一种新的钠-钙交换电流记录方法及阿米洛利的作用
作者：梁 勇 张雅兰 王晓良
单位：梁 勇， 张雅兰， 王晓良(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所， 北京 100050
关键词：
药学学报990307 A NOVEL METHOD OF RECORDING Na+-Ca2+ EXCHANGE CURRENT
AND EFFECT OF AMILORIDE ON THE CURRENT
IN GUINEA PIG VENTRICULAR MYOCYTES
Liang Yong(Liang Y), Zhang Yalan(Zhang YL) and Wang Xiaoliang(Wang XL)
, 百拇医药
(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To study the effects of various extracellular Ca2+ concentration and amiloride on Na+-Ca2+ exchange current(INa-Ca) in guinea pig ventricular myocytes. METHODS: Through setting up the model of intracellular Na+-overload during myocardial ischemia and reperfusion, the current-voltage relationship of INa-Ca was recorded using whole-cell patch clamp technique with a declining ramp pulse protocol. RESULTS: Amiloride can block the INa-Ca significantly. At potential of +50 mV, amiloride 10-5, 3×10-5 and 10-4 mol.L-1 inhibited the INa-Ca by 15.4%, 22.6% and 40.9%, respectively; at potential of -80 mV amiloride inhibited INa-Ca by 5.6%, 14.6% and 23.2%, respectively. CONCLUSION: Intracellular Na+-overload can activate Na+-Ca2+ exchange system which can be affected by extracellular Ca2+. Amiloride can block INa-Ca in guinea pig ventricular myocytes. Its inhibition effects on outward currents were greater than those on inward currents.
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KEY WORDS Na+-Ca2+ exchange current; amiloride; ventricular myocytes; whole-cell patch clamp technique
摘要 目的：研究胞外不同Ca2+浓度对豚鼠心室肌细胞钠-钙交换电流(Na+-Ca2+ exchange current， INa-Ca)的影响和阿米洛利(amiloride)对该电流的作用。方法：建立缺血再灌时胞内Na+超载的细胞模型，用膜片钳全细胞技术，记录INa-Ca的电流-电压关系曲线。结果：阿米洛利10-5，3×10-5和10-4 mol.L-1，在+50 mV时，对INa-Ca的抑制率分别是15.4%，22.6%和40.9%；在-80 mV时抑制率分别是5.6%，14.6%和23.2%。结论：胞内Na+超载确可引起Na+-Ca2+交换系统激活；阿米洛利对豚鼠心室肌细胞INa-Ca有抑制作用，且对INa-Ca外向成分的抑制作用大于对内向成分的抑制作用。
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关键词 Na+-Ca2+交换电流； 阿米洛利； 心室肌细胞； 膜片钳
Na+-Ca2+交换系统作为调节细胞钙转运的重要机制之一已经受到广泛的重视。胞内Ca2+作为重要的第二信使存在于许多细胞中，而这些细胞上都有大量的Na+-Ca2+交换体，尤以哺乳动物心肌细胞中含量最多，平均约有250个交换体(μm2)-1，转换率达2500次.s-1[1]。心肌细胞通过Na+-Ca2+交换可以排出由于Ca2+通道开放进入细胞的大量Ca2+，调节胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)；通过Na+-Ca2+交换反向转运进入细胞的少量的Ca2+，可以触发肌浆网释放大量Ca2+(即钙诱导的钙释放，CICR)，产生兴奋-收缩藕联[2]；以3Na+∶1Ca2+进行交换的Na+-Ca2+交换体可以产生Na+-Ca2+交换电流(INa-Ca)，INa-Ca与心肌细胞动作电位的形成和心律失常的产生有关[3]。
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在心肌缺血再灌注损伤中，INa-Ca有至关重要的作用。有关心肌缺血再灌损伤的发生机制有很多假说，但都离不开胞内Ca2+超载这一重要环节，而在缺血再灌时，外向的INa-Ca与胞内Ca2+超载的关系密不可分。长期以来，由于缺乏有效的能直接记录到类似缺血再灌时明显增大的外向INa-Ca的方法，临床上至今还没有一种能有效地作用于外向INa-Ca的药物。本实验，通过增加电极内液中Na+浓度，建立缺血再灌时胞内Na+超载的细胞模型，研究胞内Na+超载引起的INa-Ca的改变。同时，我们还观察了胞外不同Ca2+浓度和Na+-H+交换抑制剂阿米洛利(amiloride) 对豚鼠心室肌细胞INa-Ca的作用。
