血小板激活因子受体mRNA在小鼠附睾精子内的表达
作者：吴翠娇 Stojanova T O'Neill C
单位：吴翠娇 青岛医学院组织学与胚胎学教研室(青岛266021)；Stojanova T O'Neill C 澳大利亚悉尼大学皇家北岸医院人类生殖研究所
关键词：血小板活化因子；受体；聚合酶链反应；精子
青岛医学院学报990303 【摘要】 ①目的 检测血小板激活因子受体(PAFR)mRNA在小鼠附睾精子内的表达，探讨PAFR对受精过程的影响。②方法 分离提取小鼠附睾精子mRNA，经逆转录(RT)合成PAFR-cDNA.利用聚合酶链反应(PCR)扩增PAFR-cDNA，DNA序列分析验证扩增产物的准确性。③结果 小鼠附睾精子表达PAFR-mRNA；DNA序列分析验证PCR产物为小鼠PAFR-cDNA.④结论 小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达。
中国图书馆分类法分类号 R321.1
, http://www.100md.com
EXPRESSION OF PLATELET-ACTIVATING FACTOR RECEPTOR mRNA IN EPIDIDYMIS SPERM OF MOUSE
Wu Cuijiao, Stojanova T, O'Neill C
Department of Histology and Embryology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To examine the expression of platelet-activating factor receptor (PAFR) mRNA in epididymis sperm of mouse and to investigate the effect of PAFR in acrosome reaction of sperm. Methods Total mRNA of the sperm was purified and cDNA was synthesized by reverse transcription (RT). RT product was amplified by PCR with the PAFR specific primer. The cloned PCR product of PAFR was confirmed by DNA sequencing. Results The expression of PAFR-mRNA by mouse epididymis sperm was demonstrated by RT-PCR and confirmed by DNA sequence analysis. Conclusion PAFR mRNA was expressed by epididymis sperm of mouse and the existence of PAFR on sperm was strongly supported
, 百拇医药
【KEY WORDS】 platelet activating factor; receptor; polymerase chain reaction; spermcatozoa
血小板激活因子(PAF)是组织细胞的一种自分泌调节因子，广泛参与体内的多种生理及病理过程，它对细胞的作用多由其特异性受体介导并可被其受体阻断剂所阻断〔1〕。有关成熟精子是否存在PAF受体(PAFR)，PAF是否通过其特异性受体影响精子的获能及受精，目前尚未见报道。有实验证明，成熟精子能合成PAF并在精子获能及受精过程中发挥重要作用〔2〕；外源性PAF能促进精子活动力，促进顶体反应，提高受精率〔3〕。本实验利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测PAFR-mRNA在成熟精子内的表达，探讨PAFR对受精过程的影响。
1 材料与方法
1.1 小鼠精子的采集
, 百拇医药
成年雄性Swiss albino小鼠12只，10周龄(由悉尼大学动物中心提供)。断颈致死取附睾，分离脂肪，迅速放置于人输卵管培养液(HTFM)内，用无菌针头在附睾上穿刺数孔，放入37℃孵箱内孵育15min，使精子充分游出。在25℃下，100g条件下离心5min，收集沉淀物，将其放入2mL平衡好的HTFM中，37℃下孵育3h.收集上游精子并计数。上述条件下离心5min，弃上清，取沉淀的精子提取RNA.
1.2 引物的设计和合成
逆转录过程所用的寡核苷酸引物购于美国Perkin-Elmer公司。PCR过程中PAFR的特异性引物(5′-GATGGCTCAGGCAACATCAC-3′，5′-TGATGAATACCGCCAAGACC-3′)是根据小鼠腹腔巨噬细胞PAFR基因序列(Accession No:D50872;Genebank)设计并合成。预计合成DNA片段为271bp.
