淫羊藿苷在大鼠体内的代谢
作者：邱 峰 陈英杰 鹿野美弘 姚新生
单位：鹿野美弘， (沈阳药科大学，沈阳 110015； 1北海道药科大学，日本
关键词：
药学学报990316 METABOLISM OF ORALLY ADMINISTERED ICARIIN IN RATS
Qiu Feng (Qiu F), Chen Yingjie (Chen YJ), Kano Yoshihiro (Kano YH) and Yao Xinsheng (Yao XS)
(Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015;
1Hokkaido College of Pharmacy, Katsuraoka 7-1, Otaru 047-02, Japan)
, http://www.100md.com
ABSTRACT AIM: To evaluate the pharmacological action of icariin in traditional Chinese medicines. METHODS: Icariin was given orally to rats, the major metabolites of icariin in gastric, small intestinal, urine and bile samples were determined and isolated by HPLC and identified by chemical and spectroscopic evidences. RESULTS: Two metabolites, icariside II and icaritin in both small intestine and urine, and two metabolites, icaritin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside and icariside II in bile were identified. The major metabolic route of orally administered icariin in rats was also proposed. CONCLUSION: Icariin is metabolized prior to absorption and exists mainly as its metabolites in vivo.
, http://www.100md.com
KEY WORDS icariin; icariside II; icaritin; icaritin 3-O-α-L-rhammopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside; metabolite
摘要 目的：为阐明淫羊藿苷在体内的作用形式，对淫羊藿苷的代谢产物及活性进行研究。方法：将淫羊藿苷给大鼠ig后，分析、分离并鉴定了其在小肠、尿、胆汁中的主要代谢产物。结果：在小肠及尿中鉴定有淫羊藿次苷II(icariside II)及淫羊藿素(icaritin)，胆汁中有淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷(icaritin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside)和淫羊藿次苷II，并对淫羊藿苷在大鼠体内主要代谢途径进行了探讨。结论：淫羊藿苷在吸收之前已发生代谢，在体内主要是以其代谢产物的形式存在。
关键词 淫羊藿苷；淫羊藿次苷II；淫羊藿素；淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷；代谢产物
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淫羊藿苷(icariin)为淫羊藿的主要黄酮类化合物之一[1,2]，并且广泛应用于药材淫羊藿的质量监控[3,4]。目前有许多有关淫羊藿苷药理、化学及生化研究的报道[5～9]，但几乎所有的体内药理实验都采用非经口给药途径，而淫羊藿无论是单味入药还是组成复方入药均为口服用药，因此评价中药中淫羊藿苷的药理活性应遵循口服这一用药形式。据有关文献报道，黄酮苷类化合物在胃肠道要发生代谢[10,11]，吸收进入体内的成分是其代谢产物而不是原形成分。本文主要介绍给大鼠ig淫羊藿苷后，小肠、尿及胆汁中代谢产物的分析、分离及结构鉴定。
实验部分
1 仪器、药品及动物
淫羊藿苷(icariin)，从朝鲜淫羊藿Epimedium koreaum Nakai分得并经光谱鉴定。分析型HPLC采用的色谱柱为Inersil ODS-2(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。核磁共振波谱 仪系ARX-300 Spectrometer，化学位移以四甲基硅烷为内标，ESI-MS 由PCQ Spectrometer测得。β-葡糖醛酸酶购于Sigma公司(USA)，♂ Wister大鼠200～250 g购于沈阳药科大学动物室。
, 百拇医药
2 胃、小肠、尿及胆汁分析样品的制备及色谱条件
2.1 胃分析样品的制备 淫羊藿苷给幽门结扎的大鼠ig 20 mg.kg-1(空白为相应的生理盐水)，4 h后取胃，用甲醇10 ml超声提取内容物5 min，离心，取上清液，用0.45 μm孔径的过滤器过滤制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件为流动相含0.5%醋酸的MeOH—H2O由70∶30(0～20 min)到85∶15(20～50 min)，检测波长为360 nm。
2.2 小肠分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，4 h后取小肠部分，切碎，加甲醇20 min超声提取5 min，离心，取上清液，40℃减压浓缩后再加甲醇2 ml超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl 。HPLC条件同2.1。