材料与方法
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细胞制备 ♂豚鼠，体重250～280 g，击昏、颈动脉放血后，迅速开胸，取出心脏，在4℃无钙液中去除脂肪及心包膜，进行Langendorff灌流。用无钙液经主动脉逆行灌流6 min，再用含链霉蛋白酶E(pronase, E.Merck) 0.1 mg.ml-1，牛血清白蛋白(BSA，Sigma) 0.5 mg.ml-1，[Ca2+]为0.15 mmol*L-1的无钙液灌流2 min。整个灌流过程中压力维持在约70 cm水柱，37℃恒温，持续通95% O2和5% CO2混合气。将心室肌剪碎，用酶液37℃温孵搅拌5～10 min，倒出上清液，用无钙液稀释5倍，其中含BSA 0.5 mg.ml-1，[Ca2+]为1.8 mmol.L-1，室温下静置1 h备用。
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药品与溶液 阿米洛利(amiloride)、氯化镍(NiCl2)、氯化铯(CsCl)、氢氧化铯(CsOH)、维拉帕米(verapamil)、氯化钡(BaCl2)、氯化钙(CaCl2)、哇巴因(ouabain)、牛磺酸(taurine)，均为美国Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。无钙液成分(mmol.L-1)： NaCl 90， KCl 10， KH2PO4 1.2， MgSO4 5，NaHCO3 15，taurine 30，glucose 20，pH 7.4；台氏液成分(mmol*L-1)： NaCl 140， MgCl2 2.0， Hepes 5， glucose 10， CaCl2 1.8，用CsOH调至pH 7.4；记录电流的电极内液(mmol.L-1)： NaCl 15， EGTA 42， CaCl2 29，MgCl2 13， Aspartic acid 42， TEA 20， Hepes 5， Na2ATP 5，用CsOH调至pH 7.4。为了减少其它电流成分的干扰，实验时细胞外液中加入： ouabain 20 μmol.L-1阻断Na+-K+泵，BaCl2 1 mmol.L-1和CsCl 2 mmol.L-1阻断钾通道，verapamil 1 μmol.L-1阻断L-型钙通道。电极内液中20 mmol.L-1的TEA可以阻断钾通道；高浓度的EGTA和CaCl2根据Fabiato & Fabiato公式计算得游离Ca2+浓度为153 nmol.L-1[4]。
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全细胞记录 选取横纹清晰、膜良好的细胞进行实验。细胞池体积约1 ml，平放在连有微操纵器(MO-303，Narishige Co.，Japan) 的倒置显微镜(Olympus IMT-2，Japan)上，取几滴细胞悬液加入细胞池中，静置5 min使细胞充分贴壁后，用台氏液灌流，速度约为1～2 ml.min-1。电极用玻璃毛细管(中国科学院上海脑研究所)经微电极拉制仪(PB-7 Narishige Co.，Japan) 分两步拉制，充灌电极液后电阻为1～3 MΩ。全细胞记录过程中，刺激脉冲的产生和信号采集均由pCLAMP 5.5.1软件(Axon Instrument，USA) 完成，离子电流通过膜片钳放大器(L/M EPC-7, Germany)放大，经AD/DA转换板(Axon TL-1，USA)输入IBM-PC机硬盘中。记录INa-Ca时，细胞钳制在-40 mV，给予从+60 mV复极化至-100 mV、速度为80 mV.s-1持续2 s的斜坡脉冲。所有实验均在32～35℃下进行。
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数据分析与统计 电流的测量分析用pCLAMP 5.5.1 和pCLAMP 6.0.1软件，所有数据均为平均数±S；配对和非配对t检验，P<0.05认为差异有显著性。
结果
1 钠-钙交换电流的记录
细胞钳制在-40 mV，先去极化至+60 mV，再给以持续2 s速度为80 mV.s-1的斜坡刺激，复极化至-100 mV，频率为0.05 Hz。在该刺激条件下，用正常台氏液灌流时，记录到一个由外向到内向的电流，由于其它时间依赖性的电流都被阻断，因此记录到的电流几乎呈线性，该电流可被5 mmol.L-1 Ni2+阻断。如图1所示，用Ni2+前后记录到的电流相减，即Na+-Ca2+交换电流(INa-Ca)[1,4,5]。由于Na+和Ca2+的交换比是3∶1，因此，以Na+的转运方向作为INa-Ca的方向。INa-Ca的反转电位在-20 mV左右，当膜电位大于反转电位，该电流为外向，即胞内Na+与胞外Ca2+之间进行交换，结果造成胞内Ca2+浓度增加；当膜电位小于反转电位时，该电流为内向，即胞外Na+与胞内Ca2+之间交换，使胞内Ca2+排出，细胞内Ca2+浓度降低。
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Fig 1 Na+-Ca2+ exchange currents in guinea pig ventricular myocytes. Currents were elicited by a declining ramp pulse depolarized immediately from holding potential of -40 mV to 60 mV, then repolarized to -100 mV at a speed of 80 mV.s-1 and returned to the holding potential. A: Currents before Ni2+ 5 mmol*L-1; B: Currents after Ni2+ 5 mmol.L-1; A-B: Na+-Ca2+ exchange current.