1.3 mRNA的提取
, 百拇医药
利用TRIzolTM试剂提取精子mRNA.将4×106个精子加入1mL TRIzolTM(Gibco BRL.Life Technologieso)试剂中，混匀，孵育5min，然后加入200μL氯仿,振摇2～3min，4℃下离心15min；收集液相，加入0.5mL异丙醇,室温下孵育1min，4℃下7 500g离心15min,弃上清。用16.3mol/L乙醇水溶液1mL洗涤沉淀物，室温下孵育10min，4℃下7500g离心5min，弃上清。mRNA沉淀物于室温下空气干燥15min,加入20μL双蒸水使其溶解,20℃下储存备用。
1.4 cDNA的合成
逆转录cDNA于FTS-960 Thermal Squencer(Perkin-Elmer公司)内合成。反应混合物总体积20μL,其中含精子mRNA 5μg,5mmol/L MgCl2,1×PCR Buffer Ⅱ,1mmol/L各种dNTP,1U RNase抑制物,2.5U MuLV逆转录酶和2.5μmol/L寡核苷酸引物(药盒购于Perkin-Elmer公司)。反应条件：逆转录42℃，30min；变性及逆转录酶灭活98℃，5min；后冷却至5℃.
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1.5 PCR扩增
PCR扩增与逆转录反应于同一仪器中进行。总反应体积100μL，含逆转录产物20μL,2mmol/L MgCl2,1×PCR BufferⅡ，2.5U Ampli Taq DNA多聚酶，上行引物和下行引物各0.15μmol/L.反应程序如下：94℃,10min;93℃，30min;56℃，1min;72℃，1min；循环35次；72℃，10min.同时，设置阳性对照、阴性对照及水对照以验证操作的准确性。取PCR扩增产物10μL直接上样于20g/L的琼脂凝胶板进行电泳，溴化乙锭染色，以ф174/HaeⅢ为DNA分子标准参照，紫外灯下观察结果并照相。
1.6 DNA克隆及序列分析
为验证PCR扩增产物的准确性，对其进行了克隆及测序。按照生产者提供的操作步骤，PCR产物通过Wizard PCR Mini-Prep(Supelco，Bellefonte,PA)被纯化。沉淀物溶于20μL TE(10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA，pH 5.3)缓冲液内。DNA序列测定采用Sanger等〔4〕的双脱氧终端法，于Catalist 800(Perkin-Elmer公司)自动工作站进行,引物同上。DNA序列分析于377DNA分析仪(Perkin-Elmer公司)内进行。
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2 结果
通过RT-PCR显示，小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达。由精子内获得的mRNA经逆转录PCR扩增后，产生了预期大小(271bp)的DNA分子单一条带。与阳性对照的结果相同。经克隆后DNA测序证实，271bp的cDNA条带为PAFR-cDNA.与小鼠腹腔巨噬细胞内编码PAFR的核苷酸序列完全相同。
3 讨论
本文结果显示，小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达；结合我们以前的实验结果，外源性PAF对小鼠附睾精子具有明显的趋化作用，这种作用能被其特异性受体阻断剂所阻断；提示小鼠附睾精子表面可能存在PAFR.
PAFR是一种带有7个跨膜区域的G蛋白相关受体，由人白细胞cDNA文库中克隆的PAFR-cDNA,具有编码342个氨基酸残基的开放阅读框架〔5〕；而由小鼠巨噬细胞cDNA文库中克隆的PAFR-cDNA，有编码341个氨基酸残基的开放阅读框架，位于第4条染色体D2.2条带上〔6〕。在人及豚鼠的肺组织中，PAF的特异性结合位点为细胞的膜性时相〔7〕；在其他体细胞〔8〕，PAF通过PAFR介导的几条信号传导途径对细胞发生作用：①通过激活PAFR，激活磷酸脂酶C，诱导三磷酸肌醇(IP3)和二乙酰甘油(DG)的形成；IP3引起细胞内储存钙的释放及细胞外钙离子向细胞内的转运，DG激活蛋白激酶C.②激活磷酸脂酶A2，引起花生四烯酸的释放，为二十烷类、前列腺素、白三烯的合成提供底物。③激活细胞蛋白的酪氨酸磷酸化。虽然目前尚未证实精子表面是否存在PAFR，但成熟精子能够合成内源性的PAF，而PAF本身又可增强其受体mRNA的表达〔9〕，提高精子活力，促进顶体反应〔3〕；其作用能被PAFR拮抗剂〔1〕和蛋白激酶A，C，K的抑制剂所阻断〔7〕。提示PAF可能是通过其特异性受体介导，激活细胞内蛋白激酶系统，进而影响精子活力及顶体反应。对于人成熟精子PAFR-mRNA的表达，及其与精子活力、顶体反应及受精的关系，有待进一步探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 Frenkel RA, Muguruma K, Johnston JM. The biochemical role of platelet-activating factor in reproduction. Prog Lipid Res,1996,35:155
2 Kuzan FB, Geissler FT,Henderson WR. Role of spermatozoal platelet-activating factor in fertilization. Prostaglandins, 1990,9:61
3 Sengoku K, Tamate K, Takaoka Y, et al. Effect of platelet-activating factor on human sperm function in vitro. Hum Reprod,1993,8:1443
, 百拇医药
4 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci USA,1977, 74:5463
5 Nakamura M, Honda Z, Izumi T, et al. Molecular cloning and expression of platelet-activating factor receptor from human leukocytes. J Biol Chem,1991, 266:20400