, http://www.100md.com
2.3 尿分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，收集0～36 h的尿液，40℃减压浓缩，加甲醇10 ml，超声提取5 min，离心，取上清液浓缩，加甲醇1 ml，超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为MeOH—H2O(75∶25)；检测波长为360 nm。
2.4 胆汁分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，收集2～8 h胆汁，用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为含有0.5%醋酸的MeOH—H2O由60∶40(0～15 min)到75∶25(15～60 min)；检测波长为360 nm。
3 尿、胆汁中代谢产物的分离
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大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，收集36 h尿液约1 L，40℃减压浓缩，然后用甲醇200 ml提取3次，合并提取液，浓缩，残渣用甲醇溶解，经过反复Sephadex柱色谱分得U-1及U-2部分，再经高效液相制备色谱(色谱柱：Inersil prep ODS,20 mm×250 mm，流 动相：MeOH—H2O(80∶20)，流速：3 ml.min-1)。分得U-1(69 mg)及U -2(43 mg)。
大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，麻醉后将硬质细塑管插入大鼠的胆管中，收集胆汁约200 ml，加甲醇约200 ml沉淀杂质，离心，上清液经Sephadex柱色谱及高效液相制备色谱(MeOH—H2O=65∶35及80∶20)分得B-1(23 mg)，B-2(2 mg)。
, http://www.100md.com 4 酶水解
B-1(0.5 mg)与β-葡糖醛酸酶4 μl在0.1 mol.L-1醋酸缓冲液(pH 5.0)中37℃反应3 h，在高效液相色谱上检测出降解产物中含有淫羊藿次苷II(icariside II)。
5 结构鉴定
U-1(淫羊藿次苷II,icariside II):黄色粉末, mp 207～209℃，HCl—Mg反应及Molish反应均显阳性。1HNMR(DMSO-d6) δ:0.77(3H,d,J=5.6 Hz,CH3),1.61(3H,s,CH3),1.66(3H,s,CH3),3.34(2H,m,1″-H),3.84(3H,s,OCH3),5.14(1H,brs,2″-H),5.25(1H,brs,鼠李糖端基氢),6.29(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.84(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.46(1H,s,5-OH)。13CNMR(DMSO-d6) δ:156.6(C-2),134.5(C-3),177.9(C-4),161.3(C-5),98.6(C-6),162.4(C-7),106.0(C-8),153.9(C-9),104.0(C-10),122.5(C-1′),130.5(C-2′,6′),114.1(C-3′,5′),158.9(C-4′),21.3(C-1′),122.5(C-2″),131.0(C-3″),25.5(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH3),102.0(R-1),70.4(R-2),70.7(R-3),71.2(R-4),70.1(R-5),17.5(R-6)。R=rhamnopyranosyl。
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U-2(淫羊藿素，icaritin):淡黄色粉末,mp 228～230℃,HCl—Mg反应阳性。1HNMR(DMSO-d6) δ:1.61(3H,s,CH3),1.73(3H,s,CH3),3.41(2H,d,J=5.9 Hz,1″-H),3.82(3H,s,OCH3),5.16(1H,brs,2″-H),6.28(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),8.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),9.42(1H,s,3-OH),10.70(1H,s,7-OH),12.30(1H,s,5-OH)。13CNMR δ:146.3(C-2),136.0(C-3),176.3(C-4),160.6(C-5),97.9(C-6),161.3(C-7),105.7(C-8),153.6(C-9),103.1(C-10),122.6(C-1′),129.2(C-2′,6′),114.2(C-3′,5′),158.4(C-4′),21.3(C-1″),123.6(C-2″),131.1(C-3″),25.5(C-4″),17.9(C-5″),55.5(OCH3)。