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2 胞外钙对Na+-Ca2+交换电流的作用
分别用3种不同Ca2+浓度的台氏液灌流细胞，观察胞外Ca2+对INa-Ca的影响。胞外Ca2+浓度([Ca2+]o) 从1.0 mmol.L-1增加到1.8和3.6 mmol.L-1时，INa-Ca的外向和内向成分都明显增加(图2)。在+50 mV和-80 mV时，INa-Ca分别从1.0 mmol.L-1时的1.50±0.12 pA.pF-1，-0.69±0.09 pA.pF-1到1.8 mmol.L-1时的2.07±0.16 pA.pF-1(P<0.01, n=5)，-1.17±0.19 pA.pF-1(P<0.05, n=5)和3.6 mmol.L-1时的2.84±0.14 pA.pF-1(P<0.001, n=11)，-2.02±0.18 pA.pF-1(P<0.001, n=11)。
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Fig 2 Original Na+-Ca2+ exchange currents at various external Ca2+ concentration. A,B,C,D: represent [Ca2+]o 1.0, 1.8, 3.6 and 0 mmol.L-1, respectively; A-D, B-D, C-D represent Na+-Ca2+ exchange current at three different [Ca2+]o.
3 阿米洛利对Na+-Ca2+交换电流的抑制作用
当电极内液中Na+的浓度为25 mmol.L-1时，形成全细胞记录后电极内液与细胞内液发生离子交换，电极内液中的Na+进入细胞内，使胞内形成高Na+状态。胞内Na+增加，可激活Na+-Ca2+交换体的反向转运方式，使INa-Ca的外向成分显著增加，于3 min左右达到最大，持续较长时间。+50 mV时，外向INa-Ca由刚破膜时的(2.31±0.24) pA.pF-1增大到(5.38±0.37) pA.pF-1(P<0.001，n=14)； -80 mV时，内向INa-Ca由-0.51±0.13增大到-1.80±0.20(P<0.001，n=14) 。此时在灌流液中分别加入阿米洛利10-5，3×10-5和10-4 mol.L-1，INa-Ca逐渐减小，结果见表1。在+50 mV时，阿米洛利对INa-Ca的抑制率分别是15.4%，22.6%和40.9%； -80 mV时分别是5.6%，14.6%和23.2%。
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Tab 1 The inhibitory effects of amiloride on INa-Ca measured at +50 mV and -80 mV in guinea pig ventricular myocytes. All data are means±SE(n=4～11) Amiloride
/mol.L-1
Na+-Ca2+ exchange current/pA.pF-1
+50 mV
-80 mV
Control
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5.38±0.37
-1.80±0.22
10-5
4.55±0.57
-1.70±0.10
3×10-5
4.16±0.48*
-1.54±0.36
10-4
3.18±0.28**
-1.38±0.24
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*P<0.05, **P<0.01 compared with control.讨论
本实验用来测量Na+-Ca2+交换电流方法的优越性在于：电极内液用高浓度的Ca2+缓冲剂EGTA来防止胞内游离Ca2+浓度的增加，使之维持在153 nmol.L-1的水平。通过使用各种特异性通道阻断剂，排除其它膜电流对INa-Ca的干扰，使记录到的INa-Ca的电流-电压关系曲线呈线性[5]。
实验中，通过改变[Ca2+]o和[Na+]i，证明胞外[Ca2+]和胞内[Na+]的增加都可使INa-Ca增大，胞外无Ca2+或胞内无Na+条件下，均记录不到INa-Ca，与文献报道[6]一致。
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在正常状态下，INa-Ca以内向为主，是胞内Ca2+排出，维持[Ca2+]i的重要机制之一。心肌缺血时，胞内H+增加，通过Na+-H+交换使胞内Na+增加，而此时由于能量供应不足，Na+-K+泵活性降低，胞内Na+不能充分泵到胞外，发生胞内Na+超载，高浓度的Na+激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换体；此时若发生再灌注，能量恢复，Na+便从胞内向胞外转移，与此同时通过Na+-Ca2+交换机制，Ca2+便从胞外向胞内转移发生Ca2+超载，从而引起一系列病理生理损伤，甚至细胞死亡。