6 Ishll S, Matsuda Y, Nakamura M, et al. A murine platelet-activating factor receptor gene: cloning, chromosomal localization and up-regulation of expression by lipopolysaccharide in peritoneal resident macrophages. Biochem J, 1996,314:671
, 百拇医药
7 Dent G, Ukena D, Sybrecht GW, et al.(3H)WEB2086 lables platelet-activating factor in guinea pig and human lung. Eur J Pharmacol,1989,169:313
8 Sengoku K, Tamate K, Takuma N, et al. Involvement of protein kinases platelet-activating factor induced acrosome reaction of human spermatozoa. Mol Hum Reprod,1996, 2(6):401
9 Shirasaki H, Nishikwa M, Adcock IM, et al. Expression of platelet-activating factor receptor mRNA in human and guinea pig lung. Am J Respir Cell Mol Biol,1994,10:533
(1999-01-14收稿 1999-07-03修回), 百拇医药
单位：吴翠娇 青岛医学院组织学与胚胎学教研室(青岛266021)；Stojanova T O'Neill C 澳大利亚悉尼大学皇家北岸医院人类生殖研究所
关键词：血小板活化因子；受体；聚合酶链反应；精子
青岛医学院学报990303 【摘要】 ①目的 检测血小板激活因子受体(PAFR)mRNA在小鼠附睾精子内的表达，探讨PAFR对受精过程的影响。②方法 分离提取小鼠附睾精子mRNA，经逆转录(RT)合成PAFR-cDNA.利用聚合酶链反应(PCR)扩增PAFR-cDNA，DNA序列分析验证扩增产物的准确性。③结果 小鼠附睾精子表达PAFR-mRNA；DNA序列分析验证PCR产物为小鼠PAFR-cDNA.④结论 小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达。
中国图书馆分类法分类号 R321.1
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EXPRESSION OF PLATELET-ACTIVATING FACTOR RECEPTOR mRNA IN EPIDIDYMIS SPERM OF MOUSE
Wu Cuijiao, Stojanova T, O'Neill C
Department of Histology and Embryology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To examine the expression of platelet-activating factor receptor (PAFR) mRNA in epididymis sperm of mouse and to investigate the effect of PAFR in acrosome reaction of sperm. Methods Total mRNA of the sperm was purified and cDNA was synthesized by reverse transcription (RT). RT product was amplified by PCR with the PAFR specific primer. The cloned PCR product of PAFR was confirmed by DNA sequencing. Results The expression of PAFR-mRNA by mouse epididymis sperm was demonstrated by RT-PCR and confirmed by DNA sequence analysis. Conclusion PAFR mRNA was expressed by epididymis sperm of mouse and the existence of PAFR on sperm was strongly supported
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【KEY WORDS】 platelet activating factor; receptor; polymerase chain reaction; spermcatozoa
血小板激活因子(PAF)是组织细胞的一种自分泌调节因子，广泛参与体内的多种生理及病理过程，它对细胞的作用多由其特异性受体介导并可被其受体阻断剂所阻断〔1〕。有关成熟精子是否存在PAF受体(PAFR)，PAF是否通过其特异性受体影响精子的获能及受精，目前尚未见报道。有实验证明，成熟精子能合成PAF并在精子获能及受精过程中发挥重要作用〔2〕；外源性PAF能促进精子活动力，促进顶体反应，提高受精率〔3〕。本实验利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测PAFR-mRNA在成熟精子内的表达，探讨PAFR对受精过程的影响。
1 材料与方法
1.1 小鼠精子的采集
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成年雄性Swiss albino小鼠12只，10周龄(由悉尼大学动物中心提供)。断颈致死取附睾，分离脂肪，迅速放置于人输卵管培养液(HTFM)内，用无菌针头在附睾上穿刺数孔，放入37℃孵箱内孵育15min，使精子充分游出。在25℃下，100g条件下离心5min，收集沉淀物，将其放入2mL平衡好的HTFM中，37℃下孵育3h.收集上游精子并计数。上述条件下离心5min，弃上清，取沉淀的精子提取RNA.