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B-1(淫羊藿苷3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷，icaritin 3-O-α-L-rhamn opyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside):黄色粉末,mp 164～167 ℃,HCl—Mg反应及Molish反应阳性。阴离子ESI-MS m/z:689(M-H)-,513(M-H-C6H8O6)-,366(M-H-C6H8O6-C6H11O4)-。阳离子ESI-MS m/z:691(M+H)+,545(M+H-C6H10O4)+,369(M+H-C6H10O4-C6H8O6)+。1HNMR(DMSO-d6) δ:0.78(3H,d,J=6.0 Hz,CH3),1.59(3H,s,CH3),1.67(3H,s,CH3),3.37(2H,br.s,1″-H),3.85(3H,s,OCH3),5.18(1H,br.s,2″-H),5.20(1H,d,J=7.1 Hz,葡糖醛酸基端基氢),5.27(1H,br.s,鼠李糖基端基氢),6.63(1H,s,6-H),7.12(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.88(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.56(1H,s,5-OH)。13CNMR(DMSO-d6) δ:157.3(C-2),134.7(C-3),178.2(C-4),160.0(C-5),97.9(C-6),162.0(C-7),108.5(C-8),153.1(C-9),105.7(C-10),122.2(C-1′),130.5(C-2′, 6′),114.0(C-3′,5′),159.0(C-4′),21.4(C-1″),122.0(C-2″),131.1(C-3″),25.4(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH3),102.0(R-1),70.3(R-2),70.6(R-3),71.1(R-4),70.0(R-5),17.4(R-6),100.0(G-1),73.0(G-2),75.8(G-3),71.2(G-4),75.3(G-5),170.0(G-6)。R=rhamnopyranosyl;G=glucopyranuronosyl。
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结果
1 胃、小肠、尿及胆汁中代谢产物的分析
图1为给大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后胃提取物的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig 4 h后，在胃提取物中只检测出两个微量的代谢产物W-1(tR:14 min)及W-2(tR:22 min)。
图2为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后小肠提取物的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig 4 h后，在小肠提取物中可检测出两个主要的相关代谢产物，其保留时间分别为I-1:22 min，I-2:42 min。
图3为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后尿的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig后36 h的尿中检测出两个主要代谢产物U-1和U-2，其保留时间分别为U-1:13 min，U-2:42 min。
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图4为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后胆汁的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig后2～8 h的胆汁中检测出两个主要代谢产物B-1和B-2，其保留时间分别为B-1:9 min，B-2:34 min。
Fig 1 HPLC chromatograms for gastric samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). Column: Inersil ODS-2 (5 μm, 4.6 mm×250 mm); flow rate: 1 ml*min-1; UV detection: 360 nm; mobile phase: MeOH—H2O (containing 0.5% acetic acid), 70∶30(0～20 min)→85∶15(20～50 min); injection volume: 20 μl. W-1: Metabolite 1; W-2: Metabolite 2.
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Fig 2 HPLC chromatograms for small intestinal samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1. I-1: Metabolite 1; I-2: Metabolite 2.
Fig 3 HPLC chromatograms for urine samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1, except for mobile phase. Mobile phase: MeOH—H2O (75∶25) for 50 min. U-1: Metabolite 1; U-2: Metabolite 2.
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Fig 4 HPLC chromatograms for bile samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1, except for mobile phase. Mobile phase: MeOH—H2O (containing 0.5% acetic acid), 60∶40(0～15 min)→75∶25(15～60 min). B-1: Metabolite 1; B-2: Metabolite 2.