本实验电极内液用高浓度Na+，通过离子扩散使胞内形成高Na+状态，模拟缺血-再灌时的胞内Na+超载。胞内Na+增加可激活Na+-Ca2+交换体的反向转运机制，使胞内Na+与胞外Ca2+发生交换，INa-Ca的外向成分显著增加；同时胞内Ca2+浓度也相应增加，导致胞内Ca2+超载。由此可以推测，Na+-Ca2+交换体的反向转运可能是心肌缺血再灌注损伤中形成Ca2+超载的机制之一。阿米洛利是较强的Na+-H+交换抑制剂，已有研究显示，阿米洛利对INa-Ca有抑制作用[7]。在本实验条件下发现它对INa-Ca的外向成分有明显的抑制作用，即抑制胞内Na+与胞外Ca2+之间的交换，防止胞内Ca2+超载，起到心肌保护的作用。实验中已形成胞内高Na+状态，INa-Ca的外向成分显著增加，此时阿米洛利对INa-Ca的抑制可能是它的直接作用，而不是通过抑制Na+-H+交换，减轻胞内Na+超载，间接抑制Na+-Ca2+交换体的反向转运。但是，阿米洛利可以通过对INa-Ca的直接和间接作用，促进心肌缺血后功能的恢复。由于缺少特异性的Na+-Ca2+交换和Na+-H+交换抑制剂，二者之间的关系有待进一步实验证明。
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我们在实验中，通过增加电极内液中Na+的浓度，使胞内形成高Na+状态，而显著增加外向INa-Ca的方法，为寻找能特异地作用于外向INa-Ca，防止心肌缺血再灌时的Ca2+超载，开发具有心肌保护作用的新型药物，提供了一种新的方法和手段。
基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(39425014)
联系人 Tel:(010)63165193, Fax:(010)63017757,E-mail:wangxie@public.bta.net.cn)
参考文献
1 Niggli E, Lederer WJ. Molecular operation of the sodium-calcium exchanger revealed by conformation currents. Nature, 1991,349∶621
, 百拇医药
2 Lipp P, Niggli E. Sodium-current induced calcium signals in isolated guinea pig ventricular myocytes. J Physiol, 1994,474∶439
3 Benardeau A, Hatem SN, Martin CR, et al. Contribution of Na+/Ca2+ exchange to action potential of human atrial myocytes. Am J Physiol, 1996,271∶H1151
4 Ehara T, Matsuoka S, Noma A, Measurement of reversal potential of Na+-Ca2+ exchange current in guinea-pig ventricular cells. J Physiol, 1989,410∶227
, 百拇医药
5 Kimura J, Miyamae S, Noma A. Identification of sodium-calcium exchange current in single ventricular cells of guinea-pig. J Physiol, 1987,384∶199
6 Kimura J, Noma A, Irisawa H. Na-Ca exchange current in mammalian heart cells. Nature, 1986,319∶596
7 Doering AE, Lederer WJ. The mechanism by which cytoplasmic protons inhibit the sodium-calcium exchanger in guinea-pig heart cells. J Physiol, 1993,466∶481
收稿日期: 1998-07-16, 百拇医药
单位：梁 勇， 张雅兰， 王晓良(中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所， 北京 100050
关键词：
药学学报990307 A NOVEL METHOD OF RECORDING Na+-Ca2+ EXCHANGE CURRENT
AND EFFECT OF AMILORIDE ON THE CURRENT
IN GUINEA PIG VENTRICULAR MYOCYTES
Liang Yong(Liang Y), Zhang Yalan(Zhang YL) and Wang Xiaoliang(Wang XL)
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(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and
Peking Union Medical College, Beijing 100050)