1.2 引物的设计和合成
逆转录过程所用的寡核苷酸引物购于美国Perkin-Elmer公司。PCR过程中PAFR的特异性引物(5′-GATGGCTCAGGCAACATCAC-3′，5′-TGATGAATACCGCCAAGACC-3′)是根据小鼠腹腔巨噬细胞PAFR基因序列(Accession No:D50872;Genebank)设计并合成。预计合成DNA片段为271bp.
1.3 mRNA的提取
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利用TRIzolTM试剂提取精子mRNA.将4×106个精子加入1mL TRIzolTM(Gibco BRL.Life Technologieso)试剂中，混匀，孵育5min，然后加入200μL氯仿,振摇2～3min，4℃下离心15min；收集液相，加入0.5mL异丙醇,室温下孵育1min，4℃下7 500g离心15min,弃上清。用16.3mol/L乙醇水溶液1mL洗涤沉淀物，室温下孵育10min，4℃下7500g离心5min，弃上清。mRNA沉淀物于室温下空气干燥15min,加入20μL双蒸水使其溶解,20℃下储存备用。
1.4 cDNA的合成
逆转录cDNA于FTS-960 Thermal Squencer(Perkin-Elmer公司)内合成。反应混合物总体积20μL,其中含精子mRNA 5μg,5mmol/L MgCl2,1×PCR Buffer Ⅱ,1mmol/L各种dNTP,1U RNase抑制物,2.5U MuLV逆转录酶和2.5μmol/L寡核苷酸引物(药盒购于Perkin-Elmer公司)。反应条件：逆转录42℃，30min；变性及逆转录酶灭活98℃，5min；后冷却至5℃.
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1.5 PCR扩增
PCR扩增与逆转录反应于同一仪器中进行。总反应体积100μL，含逆转录产物20μL,2mmol/L MgCl2,1×PCR BufferⅡ，2.5U Ampli Taq DNA多聚酶，上行引物和下行引物各0.15μmol/L.反应程序如下：94℃,10min;93℃，30min;56℃，1min;72℃，1min；循环35次；72℃，10min.同时，设置阳性对照、阴性对照及水对照以验证操作的准确性。取PCR扩增产物10μL直接上样于20g/L的琼脂凝胶板进行电泳，溴化乙锭染色，以ф174/HaeⅢ为DNA分子标准参照，紫外灯下观察结果并照相。
1.6 DNA克隆及序列分析
为验证PCR扩增产物的准确性，对其进行了克隆及测序。按照生产者提供的操作步骤，PCR产物通过Wizard PCR Mini-Prep(Supelco，Bellefonte,PA)被纯化。沉淀物溶于20μL TE(10mmol/L Tris，0.1mmol/L EDTA，pH 5.3)缓冲液内。DNA序列测定采用Sanger等〔4〕的双脱氧终端法，于Catalist 800(Perkin-Elmer公司)自动工作站进行,引物同上。DNA序列分析于377DNA分析仪(Perkin-Elmer公司)内进行。
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2 结果
通过RT-PCR显示，小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达。由精子内获得的mRNA经逆转录PCR扩增后，产生了预期大小(271bp)的DNA分子单一条带。与阳性对照的结果相同。经克隆后DNA测序证实，271bp的cDNA条带为PAFR-cDNA.与小鼠腹腔巨噬细胞内编码PAFR的核苷酸序列完全相同。
3 讨论
本文结果显示，小鼠附睾精子有PAFR-mRNA的表达；结合我们以前的实验结果，外源性PAF对小鼠附睾精子具有明显的趋化作用，这种作用能被其特异性受体阻断剂所阻断；提示小鼠附睾精子表面可能存在PAFR.