2 尿及胆汁中代谢产物的分离及结构鉴定
大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，收集尿、胆汁，处理后经Sephadex柱色谱及高效液相色谱分得代谢产物B-1，B-2，U-1及U-2。
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U-1，U-2经与已知化合物的文献1HNMR及13CNMR[12]数据相比较，分别鉴定为淫羊藿次苷II和淫羊藿素。
B-1，黄色粉末，HCl—Mg反应及Molish反应阳性。阴离子ESI-MS示伪分子离子峰689(M-1)-及碎片离子峰513(M-H-C6H8O6)-，366(M-H-C6H8O6-C6H11O4)-1；阳离子ESI-MS示伪分子离子峰691(M+H)+及碎片离子峰545(M+H-C6H10O4)+，369(M+H-C6H10O4-C6H8O6)+。说明B-1由一单位的淫羊藿素，一单位葡糖醛酸基及一单位鼠李糖基组成。1HNMR及13CNMR数据进一步证实了这一结论。B-1的1HNMR光谱在δ 5.20及5.27处示有葡萄吡喃糖醛酸基及鼠李吡喃糖基两端基氢信号，位于低场δ 12.56处的信号为典型的C-5上游离羟基信号，因此两糖基分别连结在B-1的C3-OH及C7-OH上。又采用β-葡糖醛酸酶水解B-1得淫羊藿次苷II，从而证实了β-D-葡糖醛酸基连结在B-1的C7-OH上。
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基于上述数据，B-1鉴定为淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷。
经TLC，HPLC及ESI-MS分析鉴定，U-1，B-2，I-1与W-2为同一物质淫羊藿次苷II；I-2与U-2为同一化合物淫羊藿素。
W-1在HPLC上与对照品淫羊藿次苷I保留时间一致，其ESI-MS给出相应的伪分子离子峰531(M+1)+及碎片离子峰369(M+1-C6H10O5)+，故W-1为淫羊藿次苷I(icariside I)。
综上所述，淫羊藿苷的代谢产物可总结如图5。
R1
R2
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Icariin
α-L-Rhamnopyranosyl
β-D-Glucopyranosyl
Icaritin
H
H
Icariside I
H
β-D-Glucopyranosyl
Icariside II
α-L-Rhamnopyranosyl
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H
Icariside II 7-O-Glc UA
α-L-Rhamnopyranosyl
β-D-Glucopyranuronosyl
Fig 5 Structures of icariin and its metabolites.
讨论
淫羊藿苷在胃中比较稳定，ig后4 h仅检测出微量的淫羊藿次苷I及淫羊藿次苷II，但淫羊藿苷进入肠道后很快发生代谢，转化为淫羊藿次苷II。小肠道中少量的淫羊藿素主要来自胃中淫羊藿次苷I的进一步降解。尿中的代谢产物为相对小分子及低极性的淫羊藿次苷II及淫羊藿素，而胆汁中的代谢产物为以相对大分子量及大极性的淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷为主，仅有少量的淫羊藿次苷II，这些结果提示淫羊藿苷主要的代谢途径为图6。
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Fig 6 The major metabolic route of orally administered icariin in rats.
淫羊藿苷在肠道中降解为淫羊藿次苷II(脱葡萄糖基)，然后吸收进入体内。进入体内的淫羊藿次苷II再在肝脏发生C7-OH葡糖醛酸化。葡糖醛酸化产物通过胆汁排入小肠中，而未被代谢的淫羊藿次苷II通过肾脏排入尿中。原形成分淫羊藿苷仅在胆汁中检测出微量。这一结果说明口服形式的淫羊藿苷很可能是以其代谢产物发挥作用的。
有关文献报道黄酮苷类化合物在肠道中降解成苷元再吸收[10,11]，而淫羊藿苷主要是以它的次级鼠李糖苷形式吸收，这可能与大鼠肠道中降解淫羊藿次苷II的酶或微生物缺乏或作用较弱有关。淫羊藿苷代谢产物的药理活性研究目前正在进行之中。
基金项目： 辽宁省科学技术基金资助项目(971084)
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Tel:(024)23843711-3389 or 3431,E-mail:fengqiu@ihw.com .cn)
参考文献
1 刘爱茹,徐礼 .中草药有效成分的分析,淫羊藿中淫羊藿苷的含量测定.药物分析杂志,1984,4∶81
2 郭宝林,肖培根.5种淫羊藿的不同部位的黄酮类成分分析.中国中药杂志,1996,21∶523
3 中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典.1995年版.北京：化工出版社,1995.287～288
4 紫逸峰,李修禄.用反相高效液相色谱法测定淫羊藿及其制剂中淫羊藿苷的含量研究.药物分析杂志,1991,11∶207
, 百拇医药 5 徐根旺,许保军,汪茂田.淫羊藿苷及淫羊藿次苷的分离与鉴定.药学通报,1987,22∶129
6 刘崇铭,于庆海,张利民.淫羊藿苷对心脏的影响.沈阳药学院学报,1981,14∶28
7 赵勇,张玲,王芸,等.淫羊藿苷的体外免疫调节作用研究.中草药,1996,27∶669
8 邢善田,周金黄.淫羊藿苷促进抗体生成的作用.药学通报,1987,22∶533
9 王天然,邢善田,周金黄.淫羊藿多糖和淫羊藿苷对抑制性T细胞的作用.中国免疫杂志,1986,2∶74
10 Abe K, Nakada Y, Suziki A, et al. Biliary metabolites of hesperein in rats. Shoyakugaku Zasshi, 1993,47∶43
11 Yasuda T, Kano Y, Saito K, et al. Urinary and biliary metabolites of daidzin and daidzein in Rats. Biol Pharm Bull, 1994,17∶1369