ABSTRACT AIM: To study the effects of various extracellular Ca2+ concentration and amiloride on Na+-Ca2+ exchange current(INa-Ca) in guinea pig ventricular myocytes. METHODS: Through setting up the model of intracellular Na+-overload during myocardial ischemia and reperfusion, the current-voltage relationship of INa-Ca was recorded using whole-cell patch clamp technique with a declining ramp pulse protocol. RESULTS: Amiloride can block the INa-Ca significantly. At potential of +50 mV, amiloride 10-5, 3×10-5 and 10-4 mol.L-1 inhibited the INa-Ca by 15.4%, 22.6% and 40.9%, respectively; at potential of -80 mV amiloride inhibited INa-Ca by 5.6%, 14.6% and 23.2%, respectively. CONCLUSION: Intracellular Na+-overload can activate Na+-Ca2+ exchange system which can be affected by extracellular Ca2+. Amiloride can block INa-Ca in guinea pig ventricular myocytes. Its inhibition effects on outward currents were greater than those on inward currents.
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KEY WORDS Na+-Ca2+ exchange current; amiloride; ventricular myocytes; whole-cell patch clamp technique
摘要 目的：研究胞外不同Ca2+浓度对豚鼠心室肌细胞钠-钙交换电流(Na+-Ca2+ exchange current， INa-Ca)的影响和阿米洛利(amiloride)对该电流的作用。方法：建立缺血再灌时胞内Na+超载的细胞模型，用膜片钳全细胞技术，记录INa-Ca的电流-电压关系曲线。结果：阿米洛利10-5，3×10-5和10-4 mol.L-1，在+50 mV时，对INa-Ca的抑制率分别是15.4%，22.6%和40.9%；在-80 mV时抑制率分别是5.6%，14.6%和23.2%。结论：胞内Na+超载确可引起Na+-Ca2+交换系统激活；阿米洛利对豚鼠心室肌细胞INa-Ca有抑制作用，且对INa-Ca外向成分的抑制作用大于对内向成分的抑制作用。
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关键词 Na+-Ca2+交换电流； 阿米洛利； 心室肌细胞； 膜片钳
Na+-Ca2+交换系统作为调节细胞钙转运的重要机制之一已经受到广泛的重视。胞内Ca2+作为重要的第二信使存在于许多细胞中，而这些细胞上都有大量的Na+-Ca2+交换体，尤以哺乳动物心肌细胞中含量最多，平均约有250个交换体(μm2)-1，转换率达2500次.s-1[1]。心肌细胞通过Na+-Ca2+交换可以排出由于Ca2+通道开放进入细胞的大量Ca2+，调节胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)；通过Na+-Ca2+交换反向转运进入细胞的少量的Ca2+，可以触发肌浆网释放大量Ca2+(即钙诱导的钙释放，CICR)，产生兴奋-收缩藕联[2]；以3Na+∶1Ca2+进行交换的Na+-Ca2+交换体可以产生Na+-Ca2+交换电流(INa-Ca)，INa-Ca与心肌细胞动作电位的形成和心律失常的产生有关[3]。
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在心肌缺血再灌注损伤中，INa-Ca有至关重要的作用。有关心肌缺血再灌损伤的发生机制有很多假说，但都离不开胞内Ca2+超载这一重要环节，而在缺血再灌时，外向的INa-Ca与胞内Ca2+超载的关系密不可分。长期以来，由于缺乏有效的能直接记录到类似缺血再灌时明显增大的外向INa-Ca的方法，临床上至今还没有一种能有效地作用于外向INa-Ca的药物。本实验，通过增加电极内液中Na+浓度，建立缺血再灌时胞内Na+超载的细胞模型，研究胞内Na+超载引起的INa-Ca的改变。同时，我们还观察了胞外不同Ca2+浓度和Na+-H+交换抑制剂阿米洛利(amiloride) 对豚鼠心室肌细胞INa-Ca的作用。
材料与方法
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细胞制备 ♂豚鼠，体重250～280 g，击昏、颈动脉放血后，迅速开胸，取出心脏，在4℃无钙液中去除脂肪及心包膜，进行Langendorff灌流。用无钙液经主动脉逆行灌流6 min，再用含链霉蛋白酶E(pronase, E.Merck) 0.1 mg.ml-1，牛血清白蛋白(BSA，Sigma) 0.5 mg.ml-1，[Ca2+]为0.15 mmol*L-1的无钙液灌流2 min。整个灌流过程中压力维持在约70 cm水柱，37℃恒温，持续通95% O2和5% CO2混合气。将心室肌剪碎，用酶液37℃温孵搅拌5～10 min，倒出上清液，用无钙液稀释5倍，其中含BSA 0.5 mg.ml-1，[Ca2+]为1.8 mmol.L-1，室温下静置1 h备用。
