合物的形成增多。此外，C3b受体对补体系统的活化具有很强的抑制作用[7]。因此，病理组C3b受体活性降低还可使补体活化而致的肾脏损害加重，导致大量的蛋白尿。病理组第2周时RBC-ICR明显增多，提示血中存在大量免疫复合物，第4周时病理组RBC-ICR虽然也高于对照组，但经统计学处理无显著性差异，提示病理组C3b受体活性进一步下降，对免疫复合物的粘附明显减少。
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参考文献
1.Siegel I, Liu T L, Gieicher N. The red-cell immune system. Lancet, 1981,2:556
2.郭峰.红细胞免疫研究概况.中华微生物学和免疫学杂志,1995,15:181
3.Arisz L, Noble B, Milgrom M, et al. Serum sickness glomerulonephritis in rats. Kidney Int, 1979,16:213
4.郭峰,虞紫茜,赵中平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志,1982,62:745
5.Schifferli J A, Ng Y C, Peters D K. The role of complement and its receptor in the elimination of immune complex. N Engl J Med,1986,315:488
, 百拇医药
6.Vogt A. New aspects of pathogenesis of immune complex glomerulonephritis: Formation of sube-pithelial deposits. Clin Nephrol,1984,21:15
7.Medof M E, Iida K, Mold C, et al. Unique role for the complement receptor CR1 in the degradation of C3b associated with immune complex. J Exp Med,1982,156:1739
收稿日期：1998-05-16, http://www.100md.com