12 李枫,刘永 .宝藿苷-I,VI,VII和宝藿素的分离和结构研究.药学学报,1988,23∶739
收稿日期: 1998-06-15, http://www.100md.com
单位：鹿野美弘， (沈阳药科大学，沈阳 110015； 1北海道药科大学，日本
关键词：
药学学报990316 METABOLISM OF ORALLY ADMINISTERED ICARIIN IN RATS
Qiu Feng (Qiu F), Chen Yingjie (Chen YJ), Kano Yoshihiro (Kano YH) and Yao Xinsheng (Yao XS)
(Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110015;
1Hokkaido College of Pharmacy, Katsuraoka 7-1, Otaru 047-02, Japan)
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ABSTRACT AIM: To evaluate the pharmacological action of icariin in traditional Chinese medicines. METHODS: Icariin was given orally to rats, the major metabolites of icariin in gastric, small intestinal, urine and bile samples were determined and isolated by HPLC and identified by chemical and spectroscopic evidences. RESULTS: Two metabolites, icariside II and icaritin in both small intestine and urine, and two metabolites, icaritin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside and icariside II in bile were identified. The major metabolic route of orally administered icariin in rats was also proposed. CONCLUSION: Icariin is metabolized prior to absorption and exists mainly as its metabolites in vivo.
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KEY WORDS icariin; icariside II; icaritin; icaritin 3-O-α-L-rhammopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside; metabolite
摘要 目的：为阐明淫羊藿苷在体内的作用形式，对淫羊藿苷的代谢产物及活性进行研究。方法：将淫羊藿苷给大鼠ig后，分析、分离并鉴定了其在小肠、尿、胆汁中的主要代谢产物。结果：在小肠及尿中鉴定有淫羊藿次苷II(icariside II)及淫羊藿素(icaritin)，胆汁中有淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷(icaritin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside)和淫羊藿次苷II，并对淫羊藿苷在大鼠体内主要代谢途径进行了探讨。结论：淫羊藿苷在吸收之前已发生代谢，在体内主要是以其代谢产物的形式存在。
关键词 淫羊藿苷；淫羊藿次苷II；淫羊藿素；淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷；代谢产物
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淫羊藿苷(icariin)为淫羊藿的主要黄酮类化合物之一[1,2]，并且广泛应用于药材淫羊藿的质量监控[3,4]。目前有许多有关淫羊藿苷药理、化学及生化研究的报道[5～9]，但几乎所有的体内药理实验都采用非经口给药途径，而淫羊藿无论是单味入药还是组成复方入药均为口服用药，因此评价中药中淫羊藿苷的药理活性应遵循口服这一用药形式。据有关文献报道，黄酮苷类化合物在胃肠道要发生代谢[10,11]，吸收进入体内的成分是其代谢产物而不是原形成分。本文主要介绍给大鼠ig淫羊藿苷后，小肠、尿及胆汁中代谢产物的分析、分离及结构鉴定。
实验部分
1 仪器、药品及动物
淫羊藿苷(icariin)，从朝鲜淫羊藿Epimedium koreaum Nakai分得并经光谱鉴定。分析型HPLC采用的色谱柱为Inersil ODS-2(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。核磁共振波谱 仪系ARX-300 Spectrometer，化学位移以四甲基硅烷为内标，ESI-MS 由PCQ Spectrometer测得。β-葡糖醛酸酶购于Sigma公司(USA)，♂ Wister大鼠200～250 g购于沈阳药科大学动物室。
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2 胃、小肠、尿及胆汁分析样品的制备及色谱条件
2.1 胃分析样品的制备 淫羊藿苷给幽门结扎的大鼠ig 20 mg.kg-1(空白为相应的生理盐水)，4 h后取胃，用甲醇10 ml超声提取内容物5 min，离心，取上清液，用0.45 μm孔径的过滤器过滤制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件为流动相含0.5%醋酸的MeOH—H2O由70∶30(0～20 min)到85∶15(20～50 min)，检测波长为360 nm。