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药品与溶液 阿米洛利(amiloride)、氯化镍(NiCl2)、氯化铯(CsCl)、氢氧化铯(CsOH)、维拉帕米(verapamil)、氯化钡(BaCl2)、氯化钙(CaCl2)、哇巴因(ouabain)、牛磺酸(taurine)，均为美国Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。无钙液成分(mmol.L-1)： NaCl 90， KCl 10， KH2PO4 1.2， MgSO4 5，NaHCO3 15，taurine 30，glucose 20，pH 7.4；台氏液成分(mmol*L-1)： NaCl 140， MgCl2 2.0， Hepes 5， glucose 10， CaCl2 1.8，用CsOH调至pH 7.4；记录电流的电极内液(mmol.L-1)： NaCl 15， EGTA 42， CaCl2 29，MgCl2 13， Aspartic acid 42， TEA 20， Hepes 5， Na2ATP 5，用CsOH调至pH 7.4。为了减少其它电流成分的干扰，实验时细胞外液中加入： ouabain 20 μmol.L-1阻断Na+-K+泵，BaCl2 1 mmol.L-1和CsCl 2 mmol.L-1阻断钾通道，verapamil 1 μmol.L-1阻断L-型钙通道。电极内液中20 mmol.L-1的TEA可以阻断钾通道；高浓度的EGTA和CaCl2根据Fabiato & Fabiato公式计算得游离Ca2+浓度为153 nmol.L-1[4]。
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全细胞记录 选取横纹清晰、膜良好的细胞进行实验。细胞池体积约1 ml，平放在连有微操纵器(MO-303，Narishige Co.，Japan) 的倒置显微镜(Olympus IMT-2，Japan)上，取几滴细胞悬液加入细胞池中，静置5 min使细胞充分贴壁后，用台氏液灌流，速度约为1～2 ml.min-1。电极用玻璃毛细管(中国科学院上海脑研究所)经微电极拉制仪(PB-7 Narishige Co.，Japan) 分两步拉制，充灌电极液后电阻为1～3 MΩ。全细胞记录过程中，刺激脉冲的产生和信号采集均由pCLAMP 5.5.1软件(Axon Instrument，USA) 完成，离子电流通过膜片钳放大器(L/M EPC-7, Germany)放大，经AD/DA转换板(Axon TL-1，USA)输入IBM-PC机硬盘中。记录INa-Ca时，细胞钳制在-40 mV，给予从+60 mV复极化至-100 mV、速度为80 mV.s-1持续2 s的斜坡脉冲。所有实验均在32～35℃下进行。
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数据分析与统计 电流的测量分析用pCLAMP 5.5.1 和pCLAMP 6.0.1软件，所有数据均为平均数±S；配对和非配对t检验，P<0.05认为差异有显著性。
结果
1 钠-钙交换电流的记录
细胞钳制在-40 mV，先去极化至+60 mV，再给以持续2 s速度为80 mV.s-1的斜坡刺激，复极化至-100 mV，频率为0.05 Hz。在该刺激条件下，用正常台氏液灌流时，记录到一个由外向到内向的电流，由于其它时间依赖性的电流都被阻断，因此记录到的电流几乎呈线性，该电流可被5 mmol.L-1 Ni2+阻断。如图1所示，用Ni2+前后记录到的电流相减，即Na+-Ca2+交换电流(INa-Ca)[1,4,5]。由于Na+和Ca2+的交换比是3∶1，因此，以Na+的转运方向作为INa-Ca的方向。INa-Ca的反转电位在-20 mV左右，当膜电位大于反转电位，该电流为外向，即胞内Na+与胞外Ca2+之间进行交换，结果造成胞内Ca2+浓度增加；当膜电位小于反转电位时，该电流为内向，即胞外Na+与胞内Ca2+之间交换，使胞内Ca2+排出，细胞内Ca2+浓度降低。
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Fig 1 Na+-Ca2+ exchange currents in guinea pig ventricular myocytes. Currents were elicited by a declining ramp pulse depolarized immediately from holding potential of -40 mV to 60 mV, then repolarized to -100 mV at a speed of 80 mV.s-1 and returned to the holding potential. A: Currents before Ni2+ 5 mmol*L-1; B: Currents after Ni2+ 5 mmol.L-1; A-B: Na+-Ca2+ exchange current.