PAFR是一种带有7个跨膜区域的G蛋白相关受体，由人白细胞cDNA文库中克隆的PAFR-cDNA,具有编码342个氨基酸残基的开放阅读框架〔5〕；而由小鼠巨噬细胞cDNA文库中克隆的PAFR-cDNA，有编码341个氨基酸残基的开放阅读框架，位于第4条染色体D2.2条带上〔6〕。在人及豚鼠的肺组织中，PAF的特异性结合位点为细胞的膜性时相〔7〕；在其他体细胞〔8〕，PAF通过PAFR介导的几条信号传导途径对细胞发生作用：①通过激活PAFR，激活磷酸脂酶C，诱导三磷酸肌醇(IP3)和二乙酰甘油(DG)的形成；IP3引起细胞内储存钙的释放及细胞外钙离子向细胞内的转运，DG激活蛋白激酶C.②激活磷酸脂酶A2，引起花生四烯酸的释放，为二十烷类、前列腺素、白三烯的合成提供底物。③激活细胞蛋白的酪氨酸磷酸化。虽然目前尚未证实精子表面是否存在PAFR，但成熟精子能够合成内源性的PAF，而PAF本身又可增强其受体mRNA的表达〔9〕，提高精子活力，促进顶体反应〔3〕；其作用能被PAFR拮抗剂〔1〕和蛋白激酶A，C，K的抑制剂所阻断〔7〕。提示PAF可能是通过其特异性受体介导，激活细胞内蛋白激酶系统，进而影响精子活力及顶体反应。对于人成熟精子PAFR-mRNA的表达，及其与精子活力、顶体反应及受精的关系，有待进一步探讨。
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参考文献
1 Frenkel RA, Muguruma K, Johnston JM. The biochemical role of platelet-activating factor in reproduction. Prog Lipid Res,1996,35:155
2 Kuzan FB, Geissler FT,Henderson WR. Role of spermatozoal platelet-activating factor in fertilization. Prostaglandins, 1990,9:61
3 Sengoku K, Tamate K, Takaoka Y, et al. Effect of platelet-activating factor on human sperm function in vitro. Hum Reprod,1993,8:1443
, 百拇医药
4 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nat Acad Sci USA,1977, 74:5463
5 Nakamura M, Honda Z, Izumi T, et al. Molecular cloning and expression of platelet-activating factor receptor from human leukocytes. J Biol Chem,1991, 266:20400
6 Ishll S, Matsuda Y, Nakamura M, et al. A murine platelet-activating factor receptor gene: cloning, chromosomal localization and up-regulation of expression by lipopolysaccharide in peritoneal resident macrophages. Biochem J, 1996,314:671
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7 Dent G, Ukena D, Sybrecht GW, et al.(3H)WEB2086 lables platelet-activating factor in guinea pig and human lung. Eur J Pharmacol,1989,169:313
8 Sengoku K, Tamate K, Takuma N, et al. Involvement of protein kinases platelet-activating factor induced acrosome reaction of human spermatozoa. Mol Hum Reprod,1996, 2(6):401
9 Shirasaki H, Nishikwa M, Adcock IM, et al. Expression of platelet-activating factor receptor mRNA in human and guinea pig lung. Am J Respir Cell Mol Biol,1994,10:533
(1999-01-14收稿 1999-07-03修回), 百拇医药