2.2 小肠分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，4 h后取小肠部分，切碎，加甲醇20 min超声提取5 min，离心，取上清液，40℃减压浓缩后再加甲醇2 ml超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl 。HPLC条件同2.1。
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2.3 尿分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，收集0～36 h的尿液，40℃减压浓缩，加甲醇10 ml，超声提取5 min，离心，取上清液浓缩，加甲醇1 ml，超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为MeOH—H2O(75∶25)；检测波长为360 nm。
2.4 胆汁分析样品的制备 大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1(空白为相应量的生理盐水)，收集2～8 h胆汁，用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为含有0.5%醋酸的MeOH—H2O由60∶40(0～15 min)到75∶25(15～60 min)；检测波长为360 nm。
3 尿、胆汁中代谢产物的分离
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大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，收集36 h尿液约1 L，40℃减压浓缩，然后用甲醇200 ml提取3次，合并提取液，浓缩，残渣用甲醇溶解，经过反复Sephadex柱色谱分得U-1及U-2部分，再经高效液相制备色谱(色谱柱：Inersil prep ODS,20 mm×250 mm，流 动相：MeOH—H2O(80∶20)，流速：3 ml.min-1)。分得U-1(69 mg)及U -2(43 mg)。
大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，麻醉后将硬质细塑管插入大鼠的胆管中，收集胆汁约200 ml，加甲醇约200 ml沉淀杂质，离心，上清液经Sephadex柱色谱及高效液相制备色谱(MeOH—H2O=65∶35及80∶20)分得B-1(23 mg)，B-2(2 mg)。
, http://www.100md.com 4 酶水解
B-1(0.5 mg)与β-葡糖醛酸酶4 μl在0.1 mol.L-1醋酸缓冲液(pH 5.0)中37℃反应3 h，在高效液相色谱上检测出降解产物中含有淫羊藿次苷II(icariside II)。
5 结构鉴定
U-1(淫羊藿次苷II,icariside II):黄色粉末, mp 207～209℃，HCl—Mg反应及Molish反应均显阳性。1HNMR(DMSO-d6) δ:0.77(3H,d,J=5.6 Hz,CH3),1.61(3H,s,CH3),1.66(3H,s,CH3),3.34(2H,m,1″-H),3.84(3H,s,OCH3),5.14(1H,brs,2″-H),5.25(1H,brs,鼠李糖端基氢),6.29(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.84(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.46(1H,s,5-OH)。13CNMR(DMSO-d6) δ:156.6(C-2),134.5(C-3),177.9(C-4),161.3(C-5),98.6(C-6),162.4(C-7),106.0(C-8),153.9(C-9),104.0(C-10),122.5(C-1′),130.5(C-2′,6′),114.1(C-3′,5′),158.9(C-4′),21.3(C-1′),122.5(C-2″),131.0(C-3″),25.5(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH3),102.0(R-1),70.4(R-2),70.7(R-3),71.2(R-4),70.1(R-5),17.5(R-6)。R=rhamnopyranosyl。
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U-2(淫羊藿素，icaritin):淡黄色粉末,mp 228～230℃,HCl—Mg反应阳性。1HNMR(DMSO-d6) δ:1.61(3H,s,CH3),1.73(3H,s,CH3),3.41(2H,d,J=5.9 Hz,1″-H),3.82(3H,s,OCH3),5.16(1H,brs,2″-H),6.28(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),8.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),9.42(1H,s,3-OH),10.70(1H,s,7-OH),12.30(1H,s,5-OH)。13CNMR δ:146.3(C-2),136.0(C-3),176.3(C-4),160.6(C-5),97.9(C-6),161.3(C-7),105.7(C-8),153.6(C-9),103.1(C-10),122.6(C-1′),129.2(C-2′,6′),114.2(C-3′,5′),158.4(C-4′),21.3(C-1″),123.6(C-2″),131.1(C-3″),25.5(C-4″),17.9(C-5″),55.5(OCH3)。