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2 胞外钙对Na+-Ca2+交换电流的作用
分别用3种不同Ca2+浓度的台氏液灌流细胞，观察胞外Ca2+对INa-Ca的影响。胞外Ca2+浓度([Ca2+]o) 从1.0 mmol.L-1增加到1.8和3.6 mmol.L-1时，INa-Ca的外向和内向成分都明显增加(图2)。在+50 mV和-80 mV时，INa-Ca分别从1.0 mmol.L-1时的1.50±0.12 pA.pF-1，-0.69±0.09 pA.pF-1到1.8 mmol.L-1时的2.07±0.16 pA.pF-1(P<0.01, n=5)，-1.17±0.19 pA.pF-1(P<0.05, n=5)和3.6 mmol.L-1时的2.84±0.14 pA.pF-1(P<0.001, n=11)，-2.02±0.18 pA.pF-1(P<0.001, n=11)。
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Fig 2 Original Na+-Ca2+ exchange currents at various external Ca2+ concentration. A,B,C,D: represent [Ca2+]o 1.0, 1.8, 3.6 and 0 mmol.L-1, respectively; A-D, B-D, C-D represent Na+-Ca2+ exchange current at three different [Ca2+]o.
3 阿米洛利对Na+-Ca2+交换电流的抑制作用
当电极内液中Na+的浓度为25 mmol.L-1时，形成全细胞记录后电极内液与细胞内液发生离子交换，电极内液中的Na+进入细胞内，使胞内形成高Na+状态。胞内Na+增加，可激活Na+-Ca2+交换体的反向转运方式，使INa-Ca的外向成分显著增加，于3 min左右达到最大，持续较长时间。+50 mV时，外向INa-Ca由刚破膜时的(2.31±0.24) pA.pF-1增大到(5.38±0.37) pA.pF-1(P<0.001，n=14)； -80 mV时，内向INa-Ca由-0.51±0.13增大到-1.80±0.20(P<0.001，n=14) 。此时在灌流液中分别加入阿米洛利10-5，3×10-5和10-4 mol.L-1，INa-Ca逐渐减小，结果见表1。在+50 mV时，阿米洛利对INa-Ca的抑制率分别是15.4%，22.6%和40.9%； -80 mV时分别是5.6%，14.6%和23.2%。
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Tab 1 The inhibitory effects of amiloride on INa-Ca measured at +50 mV and -80 mV in guinea pig ventricular myocytes. All data are means±SE(n=4～11) Amiloride
/mol.L-1
Na+-Ca2+ exchange current/pA.pF-1
+50 mV
-80 mV
Control
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5.38±0.37
-1.80±0.22
10-5
4.55±0.57
-1.70±0.10
3×10-5
4.16±0.48*
-1.54±0.36
10-4
3.18±0.28**
-1.38±0.24
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*P<0.05, **P<0.01 compared with control.讨论
本实验用来测量Na+-Ca2+交换电流方法的优越性在于：电极内液用高浓度的Ca2+缓冲剂EGTA来防止胞内游离Ca2+浓度的增加，使之维持在153 nmol.L-1的水平。通过使用各种特异性通道阻断剂，排除其它膜电流对INa-Ca的干扰，使记录到的INa-Ca的电流-电压关系曲线呈线性[5]。
实验中，通过改变[Ca2+]o和[Na+]i，证明胞外[Ca2+]和胞内[Na+]的增加都可使INa-Ca增大，胞外无Ca2+或胞内无Na+条件下，均记录不到INa-Ca，与文献报道[6]一致。
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在正常状态下，INa-Ca以内向为主，是胞内Ca2+排出，维持[Ca2+]i的重要机制之一。心肌缺血时，胞内H+增加，通过Na+-H+交换使胞内Na+增加，而此时由于能量供应不足，Na+-K+泵活性降低，胞内Na+不能充分泵到胞外，发生胞内Na+超载，高浓度的Na+激活细胞膜上的Na+-Ca2+交换体；此时若发生再灌注，能量恢复，Na+便从胞内向胞外转移，与此同时通过Na+-Ca2+交换机制，Ca2+便从胞外向胞内转移发生Ca2+超载，从而引起一系列病理生理损伤，甚至细胞死亡。
本实验电极内液用高浓度Na+，通过离子扩散使胞内形成高Na+状态，模拟缺血-再灌时的胞内Na+超载。胞内Na+增加可激活Na+-Ca2+交换体的反向转运机制，使胞内Na+与胞外Ca2+发生交换，INa-Ca的外向成分显著增加；同时胞内Ca2+浓度也相应增加，导致胞内Ca2+超载。由此可以推测，Na+-Ca2+交换体的反向转运可能是心肌缺血再灌注损伤中形成Ca2+超载的机制之一。阿米洛利是较强的Na+-H+交换抑制剂，已有研究显示，阿米洛利对INa-Ca有抑制作用[7]。在本实验条件下发现它对INa-Ca的外向成分有明显的抑制作用，即抑制胞内Na+与胞外Ca2+之间的交换，防止胞内Ca2+超载，起到心肌保护的作用。实验中已形成胞内高Na+状态，INa-Ca的外向成分显著增加，此时阿米洛利对INa-Ca的抑制可能是它的直接作用，而不是通过抑制Na+-H+交换，减轻胞内Na+超载，间接抑制Na+-Ca2+交换体的反向转运。但是，阿米洛利可以通过对INa-Ca的直接和间接作用，促进心肌缺血后功能的恢复。由于缺少特异性的Na+-Ca2+交换和Na+-H+交换抑制剂，二者之间的关系有待进一步实验证明。
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我们在实验中，通过增加电极内液中Na+的浓度，使胞内形成高Na+状态，而显著增加外向INa-Ca的方法，为寻找能特异地作用于外向INa-Ca，防止心肌缺血再灌时的Ca2+超载，开发具有心肌保护作用的新型药物，提供了一种新的方法和手段。
基金项目:国家杰出青年科学基金资助项目(39425014)
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参考文献
1 Niggli E, Lederer WJ. Molecular operation of the sodium-calcium exchanger revealed by conformation currents. Nature, 1991,349∶621
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2 Lipp P, Niggli E. Sodium-current induced calcium signals in isolated guinea pig ventricular myocytes. J Physiol, 1994,474∶439
3 Benardeau A, Hatem SN, Martin CR, et al. Contribution of Na+/Ca2+ exchange to action potential of human atrial myocytes. Am J Physiol, 1996,271∶H1151
4 Ehara T, Matsuoka S, Noma A, Measurement of reversal potential of Na+-Ca2+ exchange current in guinea-pig ventricular cells. J Physiol, 1989,410∶227
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5 Kimura J, Miyamae S, Noma A. Identification of sodium-calcium exchange current in single ventricular cells of guinea-pig. J Physiol, 1987,384∶199
6 Kimura J, Noma A, Irisawa H. Na-Ca exchange current in mammalian heart cells. Nature, 1986,319∶596
7 Doering AE, Lederer WJ. The mechanism by which cytoplasmic protons inhibit the sodium-calcium exchanger in guinea-pig heart cells. J Physiol, 1993,466∶481
收稿日期: 1998-07-16, 百拇医药