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B-1(淫羊藿苷3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷，icaritin 3-O-α-L-rhamn opyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside):黄色粉末,mp 164～167 ℃,HCl—Mg反应及Molish反应阳性。阴离子ESI-MS m/z:689(M-H)-,513(M-H-C6H8O6)-,366(M-H-C6H8O6-C6H11O4)-。阳离子ESI-MS m/z:691(M+H)+,545(M+H-C6H10O4)+,369(M+H-C6H10O4-C6H8O6)+。1HNMR(DMSO-d6) δ:0.78(3H,d,J=6.0 Hz,CH3),1.59(3H,s,CH3),1.67(3H,s,CH3),3.37(2H,br.s,1″-H),3.85(3H,s,OCH3),5.18(1H,br.s,2″-H),5.20(1H,d,J=7.1 Hz,葡糖醛酸基端基氢),5.27(1H,br.s,鼠李糖基端基氢),6.63(1H,s,6-H),7.12(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.88(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.56(1H,s,5-OH)。13CNMR(DMSO-d6) δ:157.3(C-2),134.7(C-3),178.2(C-4),160.0(C-5),97.9(C-6),162.0(C-7),108.5(C-8),153.1(C-9),105.7(C-10),122.2(C-1′),130.5(C-2′, 6′),114.0(C-3′,5′),159.0(C-4′),21.4(C-1″),122.0(C-2″),131.1(C-3″),25.4(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH3),102.0(R-1),70.3(R-2),70.6(R-3),71.1(R-4),70.0(R-5),17.4(R-6),100.0(G-1),73.0(G-2),75.8(G-3),71.2(G-4),75.3(G-5),170.0(G-6)。R=rhamnopyranosyl;G=glucopyranuronosyl。
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结果
1 胃、小肠、尿及胆汁中代谢产物的分析
图1为给大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后胃提取物的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig 4 h后，在胃提取物中只检测出两个微量的代谢产物W-1(tR:14 min)及W-2(tR:22 min)。
图2为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后小肠提取物的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig 4 h后，在小肠提取物中可检测出两个主要的相关代谢产物，其保留时间分别为I-1:22 min，I-2:42 min。
图3为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后尿的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig后36 h的尿中检测出两个主要代谢产物U-1和U-2，其保留时间分别为U-1:13 min，U-2:42 min。
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图4为大鼠ig淫羊藿苷及生理盐水后胆汁的高效液相色谱图，与生理盐水空白组对照，淫羊藿苷ig后2～8 h的胆汁中检测出两个主要代谢产物B-1和B-2，其保留时间分别为B-1:9 min，B-2:34 min。
Fig 1 HPLC chromatograms for gastric samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). Column: Inersil ODS-2 (5 μm, 4.6 mm×250 mm); flow rate: 1 ml*min-1; UV detection: 360 nm; mobile phase: MeOH—H2O (containing 0.5% acetic acid), 70∶30(0～20 min)→85∶15(20～50 min); injection volume: 20 μl. W-1: Metabolite 1; W-2: Metabolite 2.
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Fig 2 HPLC chromatograms for small intestinal samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1. I-1: Metabolite 1; I-2: Metabolite 2.
Fig 3 HPLC chromatograms for urine samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1, except for mobile phase. Mobile phase: MeOH—H2O (75∶25) for 50 min. U-1: Metabolite 1; U-2: Metabolite 2.
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Fig 4 HPLC chromatograms for bile samples of rats given orally icariin (A) and saline (B). HPLC conditions are the same as shown in Fig 1, except for mobile phase. Mobile phase: MeOH—H2O (containing 0.5% acetic acid), 60∶40(0～15 min)→75∶25(15～60 min). B-1: Metabolite 1; B-2: Metabolite 2.
2 尿及胆汁中代谢产物的分离及结构鉴定
大鼠ig淫羊藿苷200 mg.kg-1，收集尿、胆汁，处理后经Sephadex柱色谱及高效液相色谱分得代谢产物B-1，B-2，U-1及U-2。
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U-1，U-2经与已知化合物的文献1HNMR及13CNMR[12]数据相比较，分别鉴定为淫羊藿次苷II和淫羊藿素。
B-1，黄色粉末，HCl—Mg反应及Molish反应阳性。阴离子ESI-MS示伪分子离子峰689(M-1)-及碎片离子峰513(M-H-C6H8O6)-，366(M-H-C6H8O6-C6H11O4)-1；阳离子ESI-MS示伪分子离子峰691(M+H)+及碎片离子峰545(M+H-C6H10O4)+，369(M+H-C6H10O4-C6H8O6)+。说明B-1由一单位的淫羊藿素，一单位葡糖醛酸基及一单位鼠李糖基组成。1HNMR及13CNMR数据进一步证实了这一结论。B-1的1HNMR光谱在δ 5.20及5.27处示有葡萄吡喃糖醛酸基及鼠李吡喃糖基两端基氢信号，位于低场δ 12.56处的信号为典型的C-5上游离羟基信号，因此两糖基分别连结在B-1的C3-OH及C7-OH上。又采用β-葡糖醛酸酶水解B-1得淫羊藿次苷II，从而证实了β-D-葡糖醛酸基连结在B-1的C7-OH上。
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基于上述数据，B-1鉴定为淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷。
经TLC，HPLC及ESI-MS分析鉴定，U-1，B-2，I-1与W-2为同一物质淫羊藿次苷II；I-2与U-2为同一化合物淫羊藿素。
W-1在HPLC上与对照品淫羊藿次苷I保留时间一致，其ESI-MS给出相应的伪分子离子峰531(M+1)+及碎片离子峰369(M+1-C6H10O5)+，故W-1为淫羊藿次苷I(icariside I)。
综上所述，淫羊藿苷的代谢产物可总结如图5。
R1
R2
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Icariin
α-L-Rhamnopyranosyl
β-D-Glucopyranosyl
Icaritin
H
H
Icariside I
H
β-D-Glucopyranosyl
Icariside II
α-L-Rhamnopyranosyl
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H
Icariside II 7-O-Glc UA
α-L-Rhamnopyranosyl
β-D-Glucopyranuronosyl
Fig 5 Structures of icariin and its metabolites.
讨论
淫羊藿苷在胃中比较稳定，ig后4 h仅检测出微量的淫羊藿次苷I及淫羊藿次苷II，但淫羊藿苷进入肠道后很快发生代谢，转化为淫羊藿次苷II。小肠道中少量的淫羊藿素主要来自胃中淫羊藿次苷I的进一步降解。尿中的代谢产物为相对小分子及低极性的淫羊藿次苷II及淫羊藿素，而胆汁中的代谢产物为以相对大分子量及大极性的淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷为主，仅有少量的淫羊藿次苷II，这些结果提示淫羊藿苷主要的代谢途径为图6。
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Fig 6 The major metabolic route of orally administered icariin in rats.
淫羊藿苷在肠道中降解为淫羊藿次苷II(脱葡萄糖基)，然后吸收进入体内。进入体内的淫羊藿次苷II再在肝脏发生C7-OH葡糖醛酸化。葡糖醛酸化产物通过胆汁排入小肠中，而未被代谢的淫羊藿次苷II通过肾脏排入尿中。原形成分淫羊藿苷仅在胆汁中检测出微量。这一结果说明口服形式的淫羊藿苷很可能是以其代谢产物发挥作用的。
有关文献报道黄酮苷类化合物在肠道中降解成苷元再吸收[10,11]，而淫羊藿苷主要是以它的次级鼠李糖苷形式吸收，这可能与大鼠肠道中降解淫羊藿次苷II的酶或微生物缺乏或作用较弱有关。淫羊藿苷代谢产物的药理活性研究目前正在进行之中。
基金项目： 辽宁省科学技术基金资助项目(971084)
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Tel:(024)23843711-3389 or 3431,E-mail:fengqiu@ihw.com .cn)
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收稿日期: 1998-06-15, http://www.100md.com